CN110382706A - 用于评估生物膜中口腔护理组合物效果的钙荧光探针 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种定量生物膜中的钙的方法，该方法是评估口腔护理组合物的功效以帮助抑制生物膜形成或帮助破坏生物膜的有效方式。

Description

用于评估生物膜中口腔护理组合物效果的钙荧光探针
技术领域
本公开涉及用于评估口腔护理组合物的功效以帮助抑制生物膜形成或帮助破坏生物膜的方法。
背景技术
通常已经描述了用于定量口腔护理组合物(例如牙膏、漱口水等)在从生物膜测试表面分离细胞或抑制或延缓细胞在测试表面上积聚的功效的方法。另外，荧光探针和共焦激光扫描显微镜(CLSM)通常已经用于研究生物膜。牙斑为细菌生物膜的一个示例。牙斑形成牙垢并且与口腔疾病(诸如龋齿和牙周病(例如齿龈炎和牙周炎))相关联。牙斑可产生由来自可发酵糖的细菌降解的酸造成的龋齿。因此，牙斑控制和移除是重要的并且是许多口腔护理产品和方案的目标。因此，通常持续需要进一步理解牙斑形成的机制，并且设计控制或移除牙斑的口腔护理组合物。
牙斑形成的一种此类机制是钙离子的作用。细菌和生物膜是带负电荷的，牙齿也是。因此理论上，考虑到对负电荷的排斥，细菌不应粘在牙齿上。然而，唾液中带正电荷的钙离子掩盖这些负电荷，从而允许细菌与牙齿表面紧密接触。然后，在非常小的距离(例如，范德瓦尔斯力)下工作的更强吸引力的表面力变得更有影响，从而允许细菌附着在牙齿表面上并在其上繁殖，从而有助于形成牙斑。在菌斑中，细菌将继续繁殖，分泌来自糖降解的酸，并且在菌斑形成的正反馈回路中浓缩钙。菌斑中钙的量比唾液中钙的量大两至三倍。
用于抑制牙斑形成的一种解决方法是在口腔护理组合物中使用钙粘结剂。这些钙粘结剂用于置换来自细菌生物膜的有害钙，因为粘结剂对钙具有比结合生物膜中钙的那些力更强的结合力。口腔护理组合物可被更好地设计来置换这些钙离子，以便帮助破坏或减少生物膜。所面临的挑战是钙离子从生物膜内的位移，而不是通过从牙齿结构中移除钙离子而使牙齿脱矿质。另一种方法是使用研磨剂。例如，可包括研磨剂作为牙膏的一部分，并且通过用牙膏进行刷牙动作，牙斑可被物理地破坏。又一种方法是使用抗微生物剂来抑制可有助于形成牙斑的细菌的存在。然而，仍然需要改善的活性物质或改善的用于活性物质递送的制剂，或通常抑制或破坏生物膜形成的改善的口腔护理组合物。因此，需要定量生物膜中的钙以便评估口腔护理组合物抑制生物膜形成或破坏生物膜的功效的方法。
发明内容
本发明通过提供定量生物膜中的钙的方法来解决这些需要中的至少一种，所述方法包括以下步骤：用口腔护理组合物任选地处理、优选地处理所述生物膜；用生物膜荧光探针标记任选地处理的生物膜；用钙荧光探针标记任选地处理的生物膜；以及通过例如共焦激光扫描显微术测量从所述标记细胞发射的荧光来定量所述标记细胞。优选地，生物膜荧光探针选自微生物荧光探针、胞外聚合物(“EPS”)荧光探针，或它们的组合。优选地，所述口腔护理组合物包含钙粘结剂(例如，钙螯合剂)。
本发明的另一方面提供试剂盒，所述试剂盒包括：生物膜荧光探针；钙荧光探针；以及任选地用于生物膜中的使用说明书。
本发明部分地基于令人惊讶的发现，即钙探针可用于定量生物膜中的钙离子。
本发明方法的一个优点在于钙和微生物/EPS探针以不同的激发/发射波长发荧光，并且这样可测定生物膜的细菌中的探针的荧光强度和共定位。
本发明的另一个优点在于所述方法可用于鉴定更有效的口腔护理组合物以置换生物膜或生物膜形成中的钙。
本发明的又一个优点在于允许在牙齿生物膜的不同深度处研究钙而不损害生物膜的天然结构。
本发明的又一个优点在于所述方法可用于向消费者和牙科专业人员展示口腔组合物在生物膜或生物膜形成中如何置换钙。
对于本领域的技术人员而言，通过阅读本公开，特定实施方案的这些和其它特征、方面和优点将变得显而易见。
附图说明
图中列出的实施方案是例示性的，并不旨在限制由权利要求书限定的本发明。当结合以下附图阅读时，能够理解对以下例示性实施方案的具体实施方式，其中用类似的附图标号表示类似的结构，并且其中：
图1为附接有羟基磷灰石盘的口腔夹板的透视图；
图2为其中具有凹槽的羟基磷灰石盘的透视图；
图3为其中具有生物膜的凹槽的示意性剖视图；
具体实施方式
以下文字列出了本公开的多个不同实施方案的广义说明。说明被理解为仅是示例性的，并非描述每一种可能的实施方案，因为描述每一种可能的实施方案即使可能也是不切实际的。应当理解，本文所述的任何特征、特性、组分、组成、成分、产品、步骤或方法均可被删掉、整个或部分地与本文所述的任何其它特征、特性、组分、组成、成分、产品、步骤或方法相组合或由后者取代。可使用当前技术或在本专利的申请日期之后开发的技术来实施众多另选的实施方案，该另选的实施方案将仍然落入本权利要求书的范围内。
本公开的一个方面涉及定量生物膜的钙的方法，该方法包括以下步骤：用口腔护理组合物任选地处理、优选地处理生物膜；用生物膜荧光探针标记任选地处理的生物膜；用钙荧光探针标记任选地处理的生物膜；通过测量从标记生物膜发射的荧光来定量标记生物膜并且通过例如共焦激光扫描显微镜(CLSM)测量从所限定的生物膜区域内的标记钙离子发射的荧光来定量钙离子。这些步骤无需按任何特定顺序进行。
用口腔护理组合物处理生物膜
术语“生物膜”是指附着在表面上的(一个或多个)细胞层。生物膜可为细菌生物膜，其包括活的微生物细胞和正在生长的微生物细胞两者以及死的微生物细胞。生物膜可由一种细胞类型构成，或者其可由两种或更多种细胞类型构成，例如为多物种细菌群落的生物膜复合物。一种具体类型的生物膜为“牙齿生物膜”(也称为“菌斑生物膜”，本文可互换使用)，其为通常在人口腔中的牙齿表面上形成的生物膜)。菌斑生物膜中的细菌具有显著不同的生理特性，例如增加的对洗涤剂和抗生素的抗性，从而使得生物膜研究非常重要。口腔细菌物种的非限制性列表描述于美国专利6,309,835B1，第7栏，第12-30行。在很多情况下这些附着的微生物细胞嵌入胞外聚合物(EPS)的自产基质中。EPS为微生物来源的生物聚合物，其中嵌入有生物膜微生物。J.Bacteriol.2007,189(22):7945.生物膜胞外聚合物通常为由钙、胞外DNA、蛋白质和多糖构成的聚合物聚集体。生物膜可为体外生物膜或原位生物膜。优选地，生物膜为原位菌斑生物膜，因为其通过提供天然且未分布的生物膜更精确地反映人口腔的状况。很适合在限定的时间段内定量生物膜中的钙的一种方法是使用原位菌斑生物膜。
设想了生物膜可附着的多个不同的表面。这些表面可包括例如人牙釉质、牛牙釉质、牛牙质、羟基磷灰石、抛光玻璃和钛。考虑到基底的表面的粗糙度及其游离能量是菌斑生物膜的原位生长的重要因素。牙釉质或羟基磷灰石是模拟用于菌斑生物膜的生长的天然基底的优选表面。另一方面，由于牙釉质的自动荧光，羟基磷灰石更优选地用于菌斑生物膜的原位生长。羟基磷灰石，也称为羟基磷灰石，(“HA”)为矿物形式的钙磷灰石，通常具有式Ca10(PO4)6(OH)2。在一个特别优选的方法中，使用包含HA的片(例如，小盘)。这些HA片相对较小，优选地具有7mm3至110mm3，优选25mm3至35mm3的总体积。HA片被设计成具有多个凹槽(以允许菌斑生物膜附着在凹槽的内侧)。为了阐明，原位或体外菌斑生物膜可用于附着在(一个或多个)凹槽的内侧，但原位菌斑生物膜是优选的。多个凹槽的尺寸优选地为50um至500um深以及50um至500um宽，更优选地100um至400um深以及100um至400um宽，甚至更优选地，凹槽中的至少一个为250um至350um深以及250um至350um宽。不受理论的束缚，许多人类受试者不关心具有口腔器具(包含这些HA片)超过两到三天。在凹槽小于这些尺寸的情况下，凹槽填充有原位菌斑生物膜，从而不允许受试者口腔护理组合物和/或荧光探针渗透到凹槽中。另一方面，如果凹槽的尺寸太大，则凹槽不能很好地适合生物膜生长或附着，尤其是在人类受试者仅将佩戴口腔器具两到三天的情况下。此外，这些优选地的凹槽尺寸通过常规CLSM提供最佳横截面视图。在具体示例中，并且转向图2，HA盘(201)具有三个平行的凹槽(203)(两侧的凹槽(203a和203c)为300um宽和300um深；而中间凹槽(203b)(在两侧凹槽之间)为500um宽和500um深)。中间凹槽被设计成比两侧的凹槽更宽且更深，使得HA盘可更容易地分成两个相同的半盘，以用于头对头比较目的。图3为其中具有生物膜(2005)的凹槽(2003)的示意性剖视图。
优选地，原位菌斑生物膜附着到HA片的表面，这是由于HA片附接到由人类受试者佩戴的口腔器具(例如，口腔夹板或口腔件)一段限定的时间。该限定的时间段优选地为6小时至4天，更优选地为1天至3天，或者为约2天。因此，该方法可包括使人类受试者佩戴口腔器具6小时至4天，优选地1-3天，更优选地2天的步骤；其中口腔器具的至少一部分包含HA作为生物膜的表面，并且其中生物膜为原位菌斑生物膜。术语“口腔器具”是指可暂时佩戴在人类受试者的口腔(即，口)内一次多至多天(但在进食或口腔卫生等期间暂时移除)的装置。口腔器具的非限制性示例包括口腔夹板、口腔件和保持器。口腔器具优选地具有可释放地附接到其上的多个包含HA的片(例如，小盘)。换句话讲，人类受试者佩戴口腔器具以便允许生物膜附着/生长到HA盘的表面和凹槽。在6小时至4天，优选地2-3天，更优选地2天之后，HA盘被由人类受检者佩戴的口腔器具移除。图1为夹板(1)的示例，该夹板具有可释放地附接到夹板的多个HA盘(2a，2b，2c，2d)。夹板(1)在人类受试者(未示出)的牙齿上佩戴限定的时间段，目的是使生物膜生长/附着到HA盘，优选地在HA盘的凹槽中。在图1中，多个HA盘位于口腔申请人的牙间颊侧上。虽然图1中未示出，HA片的优选位置位于器具的舌侧上。不受理论的束缚，舌侧甚至更难以刷牙，从而提供可能较厚(即，比口腔中的其他位置更快地生长或形成)的原位菌斑生物膜。此外，还有一种建议是，由舌侧产生的原位菌斑生物膜可能具有更大的毒性或致病性。
生物膜可用口腔护理组合物在体内或离体处理。“体内”是指在生物体内，具体地在人类受试者的口腔内发生的那些。例如，在使用口腔护理组合物时，人类受试者可佩戴口腔夹板(和可释放地附接到其上的HA盘)。“离体”是指在生物体外部，具体地在人类受试者的口腔外部发生的那些。例如，在夹板被佩戴之后，HA盘可被移除，并且随后用受试者口腔护理组合物处理。当定量生物膜中的钙或定量生物膜中的钙保留量(例如，单种或多种口腔护理产品/组合物用途)时，这种离体方法是优选的。
口腔护理组合物可为被设计成主要用于人类口腔卫生的任何组合物。术语“口腔护理组合物”可为单一成分(例如钙粘结剂)或具有多种成分的制剂。口腔护理组合物不仅可在成分方面变化，而且可在这些成分的浓度方面变化。优选地，(一种或多种)这些成分可安全地用于人的口腔中。口腔护理组合物的非限制性示例可包括洁齿剂、牙膏、漱口水、免洗型凝胶、凝胶等，或它们的组合。
口腔护理组合物优选地包括钙粘结剂用于：(i)预防或减轻牙齿生物膜的形成；(ii)破坏现有的牙齿生物膜；(iii)防止或减轻进一步的生物膜生长；或(v)它们的组合。口腔护理组合物可包括多于一种的钙粘结剂。钙粘结剂通过螯合、粘结、移除、沉淀或以其他方式置换钙。钙粘结剂的一个示例为碳酸氢钠(即，烘焙苏打)或乙二胺四乙酸(EDTA)。此类口腔护理组合物通常可包含按所述组合物的重量计0.0025％至75％的离子粘结剂。口腔护理产品可另外包括研磨剂以帮助物理破坏牙齿生物膜。一个示例是在牙膏中是硅酸盐或碳酸钠的研磨剂。口腔护理产品可另外包括抗微生物剂，该抗微生物剂帮助减轻有助于牙齿生物膜形成的细菌的生长或存在。抗微生物剂的示例是锌或锌盐(例如氯化锌)。口腔护理产品可另外包括研磨剂和抗微生物剂两者。
在另选的实施方案中，生物膜附接到哺乳动物(例如，人或牛)牙釉质表面的测试片。即，牙釉质片经受相对较长期的研究(例如，5-21天)。这些片也可被可释放地附接到口腔护理器具并由人类受试者佩戴。该原位方法可用于评估口腔护理组合物对以下的影响：生物膜中的钙水平和/或生物膜形成和/或生物膜破坏。
该方法可包括用口腔护理组合物处理生物膜持续处理接触时间：1秒、3秒、5秒、10秒、30秒或45秒；或1分钟、2分钟、3分钟、4分钟或5分钟；或5分钟、10分钟、30分钟、60分钟、120分钟；或1至2天；或3秒至48小时；优选地1分钟至3分钟；或它们的组合。
用微生物和/或EPS荧光探针标记生物膜
生物膜用生物膜荧光探针标记。优选地，生物膜荧光探针选自微生物荧光探针、胞外聚合物(“EPS”)荧光探针，或它们的组合。“微生物荧光探针”是指与生物膜的微生物粘结并以一定波长发射荧光的荧光探针。一类此类探针包括荧光标记的寡核苷酸，优选地rRNA指导的寡核苷酸。非限制性示例包括SYTOTM品牌染料。一个具体示例是9绿色荧光核酸染色剂，其中激发为485(DNA)和486(RNA)，并且光发射在498(DNA)和501(RNA)处检测到。另外，另一个具体示例是40蓝色荧光核酸染色剂，其中激发为420(DNA)，并且光发射在441(DNA)处检测到。使用该染色剂与钙荧光探针的有益效果是不同的光发射波长允许它们同时用于相同的生物膜样品中。同样在这类rRNA指导的寡核苷酸染料中，亚类染料可用于区分死的微生物或活的微生物。即，微生物荧光探针可包括对活细菌特异的第一探针和对死细菌特异的第二探针。“胞外聚合物(“EPS”)荧光探针”是指与生物膜的胞外聚合物粘结并以一定波长发射荧光的荧光探针。一类EPS荧光探针包括荧光标记的凝集素。术语“荧光标记的凝集素”还包括凝集素衍生物。使用EPS荧光探针的一个优点是避免需要从生物膜的其他组分纯化EPS以理解口腔护理组合物对包含在生物膜的EPS部分中的钙离子的影响。实际上，据报道，除了生物膜的其他组分(诸如细胞)之外，通常难以纯化EPS基质组分。J.Bacteriol.2007,189(22):7945.可商购获得的微生物荧光探针示例是MolecularProbesTM BacLightTM；并且EPS荧光探针是MolecularProbesTMConcanavalin ATM,Alexa 594缀合物荧光染色剂。还参见美国专利6,309,835B1，第8栏，表1。利用微生物荧光探针的一种方法是评估研磨剂和/或抗微生物剂对牙齿生物膜的有效性。这些微生物和/或EPS荧光探针可广泛获得以及是在如何使用它们定量测定微生物和/或EPS的量以及定量测定这些微生物的哪一部分是活的或死的方面的程序细节。
在一个示例中，生物膜荧光探针是微生物荧光探针，其中该方法还包括通过测量从标记微生物生物膜发射的荧光来限定生物膜的微生物区域的步骤。换句话讲，该方法能够对生物膜内的微生物进行定位或空间限定。该测量可在或不考虑荧光强度的情况下进行。执行此类测量的一个优选的仪器是共焦激光扫描显微镜(CLSM)。如下文进一步详细讨论，优选地，该方法还包括在生物膜的微生物限定区域内定量标记钙的步骤(即，共定位)。
在另一个示例中，生物膜荧光探针是EPS荧光探针，其中该方法还包括通过测量从标记EPS生物膜发射的荧光来限定生物膜的EPS区域的步骤。换句话讲，该方法能够对生物膜内的EPS进行定位或空间限定。该测量可在或不考虑荧光强度的情况下进行。执行此类测量的一个优选的仪器是共焦激光扫描显微镜(CLSM)。如下文进一步详细讨论，优选地，该方法还包括在生物膜的EPS限定区域内定量标记钙的步骤(即，共定位)。
在又一个示例中，该方法利用微生物荧光探针和EPS荧光探针的组合。
受试者生物膜通常与微生物和/或EPS探针在暗处温育15分钟-60分钟，优选地30分钟，并且根据微生物和/或EPS探针或相关文献/专利参考文献的说明书，激发光以一定波长提供给温育的生物膜。根据这些说明书和参考文献，确定光发射检测的波长以及在如何使用微生物和/或EPS探针方面的程序细节。
用钙荧光探针标记生物膜
生物膜用钙荧光探针标记。适于标记生物膜的钙荧光探针的示例可以是下列化合物中的任何一种或多种：
(a)Fluo-3TM、AMTM、细胞渗透荧光染色剂；
(b)Fluo-3TM、五钾盐、细胞不渗透荧光染色剂；
(c)Fluo-4TM、AMTM、细胞渗透荧光染色剂；
(d)Fluo-4TM、五钾盐、细胞不渗透荧光染色剂；
(e)Fluo-4 DirectTM钙测定试剂盒；
(f)Mag-Fluo-4TM、四钾盐、细胞不渗透荧光染色剂；并且
(g)Fluo-5FTM、AMTM、细胞渗透荧光染色剂。
这些探针中的一者或多者可购自ThermoFisher Scientific Company,Waltham,MA。
受试者生物膜通常与钙探针在暗处温育15分钟-60分钟，优选地30分钟，并且根据钙探针或相关文献/专利参考文献的说明书，激发光以一定波长提供给温育的生物膜。根据这些说明书和参考文献，确定光发射检测的波长以及在如何使用钙探针方面的程序细节。
通过测量发射的荧光来定量标记钙或标记生物膜
本发明的方法包括通过测量从相应的(一个或多个)荧光探针发射的荧光来定量标记钙和标记生物膜的步骤。定量还可包括评估生物膜的限定区域中的荧光强度。执行此类定量的一个优选的仪器是共焦激光扫描显微镜(CLSM)。可商购获得的软件能够从拍摄的图像定量像素的荧光。三维图像可由标记钙/生物膜的拍摄的多个单个图像构造而成。
实施例
提供关于两种含碳酸氢钠溶液(一种可商购获得的含碳酸氢钠的牙膏和阴性对照物)的生物膜中的钙/EPS和生物膜厚度的荧光强度比的数据。首先描述方法。
描述用于生物膜生长的基底。羟基磷灰石(“HA”)盘用于生物膜的原位生长。HA盘被设计成在每个盘中具有三个平行的凹槽(对于两个侧面的凹槽为300um宽，300um深，而对于中间凹槽为500um宽，500um深)。当将盘附接到受试者的口腔，保持这些凹槽垂直，以模拟牙齿之间的邻间间隙，菌斑积聚的难以清洁的区域时，该模型允许从凹槽收集未被扰动的天然生长的菌斑生物膜。HA盘由Shanghai Bei’erkang biomedicine limited company制造。
描述佩戴夹板的人类受试者。每个受试者在夹板上多至佩戴12个HA盘，以确保48小时后至少9个HA盘可用。图1中示出此类夹板和HA盘的非限制性示例。装置(1)保持多个HA盘(2a-2d)。尽管未在图1中示出，但是盘可被定位成使得后退位于牙齿之间的牙间空间中(因为该位置易于出现菌斑(鉴于清洁困难等))。受试者仅在进餐期间取出夹板(夹板储存在潮湿条件下的不透明容器中)并执行口腔卫生程序。紧接着，夹板再次磨损。要求受试者在饮用时使用吸管。
描述原位生物膜从HA盘释放的程序。所有HA盘在48小时后通过镊子从夹板移除。使用镊子以保持HA盘的边缘并将HA盘转移到容纳PBS(磷酸盐缓冲盐水)溶液的2ml离心管中。在每次盘转移之前将镊子彻底清洗(水；75％酒精；以及然后去离子水)。
描述PBS溶液的制备。在250ml烧杯中将一种磷酸盐缓冲盐水片剂(购自Sigma-Aldrich Corp.,MO,USA)加入到200克去离子水中。在充分搅拌之后，在使用之前将溶液在4℃下储存多至30天。
描述两种碳酸氢钠溶液的制备。在200ml烧杯中将20克和60克碳酸氢钠(批号KBAKR08，购自Beijing InnoChem Science&Technology Co.,Ltd.)分别加入到去离子水中至100克的最终重量。然后将混合物充分搅拌。溶液在使用之前立即制备或在使用之前最多一天制备，并且在4℃下储存。
描述牙膏上清液的制备。在100ml烧杯中将15克去离子水加入到5克牙膏中。在充分搅拌之后，将混合物以11,000×g离心20分钟。上清液在使用之前立即制备或在使用之前最多一天制备，并且在4℃下储存。
在将HA盘从夹板中移除之后，盘用于通过不同的碳酸氢钠溶液和口腔护理组合物进行的离体处理。在用受试者溶液/上清液处理并用微生物/EPS荧光探针和钙荧光探针标记之后，通过共焦激光扫描显微镜(CLSM)测量凹槽中的生物膜。
描述盘制备。HA盘在PBS溶液中冲洗，并且将每个HA盘通过镊子分成两半。此后，将每个半盘样本静态置于500ul-1000ul的PBS溶液中1分钟。通过PBS溶液、碳酸氢钠溶液或牙膏上清液处理每个样本2分钟。通过用镊子保持每个盘来清洗每个样本，在1ml的PBS溶液中来回摇动十轮。重复该洗涤循环。然后将每个样本静态浸入500ul-1000ul PBS溶液中5分钟。
描述荧光染色和显微术。荧光标记钙探针是在结合Ca2+时表现出荧光增加的分子。Fluo-3TM用于对Ca2+信号传导的空间动态进行成像。生物膜可用AMTM酯形式的钙探针通过将溶解的探针直接加入到生物膜来处理。Fluo-3TM、AMTM、细胞渗透荧光探针可用于使用共焦显微术、流式细胞术和微板筛选应用(吸收/发射最大值～506/526nm)来进行细胞内和细胞外钙染色。据报道，Concanavalin ATM(Con A)、594缀合物是生物膜的染色EPS的可靠替代方案。Con A的Alexa594缀合物显示出Alexa594染料的明亮的红色荧光(吸收/发射最大值～590/617nm)。ConcanavalinAlexa594缀合物选择性地结合到α-吡喃甘露和α-吡喃葡萄糖基残基，所述残基富含生物膜的EPS部分。在处理和浸泡之后，每个半盘样本在暗处用Fluo-3TM、AMTM、细胞渗透荧光探针和ConcanavalinATM、Alexa594缀合物探针(包含5uM Fluo-3TM+5uM Con-ATM)的染料混合物溶液染色30分钟。在染色之后，将每个样本静态浸入500ul-1000ul PBS溶液中2分钟。通过用镊子保持每个盘，在1ml PBS溶液中来回摇动五轮来再次洗涤样本，并重复。对于Fluo-3/Con-A染料共染色样品，使用以下参数：λex＝488nm/561nm、λem＝526/617nm、20X物镜，并且从盘表面细菌的底部扫描60um深，其中步长为3um。尽管未示出，但另一半盘可在暗处用L7012染料溶液(包含5uM Syto-9+30uM碘化丙啶)染色15分钟，作为用于评估杀菌功效的对照。对于L7012 LIVE/染料染色的样品，使用以下参数：λex＝488nm、λem＝500/635nm、20X物镜，并且从表面细菌的底部扫描60um深，其中步长为3um。
描述共焦激光扫描显微术(CLSM)。使用LeicaTMTCS SP8 AOBS光谱共焦显微镜(购自Leica Mikroskopie GmbH,Wetzlar,Germany)。共聚焦系统由LeicaTMDM6000B立式显微镜和LeicaTMDMIRE2竖式显微镜组成。立式支架用于涉及滑动安装样品的应用；而具有37℃温育室和CO2富集附件的竖式支架提供活细胞应用。显微镜共用一个可更换的激光扫描头，并且除了它们自己的电动机驱动平台外，还有一个电流计驱动的高精度Z平台，这有利于在焦平面(Z)中快速成像。除了落射荧光外，显微镜还支持多种透射光对比度方法，包括明视场、偏振光和微分干涉对比度，并配备有5x、20x、40x、63x(油和干)和100x(油)LeicaTM物镜镜头。
描述了激光扫描和检测系统。TCS SP8 AOBS共焦激光扫描系统(购自LeicaLasertechnik GmbH,Heidelberg,Germany)供应有四个激光器(一个二极管、一个氩气和两个氦氖激光器)，因此允许激发电磁波谱的UV、可见和远红外范围内的各种荧光染料。激光扫描头的设计(包括声光可调谐滤波器(AOTF)、声光分束器(AOBS)和四棱镜分光光度计探测器)允许同时激发和检测三种荧光染料。立式显微镜还具有透射光探测器，使得可在荧光记录时覆盖透射光图像。
使用LeicaTMConfocal软件LAS AF3.3.0。共焦经由配备有双显示器和运行LeicaTMConfocal软件的标准PentiumPC进行控制。Leica Confocal软件LAS AF3.3.0(购自Leica Lasertechnik GmbH,Heidelberg,Germany)为多维图像系列采集、处理和分析提供界面，包括3D重建和测量、生理记录和分析、延时、荧光染料共定位、光漂白技术，诸如FRAP和FRET、光谱混合和多色修复。关于图像分析，选择Fluo-3TM/Con-ATM荧光通道以定量绿色像素(钙)与红色像素(EPS)的荧光强度比，并且选择Con-ATM荧光通道以测量生物膜厚度。
转到表1，针对两种含碳酸氢钠溶液(一种可商购获得的含碳酸氢钠的牙膏和阴性对照物)提供原位菌斑生物膜内的Ca/EPS和平均生物膜厚度的荧光强度比。使用先前所述的方法。首先用受试者口腔护理组合物处理生物膜，并且然后用EPS和钙探针标记经处理的生物膜。使用软件，给出绿色像素(染色钙离子)和红色像素(染色EPS)的平均荧光强度。然后计算绿色像素与红色像素的荧光强度比。关于生物膜厚度评估，评估每个样品的Con-ATM荧光通道的六个选定区。这些区在观察者的全面检查之后被认为是整个样品的代表。自生物膜的表面至其基部测量距离，从而测量区的厚度，并且随后计算对应样品的生物膜的平均厚度。
在表1中，使用PARODONTAXTM牙膏(“PARODONTAX”，批号14042610，含有约67重量％的碳酸氢钠)，可商购获得的牙膏组合物的示例。将20重量％碳酸氢钠溶液(“20％BS”)和60重量％碳酸氢钠溶液(“60％BS”)用作阳性对照。PBS用作阴性对照。结果表明，20％BS显示出比PBS显著更低的Ca/EPS比率。PARODONTAX和60％BS显示出比20％BS和PBS显著更低的Ca/EPS比率。PARODONTAX与60％BS的Ca/EPS比率之间没有显著差异。结果还表明，20％BS显示出比PBS显著降低的生物膜厚度。PARODONTAX和60％BS显示出比20％BS和PBS显著降低的生物膜厚度。PARODONTAX和60％BS的生物膜厚度之间没有显著差异。
表1：钙与EPS的荧光强度比，以及含碳酸氢钠溶液/牙膏和阴性对照的平均生物膜 厚度。
本文所公开的量纲和值不应理解为严格限于所引用的精确数值。相反，除非另外指明，否则每个此类量纲旨在表示所述值以及围绕该值功能上等同的范围。例如，公开为“40mm”的量纲旨在表示“约40mm”。
除非明确排除或以其它方式限制，本文中引用的每一篇文献，包括任何交叉引用或相关专利或专利申请以及本申请对其要求优先权或其有益效果的任何专利申请或专利，均据此全文以引用方式并入本文。对任何文献的引用不是对其作为与本发明的任何所公开或本文受权利要求书保护的现有技术的认可，或不是对其自身或与任何一个或多个参考文献的组合提出、建议或公开任何此类发明的认可。此外，当本发明中术语的任何含义或定义与以引用方式并入的文献中相同术语的任何含义或定义矛盾时，应当服从在本发明中赋予该术语的含义或定义。
虽然已举例说明和描述了本发明的具体实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的实质和范围的情况下可作出多个其它变化和修改。因此，本文旨在于所附权利要求中涵盖属于本发明范围内的所有此类变化和修改。

Claims (15)

1.一种定量生物膜中的钙的方法，所述方法包括以下步骤：
(a) 用口腔护理组合物任选地处理所述生物膜；
(b) 用生物膜荧光探针标记所任选地处理的生物膜；
(c) 用钙荧光探针标记所任选地处理的生物膜；以及
(d) 通过测量从所述标记钙发射的荧光来定量所述标记钙。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括用所述口腔护理组合物处理所述生物膜3秒至48小时，优选地1分钟至3分钟的处理接触时间；优选地，其中所述口腔护理组合物选自洁齿剂、牙膏、免洗型凝胶、凝胶、漱口水，以及它们的组合。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述生物膜荧光探针选自微生物荧光探针、胞外聚合物(“EPS”)荧光探针，或它们的组合。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物膜荧光探针为所述微生物荧光探针，并且其中所述方法还包括通过测量从所述标记微生物生物膜发射的荧光来限定所述生物膜的微生物区域的步骤；优选地还包括在所述生物膜的所述微生物限定区域内定量所述标记钙的步骤。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物荧光探针包括对活细菌特异的第一探针和对死细菌特异的第二探针。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物膜荧光探针为所述EPS荧光探针，并且其中所述方法还包括通过测量从所述标记EPS生物膜发射的荧光来限定所述生物膜的EPS区域的步骤；优选地还包括在所述生物膜的所述EPS限定区域内定量所述标记钙的步骤。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过测量从所述标记钙发射的荧光来定量所述标记钙的步骤是通过共焦激光扫描显微术(CLSM)进行的。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中标记所述生物膜和标记所述钙的步骤在用所述口腔护理组合物处理所述生物膜的步骤之前。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物膜为原位菌斑生物膜。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括使人类受试者佩戴口腔器具6小时至4天，优选地1-3天的步骤；其中所述口腔器具的至少一部分包含羟基磷灰石(HA)作为所述生物膜待附着的表面，优选地，所述生物膜为原位菌斑生物膜，优选地，所述HA位于所述口腔器具的舌侧上。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述HA表面上的所述原位生物膜用所述口腔护理组合物离体或体内处理。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物荧光探针为荧光标记的rRNA指导的寡核苷酸。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述EPS荧光探针为荧光标记的凝集素。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括通过定量来自荧光标记的钙离子的所测量的荧光和来自生物膜的EPS的所测量的荧光来测定钙与EPS的定量荧光强度比的步骤。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述口腔护理组合物包含有效量的离子粘结剂；优选地，其中所述离子粘结剂为离子螯合剂；更优选地，其中所述离子螯合剂为钙螯合剂，并且其中所述离子荧光探针为钙荧光探针。
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