TW201248143A - Methods of analyzing plaque - Google Patents

Description

201248143 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於利用毛細管電泳法偵測牙菌斑内 氨、妈和酸之方法。 【先前技術】 發明之背景 在鑛齒的初期發展中，σ腔内某些細菌代謝糖而形 成有機酸產物。這些有機酸中-些包括曱酸、琥拍酸〔 丁酸、丙酸、乙酸和乳酸。產酸菌極接近牙齒表面並且 與表面酸躺而導祕螂㈣解或脫雜。經常性產生 酸並且與珠瑯質接觸時間越久而脫礦化越嚴重而終究 使齲齒病灶更為惡化。牙菌斑經常暴露於蔗糖時特別容 易產生乳酸並且其已顯示係一種對牙齒脫礦化最宝 酸之一。 σ ’然而’並非全部口腔内細菌均能造成齲齒或者損 害。生物群落(bi〇fl〇ra)—類通常在口腔内之齲齒發展和 口腔健康上扮演重要角色。例如，精胺酸和其他鹼性胺 基酸已被建議用於口腔保健並且認為在對抗形成蛀牙 和牙齒敏感上具有顯著效益。已猜測該精胺酸顯著效兴 之重要因素為精胺酸和其他驗性胺基酸可被某種類型 之非致麵菌例如血鏈球菌0如wgw⑷所代謝並且與口 腔内之致鱗菌如變異鏈球菌相互競爭。^ 胺酸溶解菌可利用精胺酸和其他鹼性胺基酸以產生= 3 201248143 高環境p Η之氨而同時中和致齲菌代謝糖所產生之乳酸 而降低牙斑pH以及導致蛀牙之牙齒脫礦化。 欠 在發展用於口腔保健之新組成物和方法中，較佳為 注重於抑制、破壞或降低該造成損害之細菌而非僅注重 殺死全部細菌及/或中和或分散該有害酸之方法。 例如毛細管區帶電泳之毛細管電泳法藉由電荷、磨 擦力和流體動力半徑分開離子物種。在傳統電泳法中， 帶電分析物在電場影響之下移動入導電液體介質内。毛 細管電泳法根據充填電解質之小毛細管内尺寸對電荷 比分開離子。 °7 毛細管電泳法已被用於測量牙菌斑之酸。請看例如

Damen J.J.M·等人 ’ Carzb i?e>searc/2(2002)36 : 53-57。 WO 2009/10〇262(藉由引述併入於此）中揭示牙菌斑内 酸和氨之監控，但是用於氨測量法之血漿診斷套組需耗 時約一週才能完成。此方法亦不適於高速處理用途。 因此，於形成牙菌斑和蛀牙之研究以及於發展新 成物和用於口腔保健之方法中，較佳係一種測量氨+ 或者牙菌斑酸化之簡單、快速、使用容易之有用方生 其容許人們可評估有益活動或者牙g斑内致 ^ 在，以及評估患者疾病狀態及口腔保健組成物 子 有效性。甚者其可更有效地監控σ腔内生，之 型’例如評估最適當治療方法以及監㈣療之類 4 201248143 【發明内容】 發明之摘要 本發明提供一種簡單、容易使用於測量一牙菌斑樣 本内氨及/或鈣和任選酸之方法。該方法有助於改善口 腔保健產品和方法，以及診斷和治療方法之發展效率。 該方法包含獲得一牙菌斑樣本以及利用毛細管電泳法 測量氨及/或鈣和任選酸。例如，在一具體實施例中， 該方法（方法1)之步驟包含： a. 獲得一牙菌斑樣本； b. 以水稀釋該樣本； c. 加熱該樣本使得例如足以殺死細菌並且將離子釋入 溶液内； d. 分離該樣本之液體組分，例如利用離心及/或過濾； e. 將該液體組分結合 i. 可從鈣離子電泳分離鎂之試劑，例如羥異丁酸； ii. 可從銨離子電泳分離鉀離子之試劑，例如18-冠鍵-6， iii. 包含驗化劑例如味吐和酸化劑之緩衝劑，其視 需要可為與錯合試劑i或ii之一相同，例如羥 異丁酸，以將液體緩衝至約pH 4_5，如至約pH 4.3 ； f. 使步驟e之產物通過毛細管，其中毛細管一端和另一 端間之電位足以誘使離子電泳流經該毛細管； 201248143 g.測定已通過至少一部分毛細管之液體組分内銨離子 及/或鈣離子，例如利用紫外或紫外-可見光吸收法、 質譜法、表面增強拉曼光譜(SERS)或其他測定方法。 因此方法1包括下列方法： 1.1方法1，其中步驟a之牙菌斑係獲得自人類患者； 1.2方法1或1.1，其中步驟b之牙菌斑被稀釋至約 0.01-0.1 mg牙菌斑/ml水之濃度，例如約0.03-0.04 mg牙菌斑/ml水； 1.3任何上述方法，其中步驟c，該樣本被加熱至60-95 °C例如約80°C，然後冷卻至低於l〇°C，例如約4 °C ； 1.4任何上述方法》其中在步驟d中’係液體組分係得 自將樣本離心分離、移除因此獲得的上清液，以及 過滤·該上清液， 1.5任何上述方法，其中在步驟e中，可從鈣離子電泳 分離鎂之試劑係選自羥異丁酸、乳酸、丙二酸和酒 石酸； 1.6上述方法，其中在步驟e中，可從鈣離子電泳分離 鎂之試劑係羥異丁酸； 1.7任何上述方法，其中在步驟e中，可從銨離子電泳 分離鉀離子之試劑係選自中性冠醚和環聚果糖； 1.8上述方法，其中在步驟e中，可從銨離子電泳分離 鉀離子之試劑係18-冠醚-6 ; 1.9任何上述方法，其中在步驟e中，該緩衝劑包含有 機驗； 201248143 l.io =何上述方法，其中在步驟e中，該緩衝劑包含味 U1任何上述方法中在步驟e中，該液體部分係社 合心坐(例如約5-7 mM，如約6福）、經異丁酸^ 如約Μ福，如約2.5 _)以及…冠㈣(例如約 2-3 mM，如約 2.5 mM); U2任何上述方法’其中步驟e之產物，約具有阳約 4-5，如約 pH 4.3 ; 1.13任何上述方法，其中在步驟f中該電位為約$ kV ; 1.14任何上述方法，其中在步驟g中’該憤測方法為紫 外-可見光吸收法。 ’、 方法1視需要進一步提供測量牙菌斑樣本内酸之 方法，例如方法1包含利用毛細管電泳法測定牙菌斑樣 本内酸之附加步驟，例如方法丨包含下列附加步驟： h. 將步驟d獲得液體組分分開成第一部分和第二部分； i. 於第一部分上進行步驟e、f和g; j. 結合緩衝劑與第二部分，例如2,6_吡啶二甲酸和十六 烷基二曱基溴化銨’例如至約pH 5-6,如約pH 5.66 ; k. 使前述步驟產物通過毛細管，其中毛細管一端和另 一端間之電位足以誘使離子電泳流經該毛細管； l. 偵測液體内已通過至少一部分該毛細管之酸性陰離 子，例如乳酸鹽、琥珀酸鹽、醋酸鹽及/或丙酸鹽陰 離子如乳酸鹽離子，例如利用紫外或紫外_可見光吸 201248143 收法、質譜法、表面增強拉曼光譜（SERS)或其他測 定方法。 在另一具體實施例中，本發明測定牙菌斑氨產生程 度以測量精胺酸溶解菌之相對數目，以及視需要另外測 定牙菌斑乳酸含量以測量致齲菌之相對數目。 在另一具體實施例中，本發明利用至少一或多種下 列技術，例如述於WO 2009/100262(藉由引述併入於此) 定量至少一精胺酸溶解菌如血鏈球菌以及視需要至少 一致齲菌如變異鏈球菌之濃度： a. 聚合酶鏈‘反應(PCR)，例如定量即時PCR以定性口腔 内例如牙菌斑或唾液之生物群落； b. 反轉錄聚合酶PCR(RT-PCR)以定性口腔内例如牙菌 斑或唾液之生物群落； c. 抗體探針，例如螢光抗體探針被用於定性口腔内例 如牙菌斑或01液之生物群落。 在另一具體實施例中，利用上述其一方法測定取自 病人之牙菌斑樣本，以及據以進行治療。例如，本發明 之方法特別有用於偵測牙菌斑生態學之可能損壞變化 以及於牙齒發生可測得或明顯脫礦化之前進行校正治 療。 本發明因此提供促進口腔健康之方法，例如減少牙 菌斑之積聚；治療、緩解或減少口乾症；潔白牙齒；促 進包括心血管健康之全身健康，例如降低經由口腔組織 8 201248143 之可能全身性感染；免疫牙齒對抗齲齒菌和其效應；清 潔牙齒和口腔及/或減少蛀牙，該方法包含例如利用上 述方法如下文之方法1測量口腔之生叙群落，以及若需 要時投與含有效量鹼性胺基酸或其鹽，例如精胺酸之口 腔保健產品。 本發明進一步提供游離或鹽型鹼性胺基酸之用 途，用於製造可促進病人口腔健康的藥物，該病人當藉 由根據本發明方法例如下文中所述方法1測量時，含有 較高量齲齒菌及/或較高濃度乳酸鹽，.及/或低精胺酸溶 解菌數量及/或低牙菌斑氨產量。 本發明進一步提供一種加強口腔美觀之方法（其中 此類加強美觀包括例如增白牙齒及/或減少口臭），此方 法包含利用本發明如下文所述方法1之方法測量口腔 之生物群落，以及若含有較高量齲齒菌及/或較高濃度 乳酸鹽，及/或低精胺酸溶解菌數量及/或低牙菌斑氨產 量時，則投與游離或鹽型鹼性胺基酸之口腔保健產品。 本發明進一步提供一種用於測定口腔保健組成物 於增強精胺酸溶解菌及視需要抑制致齲齒菌之效率的 方法，包含利用如下文所述方法1測定牙菌斑内氨之濃 度。 發明之詳細說明 牙菌斑轉換精胺酸至氨之能力係一種精胺酸溶解 活性之指標。某些細菌，恰如某些細菌能轉換糖至酸， 具有轉換精胺酸至氨之能力。由於精胺酸溶解菌種不利 201248143 於致齲菌之增生，因此+ 而減少羅患_之危濃度可降低酸性環境 _環境之纟f食用糖可產生有利於產 學轉變成㈣於精胺^天使用_酸可將牙菌斑生態 能中和酸及有助；^ ^解菌之環境。氨係-種驗，其 利於非病原性細中性牙斑阳。中性牙斑PH更有 精胺酸至氨之產量Λ氨測量係根據測定全部細菌轉換 用於評估牙菌斑生板此t法在—些方面因此較優於其他 詳述於下文），、群落之方式，例如即時PCR法（將 無法&辨抑W u、糸測量選定精胺酸溶解菌之濃度並且 :==(活)與不活化(死)· 似值，乳酸亦可^作為測定精胺酸溶解菌濃度之近 測定相同樣本収賴_度之近似值。因此’ 氨和乳酸將極為有趣。 帶常t毛細泳法之主要分離模式包括毛細管區 帶電泳法、撒颇_ ± _ 、、、胗束電動毛細管層析法(MECC)、毛細管 法(CI^^法、毛細管凝膠電泳法，以及毛細管等電聚焦 區帶F)i在一特定具體實施例中，本發明使用毛細管 二電永法。通常’該毛細管内之流動係從陽極至陰 ’θ因此陰極易較電滲壓流快速移行通過該毛細管，同 ^陽極巧^電荷所阻缓而通過較為缓慢。利用與另一離 更易複σ之離子的較大化合物可分離具有類似電荷 大二、之分析物，因而可被分離。 移率例如]在味嗅分析物系統内钟和氨具有類似電泳遷 ;:。其可破分離，然而，當加入冠醚如18_冠醚_6或 201248143 環聚果糖時。此類化合物形成與鉀之複合物而增加其體 積並且減緩其遷移時間。此造成氨和鉀之兩種不同遷移 時間而可鑑別其尖峰和氨之定量。 鈣和鎂亦可與弱偶合劑例如羥異丁酸(HIBA)共遷 移而使這些離子被分離。同樣，HIBA可改變鈉和鈣之 遷移順序。當無HIBA加入時，鈉於鈣之前被遷移。當 該複合劑之加入順序相反時，其缺點為先被遷移之高濃 度鈉會覆蓋鈣峰而不易測得鈣峰。請看第1圖之電泳 圖。因此，此亦為一種從口腔保健產品傳遞鈣，或，反 之若脫礦化作用中失去牙齒鈣時用於偵測之有用工具 和方法。 在一具體實施例中，該用於毛細管電泳法中分析銨 和鈣濃度之缓衝系統包含咪唑、羥異丁基，以及18-冠 趟-6。此系統因此包括兩種複合劑以最佳化和分離遷移 峰。 【實施方式】 實例1 :牙菌斑内之錄和約 從前一晚不進食或飲水之受試對象於早晨不刷牙 之下採集牙菌斑。以10%蔗糖溶液漱口 2分鐘。於8分 鐘之後，以牙鏟收集牙表面之牙菌斑。於冰上將牙菌斑 樣本收集入預稱重試管内，然後測定牙菌斑重量。利用 超純水將其濃度標準化。將牙菌斑稀釋至約0.03-0.04 mg牙菌斑/mL水之終濃度，然後於4°C於水中離心30 201248143 秒。將牙菌斑攪拌入溶液内，接著在8(TC加熱5分鐘 以殺死細菌及將離子釋入溶液内。然後於冰/水浴内將 該牙菌斑另外放置5分鐘。接著在4。(：將該牙菌斑溶液 於13,000 rpm離心15分鐘。迅速移除上清液及以0.2 微米尼龍離心濾器在4°C於12,000 rpm之下過濾3分 鐘。然後藉由毛細管電泳法分析該上清液，或儲存於_8〇 °C。用於毛細管電泳法分析之緩衝系統為l〇mM咪唑、 6.0 mM 羥異 丁酸、2.5 mM 18-冠醚-6，pH 4.3。 第1圖係利用此方法於糖刺激後之毛細管電泳法 分析的一實例。 實例2 :牙菌斑内之酸 如實例1令之方法製備牙菌斑樣本。所使用緩衝系 統之差異為：20 mM 2,6-吡啶二曱酸和〇.5 mM十六烧 基三曱基溴化銨’ pH 5.66。第2圖係利用此方法於糖 刺激後之毛細管電泳法分析和對照牙菌斑的一實例。 除了測量牙菌斑内乳酸之外，此方法亦測定牙菌斑 内之琥珀酸、醋酸和丙酸。這些有機酸對齲齒過程以及 其後病灶形成而言亦屬重要。由於有機酸具有低或無紫 外線(UV)吸收度，因此利用2,6-吡啶二曱酸作為背景電 解質(BGE)完成偵測。在此直接偵測法中，該BGE具有 強UV吸收性及於UV偵測器中可產生高背景吸收度。 在無非吸收分析物中，該背景訊號為常數。當導入離子 分析物時，以電荷-對-電荷基礎上更換UV吸收添加物 離子可產生相對高UV吸收度基線之負峰值。此分析 12 201248143 中，藉由施予10秒於0.5 psi之壓力注入該樣本。該分 離進行於25 kV以及毛細管係於25°C恒溫。選擇254 nm 用於直接UV偵測之波長，以及逆轉該具有負峰值之訊 號而獲付更熟悉電泳圖以便整合及處理。為校正注入錯 誤，各樣本併入1.5 mM硝酸鈉内部標準進行操作，以 及利用乳酸鈉標準建構一標準曲線(Sigma，美國密蘇里 州St. Louis市）。根據峰面積比例（乳酸鹽/硝酸鹽）以及 最初牙菌斑重量，測定牙菌斑樣本内乳酸鹽之濃度。 亦進行一項臨床研究以測試此方法之有效性。該試 驗之目的為藉由暴露於一已知制酸劑氯己定 (chlorhexidine)評估牙菌斑樣本中所產生酸之測定方 法。此試驗係一種單元設計。試驗中納入6位符合選取 /排除標準之受試對象。參加之後，受試對象使用一週 的高露潔MaxFresh。沖淡期之後，受試對象以水沖洗 30秒作為基線測定值。經過30分鐘之後，受試對象以 10%廉糖溶液洗》條2分鐘，接著於8分鐘後採集牙菌 斑。於48小時之後，再採集一次牙菌斑然後以氣己定 將口腔再洗滌30秒。經過30分鐘之後，以1〇%蔗糖溶 液洗滌2分鐘，接著於8分鐘後採集牙菌斑。於24小 時内重複此過程。結果顯示經氯己定洗滌者之牙菌斑内 有較少乳酸鹽產生（第1組為p=： 0.002以及第2组為 p=0.05)。結果證明此方法可用於測定乳酸鹽之產生以及 其可被用作為酸產生之指標。 201248143 【圖式簡單說明】 第1圖係牙菌斑樣本於糖刺激後測得陽離子如銨 和鈣之UV吸收光譜。 第2圖係牙菌斑樣本於糖刺激後和對照組所測得 酸陰離子之UV吸收光譜。 【主要元件符號說明】 無 14

Claims (1)

1. 201248143 七、申請專利範圍： 1. 一種測定牙菌斑樣本内之氨及/或妈之方法，包含獲得 該樣本以及利用毛細管電泳法測定牙菌斑内之銨和妈 離子。 2. 如申請專利範圍苐1項之方法，包含下列步驟 a. 獲得牙菌斑樣本； b. 以水稀釋該樣本， c. 加熱該樣本直到足以殺死細菌並且將離子釋入溶液 内； d. 分離該樣本之液體組分； e. 將該液體組分與下列合併 i. 可從妈離子電泳分離鎂之試劑； ii. 可從銨離子電泳分離鉀離子之試劑； iii. 包含驗化劑和酸化劑之緩衝劑，其視需要可與容 許離子分離之試劑i或ii之一相同； f. 使步驟e之產物通過毛細管，其中毛細管一端和另 一端間之電位足以誘使離子電泳流經該毛細管； g. 測定已通過至少一部分毛細管之液體内的銨離子及 /或鈣離子。 3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中在步驟b中牙菌 斑被稀釋至濃度約0.01-0.1 mg牙菌斑/mL水。 4. 如申請專利範圍第2-3項中任一項之方法，其中步驟c 之樣本被加熱至60-95°C。 15 201248143 5. 如申請專利範圍第2·4項中任一 ，…可從約離子分離鎂離子之試劑传選自、 酸、乳酸、丙酸及酒石酸。 训糸選自羥異丁 6. 如申請專利範圍第5項之方半，使士 + μ 從觸子分_軒之係鋪了/驟e _ 可

   ，其令在步 選自中性冠 如申請專利範圍第2-6項中任一項之方法 驟e十，可從録離子分離鉀離子之試劑係 醚和環聚果糖。 8. 專利範圍第2_7射任一項之方法，其中在步 驟e中’可賴離子分離鉀離子之試劑係18_冠料。 9. 如申請專利範圍第2_8項中任一項之方法，立中在牛 驟e中，該液體部分係結合味哇、經異丁酸以及^_ 冠鱗-6。 10. 如申請專利範圍第W之方法，其進一步包含利用毛 細管電泳法測定牙菌斑樣本内之酸。 11. 一種測量牙菌斑内的精胺酸溶解菌之相對數目之方 法:包括利用如申請專利範圍第！項之方法測定牙菌 斑氨產生程度，以及視需要另外測定牙菌斑乳酸含量 以測量致齲菌之相對數目的方法。 12. —種促進口腔健康以減少牙菌斑之積聚、治療、緩解 或減少口乾症、潔白牙齒、促進包括心血管健康之全 身健康、免疫牙齒對抗齲齒菌和其效應、清潔牙齒和 201248143 口腔及/或減少蛀牙之方法，該方法包含藉由如申請專 利範圍第1項之方法測量病人之牙菌斑氨濃度，以及 若需要時投與含有效量鹼性胺基酸或其鹽之口腔保健 產品。 . ...一_—...........— 13. —種測定口腔保健組成物於促進精胺酸溶解菌以及視 需要抑制致齲菌之效力的方法，包含利用如申請專利 範圍第1項之方法測定牙菌斑内之錄濃度。 17