CN105548054A - 一种快速检测腈水解酶活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测腈水解酶活性的方法。向腈水解酶反应样品中加入盐酸羟胺和二环己基碳二亚胺的乙醇溶液，震荡混匀，水浴加热后加入三氯化铁的乙醇溶液，充分显色后，用紫外分光光度计测定520nm处的吸光度值，根据吸光度值的大小计算出腈水解酶活性的大小，测定得到相对标准偏差(RSD)和回收率分别是1%～2%和99%～102%，且其结果与HPLC法测定实验结果一致。此法操作简单、快速、安全、廉价、精确，在腈水解酶的快速筛选及高通量筛选中有一定的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物化学分析领域，涉及一种腈水解酶，具体来说是一种快速检测腈水解酶活性的方法。
背景技术
腈水解酶是一类非常重要的水解酶，它可直接将腈类物质水解为羧酸或胺，参与多种生物体内重要物质的生物合成。此外，腈水解酶可作为一种生物催化剂，在羧酸及其衍生物的不对称合成中占有重要的作用。
过去几十年中，许多测定腈水解酶活性的方法被开发出来，包括高效液相色谱法﹑气相色谱法和毛细管电泳等。但这些方法操作过程复杂，而且耗时较长(ApplEnvironMicrobiol,2007,73(19):6053-6057)。在筛选腈水解酶的传统方法中，薄板层析法方法简单快速，但是通量较低(IntJBiochem,1985,17(6):677-683)。DeSantis等报道一种金属基方法能检测浓度小于5.0mM的产物，然而这种方法不能应用于含有蛋白质等复杂体系中腈水解酶活力的测定(JAmChemSoc,2002,124(31):9024-9025)。Santoshkumar等用平板法测定产酶菌株催化脂肪族腈反应中释放出氨所导致的pH变化，由于体系中有缓冲溶液，反应中生成的弱酸或弱碱对pH变化影响小，因此该检测方法的灵敏性有待提高(JIndMicrobiolBiotechnol,2010,37(1):111-115)。He等人在高氯酸羟胺和DCC存在条件下,用高氯酸铁作为显色剂，测定了有机酸含量。然而，高氯酸羟胺在市场上很难买到，需要自己制备合成，其制备过程繁琐，安全性低，而且高氯酸铁价格昂贵(ApplMicrobiolBiotechnol.2011,89(3),817-823.)。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种快速检测腈水解酶活性的方法，所述的这种快速检测腈水解酶活性的方法解决了现有技术中检测腈水解酶活性的方法通量低、灵敏度不高的技术问题。
本发明提供了一种快速检测腈水解酶活性的方法，首先利用腈水解酶催化腈类化合物发生水解反应，水解产物经终止反应、稀释后，加入含有盐酸羟胺和二环己基碳二亚胺(DCC)的乙醇溶液，震荡混均，水浴加热后加入三氯化铁的乙醇溶液，待充分反应后，用紫外分光光度计测定520nm处的吸光度值，根据吸光度值的大小可计算出腈水解酶活性的大小。
进一步的，所述的腈类化合物为扁桃腈、烟腈、苯甲腈、1-氰基-环己基乙腈或乙腈。结构式如下所述：
本发明还提供了上述的一种快速检测腈水解酶活性的方法，包括如下步骤：
1)一个利用腈水解酶催化水解腈类化合物的步骤；采用磷酸盐缓冲溶液重新悬浮静息细胞，然后加入底物腈，在摇床上转化反应；
2)将催化水解腈类化合物的样品进行处理的步骤；将步骤1)的反应样品用甲醇终止反应，离心，得上清，上清再用双蒸水稀释4～6倍，即为转化反应后的样品；
a)向步骤2)所得的反应样品中加入三倍体积的盐酸羟胺的乙醇溶液，所述的盐酸羟胺乙醇溶液的浓度为1～9mM，接着加入样品体积五分之一体积的DCC的乙醇溶液，DCC的乙醇溶液的浓度为0.2M；将该混合液震荡混匀，恒温加热，温度范围为20～80℃，加热10～40min，水浴完成后接着加入样品体积二十分之一体积的三氯化铁溶液的乙醇溶液，所述的三氯化铁溶液的乙醇溶液的浓度为0.1～1.0M，显色反应10min，用紫外分光光度计测定520nm处的吸光度值，根据吸光度值的大小可计算出腈水解酶活性的大小。
进一步的，所述的盐酸羟胺乙醇溶液的浓度为4mM。
进一步的，所述的恒温加热条件为60℃。
进一步的，所述的三氯化铁溶液的乙醇溶液的浓度为0.5M。
本发明还提供了上述的一种快速检测腈水解酶活性的方法，包括如下步骤：
1)一个利用腈水解酶催化水解腈类化合物的步骤；采用0.1M的磷酸盐缓冲溶液重新悬浮静息细胞，使得静息细胞的浓度为10g/L，然后加入底物腈，使得底物腈的终浓度为50mM，然后在摇床上转化反应；
2)将催化水解腈类化合物的样品进行处理的步骤；将步骤1)的反应样品用甲醇终止反应，离心，得上清，上清再用双蒸水稀释4～6倍，即为转化反应后的样品；
3)向1mL步骤2)所得的反应样品中加入3倍体积的盐酸羟胺的乙醇溶液，所述的盐酸羟胺乙醇溶液的浓度为1～9mM，接着加入DCC的乙醇溶液0.2mL，DCC的乙醇溶液的浓度为0.2M；将该混合液震荡混匀，恒温加热，温度范围为20～80℃，加热10～40min，水浴完成后接着加入0.05mL三氯化铁溶液的乙醇溶液，所述的三氯化铁溶液的乙醇溶液的浓度为0.1～1.0M，显色反应10min，用紫外分光光度计测定520nm处的吸光度值，根据吸光度值的大小可计算出腈水解酶活性的大小。
本发明是一种利用羟肟酸铁比色法快速检测腈水解酶活性的方法，是以羟肟酸铁比色法来检测腈水解酶水解腈类化合物产生有机酸的含量，进而获得腈水解酶活性的数据。本发明利用含有腈水解酶基因的大肠杆菌静息细胞催化腈类化合物发生水解反应，水解产物经适当处理后加入盐酸羟胺和N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC)的乙醇溶液，震荡混均，水浴加热后加入三氯化铁的乙醇溶液，待充分反应后，即可得到体系均一且稳定的紫红色羟肟酸铁络合物，用紫外分光光度计测定520nm处的吸光度值，根据吸光度值的大小可计算出酶活性的大小。测定得到相对标准偏差(RSD)和回收率分别是1％～2％和99％～105％，且其结果与HPLC法测定实验结果一致，说明此法操作简单，快速，安全，廉价，精确。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明以盐酸羟胺替代高氯酸羟胺，三氯化铁替代高氯酸铁，所需的设备简单，操作过程简单，原料来源都已商品化容易得到，价格廉价，安全性高。与目前所用的测定腈水解酶活性的基本方法-HPLC法相比较，检测速度快，在腈水解酶的快速筛选及高通量筛选中有巨大的应用潜力，是一种腈水解酶活性高通量筛选的方法。
附图说明
图1为羟肟酸铁比色法测定腈水解酶水解不同腈类化合物的活性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1腈水解酶反应过程及样品处理
将50mg含有腈水解酶基因的大肠杆菌静息细胞重悬于5mL0.1M磷酸盐缓冲溶液，并加入适量1-氰基-环己基乙腈(终浓度50mM)，置于30℃、180r/min的摇床上反应8h。用甲醇终止反应，4℃离心，得上清液，再用双蒸水稀释5倍，即为腈水解酶水解腈类化合物的样品。
实施例2盐酸羟胺浓度优化
将稀释5倍的腈水解酶水解1-氰基-环己基乙腈的样品取1ml于5mlEP管中，首先加入3mL的盐酸羟胺的乙醇溶液，其浓度分别为1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM和9mM，其次加入0.2mLDCC的乙醇溶液的，其浓度为0.2M。将该混合液震荡混均，水浴加热，在30℃加热20min。水浴完成后接着加入0.05ml三氯化铁溶液的乙醇溶液，其浓度为0.8M，显色10min后，用紫外分光光度计测定520nm处的吸光度值。结果如表1，其添加量从1mM升高到4mM时，吸光度不断增大，继续增加其量至9mM，吸光度则不断降低。因此，其最佳添加量是4mM。
表1盐酸羟胺浓度对吸光度值的影响
实施例3三氯化铁浓度优化
将稀释5倍的腈水解酶水解1-氰基-环己基乙腈的样品取1ml于5mlEP管中，首先加入3ml的盐酸羟胺的乙醇溶液，其浓度分别为4mM，其次加入0.2mlDCC的乙醇溶液的，其浓度为0.20M。将该混合液震荡混均，水浴加热，在30℃加热20min。水浴完成后接着加入0.05ml三氯化铁溶液的乙醇溶液，其浓度分别为0.10M、0.20M、0.30M、0.40M、0.50M、0.60M、0.70M、0.80M、0.90M和1.0MmM，显色10min后，用紫外分光光度计测定520nm处的吸光度值。结果表明，三氯化铁含量从0.1M升高到0.5M时与之相对应的吸收值不断增加，然而继续增加三氯化铁浓度到1.0M时与之相对应吸收值则基本趋于平稳。所以，最佳三氯化铁的浓度是0.5M。
表2三氯化铁浓度对吸光度值的影响
实施例4水浴温度优化
将稀释5倍的腈水解酶水解1-氰基-环己基乙腈的样品取1ml于5mlEP管中，首先加入3ml的盐酸羟胺的乙醇溶液，其浓度分别为4mM，其次加入0.2mlDCC的乙醇溶液的，其浓度为0.20M，震荡混均，水浴加热，控制水浴温度20～80℃，水浴保温20min后，接着加入0.05ml三氯化铁溶液的乙醇溶液，其浓度为0.50M，显色10min后，用紫外分光光度计测定520nm处的吸光度值。结果表明，其范围从20℃变化到60℃时与之相对应吸收值不断升高，继续升高到80℃与之相对应吸收值则反而减小。所以，最理想温度是60℃。
表3水浴温度优化
实施例5紫外分光光度计法和HPLC法测定腈水解酶活性比较
为了证明使用紫外分光光度法是否能准确测定有机酸的含量，对不同反应样品亦使用HPLC法进行分析测试。此实验中高效液相色谱柱选用HypersilBDSC18，流动相则选用24:76的乙腈-KH2PO4(v/v，pH2.0)，流速为1mL/min，检测波长为215nm，进样量为20μL。实验结果如表4所示，羟肟酸铁比色法与HPLC法测定活力的结果比较一致，由此进一步说明了此法操作简单，快速，精确，可将其用于有机酸含量的广泛测定。
表4紫外分光光度计法和HPLC法测定腈水解酶活性比较
实施例6RSD的研究
体系1：做6个平行样，分别将70mM和100mM的1-氰基-环己基-乙酸于5mL的离心管中，再取一定量的50mM的加腈转化液于离心管中，涡旋搅拌混匀，稀释合适的倍数，取1mL的稀释液于5mL的离心管中，根据案例4确定的方法测定520nm处吸收值。
体系2：再取一定量50mM的加腈转化液于离心管中，稀释合适的倍数，取1mL的稀释液于5mL的离心管中，体系2同样依据案例4确定的方法测定520nm处吸收值。
可根据体系1和体系2吸光度的大小计算出用此方法测定的1-氰基-环己基-乙酸的浓度，进而计算出几个平行样间的RSD，计算公式如下公式(1)和公式(2)：
式中RSD表示相对标准偏差，SD表示标准偏差，xi表示物料中每次浓度的各次测量值(i表示1～n)，x表示各次测量浓度的平均值，n表示测量次数。
结果如表4所示，羟肟酸铁比色法测定的RSD是0.6892％～1.8250％。说明了此法操作准确且精确，可用于有机酸含量的测定。
表4测定羟肟酸铁比色法的RSD
实施例7加标回收率的考察
体系1：做6个平行样，分别将30mM和70mM的1-氰基-环己基-乙酸于5ml的离心管中，再取一定量的50mM的加腈转化液于离心管中，涡旋搅拌混均，稀释合适的倍数，取1mL的稀释液于5mL的离心管中，依据案例4确定的方法进行测定在520nm下吸光度的转变过程。体系2：取稀释合适倍数且一定量50mM加腈转化液到EP管内，体系2同样案例4确定的方法测定520nm下吸收值的大小。可根据体系1和体系2吸光度的大小计算出用此方法测定的1-氰基-环己基-乙酸的浓度，进而计算出加标回收率，计算公式如下公式(3)：
公式(3)
式中A表示测定样品中的酸浓度，B表示实际加入的酸浓度，C表示实际加入的酸浓度和样品中的酸浓度的总和。
结果如表5所示，羟肟酸铁比色法测定的回收率是99％～102％，HPLC测定的回收率是95％～100％，HPLC法测定按实施例5中所述的分析方法进行操作。此法测得的回收率都与HPLC法测定相近，由此说明了此法操作准确且精确，可用于有机酸含量的测定。
表5羟肟酸铁比色法的回收率
实施例8腈水解酶对不同腈类底物酶活力测定
将含有腈水解酶基因的大肠杆菌静息细胞重悬于5mL0.1M磷酸盐缓冲溶液，并加入适量1-氰基-环己基乙腈，扁桃腈、苯甲腈、乙腈和烟腈(终浓度均50mM)，置于30℃、180r/min的摇床上反应10min，用甲醇终止反应，4℃离心，得上清液，再用双蒸水稀释5倍，即为腈水解酶水解腈类化合物的样品。对所得样品用案例7所确定的分光光度计法测定腈水解酶对不同底物的活力。结果如附图1所示，说明本案例所用的产腈水解酶大肠杆菌静息细胞能够水解多种腈类化合物，具有较广泛的底物谱。其对1-氰基-环己基乙腈，扁桃腈、苯甲腈、乙腈及烟腈的活力分别为253U/L，487U/L，565U/L，361U/L和1090U/L，其对烟腈的活力较其他腈类化合物要高。本案例的结果说明本发明的方法可广泛用于有机酸含量测定操作，具有简单，快速，精确等优点。
以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种快速检测腈水解酶活性的方法，其特征在于：首先利用腈水解酶催化腈类化合物发生水解反应，水解产物经终止反应、稀释后，加入含有盐酸羟胺和二环己基碳二亚胺的乙醇溶液，震荡混均，水浴加热后加入三氯化铁的乙醇溶液，待充分反应后，用紫外分光光度计测定520nm处的吸光度值，根据吸光度值的大小可计算出腈水解酶活性的大小。
2.如权利要求1所述的一种快速检测腈水解酶活性的方法，其特征在于：所述的腈类化合物为扁桃腈、烟腈、苯甲腈、1-氰基-环己基乙腈或乙腈。
3.如权利要求1所述的一种快速检测腈水解酶活性的方法，其特征在于包括如下步骤：
1）一个利用腈水解酶催化水解腈类化合物的步骤；采用磷酸盐缓冲溶液重新悬浮静息细胞，然后加入底物腈，在摇床上转化反应；
2）将催化水解腈类化合物的样品进行处理的步骤；将步骤1）的反应样品用甲醇终止反应，离心，得上清，上清再用双蒸水稀释4~6倍，即为转化反应后的样品；
3）向步骤2）所得的反应样品中加入三倍体积的盐酸羟胺的乙醇溶液，所述的盐酸羟胺乙醇溶液的浓度为1～9mM，接着加入样品体积五分之一体积的DCC的乙醇溶液，DCC的乙醇溶液的浓度为0.2M；将该混合液震荡混匀，恒温加热，温度范围为20～80℃，加热10～40min，水浴完成后接着加入样品体积二十分之一体积的三氯化铁溶液的乙醇溶液，所述的三氯化铁溶液的乙醇溶液的浓度为0.1~1.0M，显色反应10min，用紫外分光光度计测定520nm处的吸光度值，根据吸光度值的大小可计算出腈水解酶活性的大小。
4.如权利要求3所述的一种快速检测腈水解酶活性的方法，其特征在于：所述的盐酸羟胺乙醇溶液的浓度为4mM。
5.如权利要求3所述的一种快速检测腈水解酶活性的方法，其特征在于：所述的恒温加热条件为60℃。
6.如权利要求3所述的一种快速检测腈水解酶活性的方法，其特征在于：所述的三氯化铁溶液的乙醇溶液的浓度为0.5M。
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