CN103348016B - 用于检测腈相关酶的酶活性的荧光底物 - Google Patents

用于检测腈相关酶的酶活性的荧光底物 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供腈相关酶的酶活性检测用荧光底物。本发明提供式(I)表示的化合物及含有该化合物的腈相关酶的酶活性检测用荧光底物。

Description

用于检测腈相关酶的酶活性的荧光底物
技术领域
本发明涉及新型化合物、用于检测含有该化合物的腈相关酶的酶活性的荧光底物以及使用前述化合物来检测受试物的酶活性的方法。
背景技术
现在，在成为化学品原料的化合物的制备工序中，从转换率或选择率高、光学活性化合物的情况下立体选择性高方面考虑，利用酶反应。例如，在成为各种化学品原料的腈化合物(丙烯酰胺、丙烯酸等)的制备中，使用利用腈水解酶、腈水合酶、酰胺酶等进行的酶反应。腈水解酶是将腈基水解转换为羧酸基的酶，腈水合酶是将腈基水合转换为酰胺基的酶，酰胺酶是将酰胺基水解转换为羧酸基的酶。
具有这些酶的微生物由以土壤为代表的自然界筛选。作为筛选方法，通常采用将以腈化合物等作为唯一的氮源或碳源而生长的微生物浓缩，从所得到的微生物中取得具有酶活性的微生物的方法。对于酶活性，使腈化合物或酰胺化合物与微生物反应，利用高效液相色谱、气相色谱等设备对产物进行分析。
另一方面，有报告指出自然界存在的微生物中，利用现在的技术可以分离、培养的微生物仅仅不足1%(M.S.Rappe andS.J.Giovannoni,Annu.Rev.Microbiol.,57,369(2003))。
因此，进行了不像现有方法那样分离微生物而是从自然界直接分离基因(环境DNA或宏基因组)，从其中筛选有用的酶基因的方法(宏基因组筛选)。为了使用该方法，谋求制作利用了宏基因组的非常多的重组体，从它们中有效地筛选具有活性的重组体的技术。然而，使用高效液相色谱、气相色谱等设备的方法欠缺高通量性。因此，谋求可以进行高通量筛选的新技术。
另一方面，作为荧光物质相关的发明，已知荧光探针或荧光标记试剂的发明(国际公开公报WO2004/005917、WO2006/019105)。然而，还不知道对本发明的酶活性的检测有用的荧光底物。
发明内容
本发明是鉴于这种情况而提出的，其要解决的问题在于，提供新化合物、用于检测含有该化合物的腈相关酶的酶活性的荧光底物以及使用前述化合物来检测受试物的酶活性的方法。
本发明人等为了解决上述问题进行了深入研究，结果开发了通过腈相关酶的作用而荧光发生变化的化合物，例如通过腈相关酶的作用而发荧光的无荧光(低荧光)的底物化合物。另外发现，通过测定本发明的底物的荧光，可以简便地检测腈相关酶的酶活性，从而完成了本发明。
即，本发明如下所述。
(1)一种检测受试物的酶活性的方法，其包含以下工序，
(a)使受试物与通过腈相关酶的作用而荧光发生变化的化合物反应的工序，和
(b)对由工序(a)中的反应而产生的荧光的波长和强度进行测定的工序。
(2)根据上述(1)所述的方法，其中，酶活性为选自由腈水解酶、腈水合酶和酰胺酶所组成组中的一种酶的活性。
(3)根据上述(1)所述的方法，其中，通过腈相关酶的作用而荧光发生变化的化合物为下述式(I)表示的化合物、其盐或它们的水合物，
式中，R1表示-CN、-CONH2、-CH=CH-CN或-CH=CH-CONH2，R2表示C1-4烷基，R3和R4各自独立地表示氢原子、卤原子或C1-4烷基，R5表示氢原子、C1-4烷基羰基或C1-4烷基羰基氧基甲基。
(4)根据上述(3)所述的方法，其中，R1为-CN或-CH=CH-CN，腈相关酶为腈水解酶或腈水合酶。
(5)根据上述(3)所述的方法，其中，R1为-CONH2或-CH=CH-CONH2，腈相关酶为酰胺酶。
(6)根据上述(1)所述的方法，其中，荧光使用流式细胞术测定。
(7)一种下述式(I)表示的化合物、其盐或它们的水合物，
式中，R1表示-CN、-CONH2、-CH=CH-CN或-CH=CH-CONH2，R2表示C1-4烷基，R3和R4各自独立地表示氢原子、卤原子或C1-4烷基，R5表示氢原子、C1-4烷基羰基或C1-4烷基羰基氧基甲基。
(8)一种用于检测腈相关酶的酶活性的荧光底物，其含有上述(7)所述的化合物、其盐或它们的水合物。
(9)根据上述(8)所述的底物，其中，腈相关酶为选自由腈水解酶、腈水合酶和酰胺酶所组成组中的至少一种。
(10)根据上述(8)所述的底物，其中，R1为-CN或-CH=CH-CN，腈相关酶为腈水解酶或腈水合酶。
(11)根据上述(8)所述的底物，其中，R1为-CONH2或-CH=CH-CONH2，腈相关酶为酰胺酶。
(12)一种用于检测腈相关酶的酶活性的试剂盒，其含有上述(8)～(11)中的任一项所述的底物。
通过使用本发明的化合物，可以简便地检测腈相关酶的酶活性。
附图说明
图1为表示利用腈相关酶的荧光底物的反应路径的图。
图2为表示荧光底物的荧光测定的结果的图。
图3为表示检测腈水合酶活性带来的荧光底物的荧光强度增加的结果的图。
图4为表示检测腈水解酶活性带来的荧光底物的荧光强度增加的结果的图。
图5为表示检测酰胺酶活性带来的荧光底物的荧光强度增加的结果的图。
具体实施方式
以下对本发明进行详细说明。以下的实施方式为用于说明本发明的示例，并非将本发明仅限定为该实施方式的主旨。本发明在不脱离该主旨的范围内可以以各种方式来实施。另外，本说明书包含本申请优先权主张的基础2010年5月25日申请的日本专利申请(日本特愿2010-119431号)的说明书及附图记载的内容。
1.概要
本发明涉及通过腈相关酶的作用而荧光发生变化的化合物(以下还称为“本发明的化合物”)、及用于检测含有该化合物的腈相关酶的酶活性的荧光底物。另外，本发明涉及通过使受试物与本发明的化合物反应、测定该反应中产生的荧光的波长及强度，从而检测受试物的酶活性的方法。
作为用于检测腈相关酶的酶活性的化合物，本发明人等尝试了通过与腈相关酶反应而荧光发生变化的化合物的合成。对合成的化合物的荧光进行测定的结果发现，与酶反应前的化合物的荧光相比，认为通过酶反应生成的化合物的荧光升高。因此，本发明人等认为，合成的化合物作为用于检测腈相关酶的酶活性的荧光底物是有用的，从而完成了本发明。
2.化合物
在本发明中，“通过腈相关酶的作用而荧光发生变化的化合物”指的是，通过酶的作用，伴随着化合物所含有的腈基(-CN)转换为酰胺基(-CONH2)或羧基(-COOH)、或者化合物所含有的酰胺基转换为羧基，而荧光变化的化合物。本发明的化合物为具有荧光团以及腈基或酰胺基的化合物，若为具有如下特征的化合物，则没有特别限定：由于化合物中的腈基转换为酰胺基或羧基、或者化合物中的酰胺基转换为羧基，因此荧光团来源的荧光发生变化。
另外，通过腈相关酶的作用而荧光发生变化的机理不一样，例如对于式(I)表示的化合物，可以如下进行说明。
在本化合物中，在腈相关酶的反应之前，由于光诱导电子转移(PeT、Photo-induced Electron Transfer)而为大致无荧光或低荧光。然而，若通过酶反应而腈基、酰胺基水解，则不会引起PeT，而发荧光。PeT为通过光激发产生的电子转移反应。
例如，后述化合物1由于从其呫吨部位到苯环部位的PeT，作为激发荧光团的呫吨环部位来源的荧光消光，成为大致无荧光的状态。然而，若化合物1的腈基通过腈水解酶水解生成化合物5，则不会引起PeT，化合物5发荧光。
在本发明中，腈相关酶指的是作用于腈相关化合物(具有腈基的化合物及具有酰胺基的化合物)的酶。作为这种酶，可以举出例如腈水解酶、腈水合酶和酰胺酶。
腈相关酶的“作用”指的是水合反应或水解反应。
荧光的“变化”指的是荧光波长的偏移和/或荧光强度的变化。是否“变化”可以基于以下基准进行判断。荧光强度增强的情况指的是变为1.5倍以上、优选2倍以上、更优选3倍以上的情况，荧光强度减弱的情况指的是变为2/3以下、优选1/2以下、更优选1/3以下的情况。另外，荧光波长变化的情况指的是向长波长侧或短波长侧偏移10nm、优选30nm、更优选60nm以上的情况。
在本发明中，作为通过腈相关酶的作用而荧光发生变化的化合物，可以举出例如以下的式(I)表示的化合物。
式(I)中，作为R1表示的取代基，只要为与腈相关酶反应的取代基则不加以限定，可以举出-CN、-CONH2、-CH=CH-CN或-CH=CH-CONH2。
作为R2表示的取代基，可以举出C1-4烷基。
作为R3和R4表示的取代基，可以举出氢原子、卤原子或C1-4烷基。
作为R5表示的取代基，可以举出氢原子、C1-4烷基羰基或C1-4烷基羰基氧基甲基。
在本发明中，“C1-4烷基”指的是碳原子数为1～4的直链状或支链状的烷基，可以举出例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基等，优选为甲基。
在本发明中，作为“C1-4烷基羰基”，可以举出例如乙酰基、乙基羰基、丙酰基羰基、异丁基羰基等，优选为乙酰基。
在本发明中，作为“C1-4烷基羰基氧基甲基”，可以举出例如乙酰氧基甲基、乙氧基甲基、丙酰氧基甲基、异丁酰氧基甲基等，优选为乙酰氧基甲基。
在本发明中，作为“卤原子”，可以举出例如氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等，优选为氟原子或氯原子。
作为R2优选为C1-4烷基而不是氢原子的理由，可以举出R2为氢原子的情况下，苯环的电子密度不会充分低，因此不易引起由于光诱导电子转移带来的荧光团的消光。即，R2为氢原子的情况下，即使在酶反应之前荧光强度也大，因此不期望通过腈相关酶进行的酶反应带来较大的荧光强度变化。另一方面，R2为C1-4烷基的情况下，苯环的电子密度充分降低，由此引起由光诱导电子转移带来的荧光团的消光，可以期待酶反应带来的荧光强度的变化。
式(I)表示的化合物的代表例子如下所示(式中，Me表示甲基)。
化合物1    化合物2    化合物3
化合物4    化合物5    化合物6
上述式(I)表示的化合物还可以形成其盐或水合物。盐只要具有本发明的效果则不特别限定，可以形成与酸的盐或与碱的盐。
作为与酸的盐，可以举出例如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐等与无机酸的盐，与甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、柠檬酸、酒石酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸等有机酸的盐等。
作为与碱的盐，可以举出例如钠盐、钾盐等碱金属盐，钙盐、镁盐等碱土金属盐，与三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、二环己胺、N,N’-二苄基乙二胺等有机碱的盐(有机胺盐)，或者铵盐等。
另外，作为本发明的化合物，还可以选择不形成盐的所谓游离体。
式(I)表示的化合物可以通过以下的方法制备。
首先，起始原料化合物(a)可以通过由东京化成工业(TCI)购入来得到。然后，通过使化合物(a)与DMF中的Ac2O及Cs2CO3在室温下反应1小时，得到化合物(b)。接着，将化合物(b)溶解在12N HCl中，于冰浴上滴加NaNO2，并进行搅拌。0℃下搅拌30分钟后，滴加溶解在水中的KI，并搅拌10分钟。恢复至室温，反应1小时，得到化合物(c)。进而，使化合物(c)在THF中CuI、Pd(PPh3)4催化剂下与KCN于约80℃回流下反应3小时，得到化合物(d)。使化合物(d)在MeOH中与MeONa于室温下反应10分钟，得到化合物(e)。最后，使化合物(e)在CsF及DMF中与1当量的CH3I于室温下反应约1小时，得到化合物1。
3.荧光底物
上述式(I)表示的化合物、其盐或它们的水合物可以用作用于检测腈相关酶的酶活性的荧光底物。
以下，对上述式(I)表示的化合物产生荧光的机理进行说明。
上述式(I)表示的化合物，在腈相关酶的反应之前，由于光诱导电子转移(PeT、Photo-induced Electron Transfer)而为大致无荧光。然而，若通过酶反应而腈基、酰胺基水解，则不会引起PeT，而发荧光。PeT为通过光激发产生的电子转移反应。
例如，化合物1由于从其呫吨部位到苯环部位的PeT，作为激发荧光团的呫吨环部位来源的荧光消光，成为大致无荧光的状态。然而，若化合物1的腈基通过腈水解酶水解生成化合物5，则不会引起PeT，化合物5发荧光(图1)。
只要可以检测到荧光，则可知在受试样品中存在腈相关酶。
在本发明中，作为腈相关酶，可以举出腈水解酶、腈水合酶和酰胺酶，但是不限定为这些。
另外，在式(I)表示的化合物中，R1为-CN或-CH=CH-CN时，腈相关酶优选为腈水解酶或腈水合酶，R1为-CONH2或-CH=CH-CONH2时，腈相关酶优选为酰胺酶。
4.酶活性的检测方法
本发明提供酶活性的检测方法。具体地说，该方法为检测受试物的酶活性的方法，包含：(a)使受试物与通过腈相关酶的作用而荧光发生变化的化合物反应的工序，和(b)对由工序(a)中的反应而产生的荧光的波长和强度进行测定的工序。
在本发明中，作为受试物，只要为预测含有具有腈相关酶的酶活性的蛋白质或编码该蛋白质的DNA的物质则不加以限定，可以举出例如从自然界得到的宏基因组文库或突变酶基因库等中含有的物质。进而，受试物中不仅包括DNA及蛋白质，还包括产生该蛋白质的细胞。作为这种细胞，可以举出细菌、真菌(酵母、丝状菌等)、植物细胞、动物细胞等。进而，上述细胞中包括按照表达具有腈相关酶的酶活性的蛋白质的方式进行形式转换而得到的细胞。作为前述细胞不加以限定，可以举出例如宿主载体系统的正在开发的埃希氏菌(Escherichia)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、沙雷氏菌(Serratia)属、短杆菌(Brevibacterium)属、棒杆菌(Corynebacterium)属、链球菌(Streptococcus)属、乳酸杆菌(Lactobacillus)属、红球菌(Rhodococcus)属、链霉菌(Streptomyces)属等等的细菌，酵母菌(Saccharomyces)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属、接合酵母(Zygosaccharomyces)属、解脂耶氏酵母(Yarrowia)属、毛孢子菌(Trichosporon)属、红冬孢酵母(Rhodosporidium)属、毕赤酵母(Pichia)属、念珠菌(Candida)属等的酵母，链孢霉(Neurospora)属、曲霉(Aspergillus)属、头孢霉(Cephalosporium)属、木霉(Trichoderma)属等的丝状菌等。
宏基因组文库指的是由自然环境中存在的多种微生物的DNA构建的基因组文库，是不进行微生物培养从环境试样中直接提取DNA，形成文库。突变酶基因库指的是，向编码已知酶的DNA随机导入突变，形成文库。
对于宏基因组文库的制作方法，例如记载于日本特开2007-159417的对于突变酶基因库的制作方法，已记载于Molecular Cloning:A laboratory Mannual,2nd Ed.,Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY.,1989.、CurrentProtocols in Molecular Biology,Supplement 1~38,John Wiley＆Sons(1987-1997)等中，本领域技术人员基于这些文献就可以制作前述文库。
本发明的检测方法具体地说可以通过例如以下方法来进行。
使用宏基因组文库或突变酶基因库作为受试物时，将它们的文库中含有的DNA转导到细胞中，制作转化体的文库。接着，通过向转化体导入本发明的化合物或荧光底物，使转化体中产生的蛋白质与本发明的化合物或荧光底物反应。然后，对通过前述反应产生的荧光的波长及强度进行测定。荧光的测定可以使用作为荧光检测仪器的荧光分光光度计或成像仪、流式细胞仪等。
流式细胞术(flow cytometry)指的是，通过使用激光进行光散射或荧光测定，对通过流动池中的单一细胞的大小、DNA量、细胞表面抗原的分布状态、细胞内酶活性等进行计测的方法。在本发明的方法中，使受试物与通过腈相关酶的作用而荧光发生变化的化合物反应，通过该反应产生的荧光可以使用流式细胞术进行测定。
流式细胞术可以使用市售的流式细胞仪按照制造商的说明书来进行。流式细胞仪为包括激光发生装置、光学系统、喷嘴、数据处理装置的装置，可以进行产生荧光的细胞的自动分离、荧光的分析以及通过计算机进行的解析。尤其是具有细胞分选功能的流式细胞仪(细胞分选仪)可以仅对产生目的荧光的细胞进行高速筛选及分选。细胞分选仪通过使细胞分选仪内的喷嘴超声波振动而在鞘流形成液滴，在含有目的细胞的鞘流形成液滴的瞬间带电。带电的液滴被吸引到带负电的偏转板，回收到管中。如此，具有目的荧光的细胞被筛选及分选。作为市售的流式细胞仪，可以举出例如BD FACSCaliburTM流式细胞仪、BDFACSAriaTMIII细胞分选仪(日本Becton,Dickinson and Company)等。
在本发明中，通过受试物与本发明的化合物反应产生的荧光可以使用流式细胞术进行测定，产生目的荧光的细胞、即含有具有目的酶活性的物质的细胞可以进行高速筛选、分离或分选。不使用流式细胞术时，每一天可以测定数百个细胞的荧光，与此相对地，使用利用荧光活性细胞分拣器(FACS、Fluorescence-activated cell sorting)系统的流式细胞术时，每一天可以测定数万～数百万个细胞的荧光。这意味着利用FACS的处理细胞数为每1秒数百个时，百万个细胞的测定可以在1～2小时内完成，若为更高性能的FACS(每1秒约7000个)，则意味着百万个细胞的测定可以在数分钟内完成。
因此，在本发明的方法中，通过使用流式细胞术测定荧光，不仅受试物的酶活性的检测可以自动化及高速化进行，而且含有具有目的酶活性的物质的细胞的筛选及分选也可以自动化及高速化(高通量筛选high-throughput screening)进行。
5.试剂盒
本发明提供含有含上述式(I)表示化合物的荧光底物的用于检测腈相关酶的酶活性的试剂盒。本发明的试剂盒除了本发明的荧光底物之外，还可以适当含有溶解液、缓冲液、使用说明书等对腈相关酶的酶活性的检测必要的其他任意的构成要素。
以下，通过实施例对本发明进行详细说明，然而本发明不被这些实施例所限定。
实施例1
1.通过腈相关酶的作用而荧光发生变化的化合物的合成
(1)式(I)表示的化合物
作为通过腈相关酶的作用而荧光发生变化的化合物，本发明中的式(I)表示的化合物的代表例子如下所示(式中，Me表示甲基)。
化合物1    化合物2    化合物3
化合物4    化合物5    化合物6
(2)式(1)表示的化合物的合成
化合物1按照以下的路线1来合成。
<路线1：化合物1的合成>
起始原料化合物(a)可以通过由东京化成工业(TCI)购入来得到。然后，通过使化合物(a)与DMF中的Ac2O及Cs2CO3在室温下反应1小时，得到化合物(b)。接着，将化合物(b)溶解在12N HCl中，于冰浴上滴加NaNO2，并进行搅拌。0℃下搅拌30分钟后，滴加溶解在水中的KI，并搅拌10分钟。恢复至室温，反应1小时，得到化合物(c)。进而，使化合物(c)在THF中CuI、Pd(PPh3)4催化剂下与KCN于约80℃回流下反应3小时，得到化合物(d)。使化合物(d)在MeOH中与MeONa于室温下反应10分钟，得到化合物(e)。最后，使化合物(e)在C sF及DMF中与1当量的CH3I于室温下反应约1小时，得到化合物1。
化合物1
1H NMR(300MHz,CD3OD)：δ6.82(d,2H,J=9.33Hz)，6.68-6.73(m,4H)，3.65(s,3H)，7.89(d,1H,J=1.11Hz)，8.14(dd,1H,J=1.47,8.25Hz)，8.40(d,1H,J=8.10Hz)
HRMS(ESI-)：Calcd for[M-H]-,370.0716，Found，370.0672(-4.38mmu)
化合物2也通过基于上述路线1的方法来合成。
化合物2
1H NMR(300MHz,(CD3OD)：δ3.66(s,3H)，6.67-6.74(m,4H)，6.96-6.99(m,2H)，6.64(d,1H,J=8.07Hz)，8.18(dd,1H,J=8.07,1.47Hz)，8.61(d,1H,J=1.47Hz)
HRMS(ESI-)：Calcd  for  [M-H]-,370.07155,Found,370.06831(-3.24mmu)
化合物3和化合物4按照以下的路线2来合成。
<路线2：4(5)-CONH2荧光素甲酯的合成>
(化合物3或4)
首先，起始原料化合物(f)可以通过由SIGMA公司购入来得到。然后，通过使化合物(f)与DMF中的Ac2O及Cs2CO3在室温下反应1小时，得到化合物(g)(收率96%)。接着，使化合物(g)在TsCl及三乙胺中与负载在硅胶上的NH4Cl于室温下反应10分钟，得到化合物(h)。进而，使化合物(h)在MeOH中与MeONa于室温下反应10分钟，得到化合物(i)。最后，使化合物(i)在CsF及DMF中与1当量的CH3I于室温下反应1小时，得到化合物3和化合物4(收率2.3%)。
化合物3
1H NMR(300MHz,CD3OD)：δ8.37(d,1H,J=8.07Hz)，8.23(dd,1H,J=8.07,1.47Hz)，7.89(d,1H,J=1.47Hz)，7.01(m,2H)，6.64(m,4H)，3.64(s,3H)
HRMS(ESI+)：Calcd for[M+H]+,390.09776，Found，390.09473(-3.04mmu)
化合物4
1H NMR(300MHz,CD3OD)：δ8.79(d,1H,J=2.20Hz)，8.30(dd,1H,J=8.07,2.20Hz)，7.55(d,1H,J=8.07Hz)，7.00(m,2H)，6.72(m,4H)，3.66(s,1H)
HRMS(ESI+)：Calcd for[M+H]+,390.09776，Found，390.09457(-3.19mmu)
化合物5和化合物6按照以下的路线3来合成。
<路线3：4(5)-COOH荧光素甲酯的合成>
使化合物(j)与H2SO4中的MeOH在100℃回流下反应1小时，得到化合物(k)(收率8.6%)。接着，使化合物(k)与MeOH中的1当量的NaOH在100℃回流下反应2小时，得到化合物5和化合物6(微量(trace))。
化合物5和化合物6
HRMS(ESI+)：Calcd for[M+H]+,391.08178，Found，391.08536(+3.57mmu)
2.化合物的荧光及荧光量子收率的测定
测定上述化合物1～6的荧光。结果如图2所示。
图2中，“CN”表示化合物1，“CONH2-1”表示化合物4，“CONH2-2”表示化合物3。另外，“COOH-1”表示5-COOH荧光素，“COOH-2”表示化合物5和化合物6的混合物。
另外，测定化合物1～6的荧光量子收率(Φf1)。结果化合物1～6的荧光量子收率分别为0.007、0.161、0.018、0.397、0.0729、0.565。而且，对于化合物5和化合物6，基于由HPLC求得的浓度比算出分离时的值。
这些测定结果如下所示。
表1
表2
由上述结果可知，化合物1大致无荧光，即使腈基(-CN)被水解为酰胺基(-CONH2)形成化合物3荧光也不怎么升高，然而若酰胺进一步被水解形成化合物5则荧光大幅升高(表1)。由该结果可知，化合物1可以用作用于检测腈水解酶的酶活性的荧光底物。
另外显示，化合物3大致无荧光，若化合物3的酰胺基被水解则形成荧光性的化合物5，因此化合物3可以用作用于检测酰胺酶的酶活性的荧光底物。
进而可知，对于化合物2，由于伴随着腈基(-CN)转换为酰胺基(-CONH2)、羧基(-COOH)而荧光强度升高，因此可以成为用于检测腈水合酶及腈水解酶的活性的荧光底物的候补。
以上显示，在本实施例中设计及合成的化合物具有可以以荧光变化的形式使腈水解酶、腈水合酶及酰胺酶可视化的荧光特性，可以作为用于检测酶活性的荧光底物发挥功能。
实施例2
利用腈水合酶进行的反应
1.腈水合酶粗酶液(细胞提取液)的制备
将用于组成型表达(constitutive expression)来自红球菌属细菌中玫瑰红红球菌J1株的腈水合酶的质粒p SJ034导入到玫瑰红红球菌ATCC 12674株。pSJ034为由质粒pSJ023通过日本特开平10-337185号说明书记载的方法制作的质粒。pSJ023以转化体玫瑰红红球菌R.rhodochrous ATCC12674/pSJ023(FERMBP-6232)的形式保藏在产业综合技术研究所专利生物保藏中心。
通过质粒pSJ034将玫瑰红红球菌ATCC12674株转化，制作ATCC12674株/pSJ034株。将导入有载体pK4的12674株用于对照实验中。
ATCC12674株的转化如下进行。ATCC12674株的对数增殖期的细胞用离心分离器收集，用冰冷却的无菌水洗涤3次，悬浮在无菌水中。将上述质粒溶液1μl与菌体悬浮液10μl混合，进行冰冷却。将其转移到基因导入装置基因脉冲导入仪(BIO RAD)用试管中，使用该装置在2.0KV、200OHMS下进行电脉冲处理。将电脉冲处理液在冰冷却下静置10分钟后，37℃下孵育10分钟，加入500μl MYK培养基(0.5%多聚蛋白胨、0.3%Bacto酵母提取物、0.3%Bacto麦芽提取物、0.2%K2HPO4、0.2%KH2PO4)，30℃静置5小时后，涂布到加有50μg/ml卡那霉素的MYK琼脂培养基上，30℃培养3天。培养所得菌落，确认到导入有质粒。
培养如下进行。接种到含有卡那霉素(50mg/L)的MYK培养基10ml中，30℃下进行24小时前培养。取1ml培养液，加入到100ml的该培养基中，30℃下振荡培养48小时。通过离心分离(3700×g、10分钟、4℃)从所得到的培养液回收菌体，用10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)洗涤后，悬浮在该缓冲液中。
由所得到的菌体悬浮液使用1ml，利用超声波破碎机VP-15S(Taitec、日本)，在输出控制4、工作循环(DUTYCYCLE)40%、PULS、定时器(TIMER)=B模式10s的条件下冰冷却的同时破碎3分钟。接着，进行离心分离(10000×g、5分钟、4℃)，采取得到的上清液作为细胞提取液。
2.酶反应
将10μL磷酸钠缓冲液(pH 7.0)、75μL无菌水和5μL的0.01mM腈荧光底物(化合物2：溶解在10%DMSO中)混合，30℃下进行预孵育。通过加入如上制备的细胞提取液10μL而开始反应。30℃下反应1小时后，转移到96孔微孔板，用荧光成像仪(BioRad公司、Pharos FX分子成像仪、激发波长488nm、检测波长530nm)检测荧光。
结果如图3所示。在由作为对照样品的导入有载体pK4的重组体得到的细胞提取液中荧光无变化，与此相对地，使用表达腈水合酶的重组体的情况下，确认到荧光强度显著增加。
由该结果可知，本发明的化合物作为用于检测腈相关酶的酶活性的荧光底物是有用的。
实施例3
利用腈水解酶进行的反应
1.腈水解酶粗酶液(细胞提取液)的制备
将高表达来自红球菌属SK92株的腈水解酶的大肠杆菌重组体JM 109/p SK002(日本特开平8-173169)接种到1ml的含有50μg/ml氨苄西林的LB培养基(1%Bacto胰蛋白胨、0.5%Bacto酵母提取物、0.5%NaCl)中，37℃下进行7小时前培养。取0.1ml培养液，加入到100ml该培养基(含有50μg/ml氨苄西林、1mMIPTG)中，37℃下振荡培养15小时。通过离心分离(3700×g、10分钟、4℃)从所得到的培养液中回收菌体，用10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)洗涤后，悬浮在该缓冲液中。作为对照株使用JM109/pUC118。
使用所得到的菌体悬浮液中的1ml，利用超声波破碎机VP-15S(Taitec、日本)，在输出控制4、工作循环(DUTYCYCLE)40%、PULS、定时器(TIMER)=B模式10s的条件下一边冰冷却一边破碎1分钟。接着，进行离心分离(10000×g、5分钟、4℃)，采取得到的上清液作为细胞提取液。
2.酶反应
与实施例2同样地进行，使用腈荧光底物(化合物2)进行反应，用荧光成像仪检测。
结果如图4所示。在由对照样品JM 109/pUC 118得到的细胞提取液中荧光无变化，与此相对地，使用表达腈水解酶的重组体来源的细胞提取液的情况下，确认到荧光强度显著增加。
由该结果可知，本发明的化合物作为用于检测腈相关酶的酶活性的荧光底物是有用的。
实施例4
将10μL磷酸钠缓冲液(pH 7.0)、75μL无菌水及5μL 0.1mM腈荧光底物(化合物2：溶解在DMSO中)混合，30℃下进行预孵育。通过加入利用与实施例3相同的方法制备的细胞提取液10μL而开始反应。反应24小时后，在由对照样品JM 109/pUC 118得到的细胞提取液中几乎没有确认到颜色变化，与此相对地，使用表达腈水解酶的重组体来源的细胞提取液的情况下，看到显著绿色的荧光(图5)。
由该结果可知，本发明的荧光底物的荧光强度为可以用肉眼与对照相区别的显著高的荧光强度。
产业上的可利用性
通过使用本发明的化合物，可以通过荧光简便地检测酶活性。进而，组合使用FAC S等时，可以构建高通量的酶活性检测系统。

Claims (5)

1.一种下述式(I)表示的化合物、其盐或它们的水合物，
式(I)中，R1表示-CN、-CONH2、-CH＝CH-CN或-CH＝CH-CONH2，R2表示C1-4烷基，R3和R4各自独立地表示氢原子、卤原子或C1-4烷基，R5表示氢原子、C1-4烷基羰基或C1-4烷基羰基氧基甲基。
2.一种检测受试物的酶活性的方法，其包含以下工序，
(a)使受试物与权利要求1所述的化合物、其盐或它们的水合物反应的工序，和
(b)对由工序(a)中的反应而产生的荧光的波长和强度进行测定的工序，
其中，在所述化合物中，R1为-CN或-CH＝CH-CN时，所述酶活性为腈水解酶或腈水合酶的活性，
在所述化合物中，R1为-CONH2或-CH＝CH-CONH2时，所述酶活性为酰胺酶的活性。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，荧光使用流式细胞术测定。
4.一种用于检测腈相关酶的酶活性的荧光底物，其含有权利要求1所述的化合物、其盐或它们的水合物，
其中，在所述化合物中，R1为-CN或-CH＝CH-CN时，腈相关酶为腈水解酶或腈水合酶，
在所述化合物中，R1为-CONH2或-CH＝CH-CONH2时，腈相关酶为酰胺酶。
5.一种用于检测腈相关酶的酶活性的试剂盒，其含有权利要求4所述的底物。
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