CN1945288A - 一种腈水解酶活性的荧光检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种腈水解酶活性的荧光检测方法，所述方法是以腈水解酶水解荧光探针形成荧光物质，测定荧光强度，获得腈水解酶活性数据；所述荧光探针为水杨腈类化合物；所述水杨腈类化合物结构如式(Ⅰ)所示。本发明的有益效果主要体现在：(1)所用荧光探针制备所需要的设备简单，操作过程简便，原料来源都已商品化容易得到，并且所制备的这种新型的腈水解酶荧光探针性质很稳定，纯度也很高(99％以上)；(2)与目前所用的检测腈水解酶活性的基本方法——HPLC法相比较，其精确度、灵敏度和检测速率(可以同时检测96种腈水解酶的活性，耗时仅需几分钟)都有很大的提高。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种腈水解酶活性的荧光检测方法，尤其是一种以水杨腈类化合物为荧光探针的腈水解酶活性的荧光检测方法。
(二)背景技术
腈水解酶是一类非常重要的水解酶，它可将腈基直接水解为羧酸和铵。研究表明，在生物体内它参与多种重要物质的生物合成，如植物荷尔蒙以及3-羧基吲哚。此外，腈水解酶作为一种生物催化剂，在羧酸及衍生物的不对称合成中占有极其重要的地位。
目前对于腈水解酶活性的检测，基本上采用高效液相色谱。但是这种方法费时费力，并不适合高通量检测。最近，一些新的检测方法，例如Berthelot法和Fourier-transform IR的腈水解酶催化活性实时探测法得到了一定的应用。但是这两种方法本身都存在着较大的缺陷：前者是将腈水解后释放的NH3与苯酚/次氯酸试剂作用，在640nm处测定其分光度，这个方法的最大缺点是它的灵敏度低，并且需要腐蚀性的试剂，这限制了它的大规模应用。后者是利用了硅探针，尽管这个方法和腈水解反应的动力学契合得比较好，但是却受到了设备方面的限制，而且硅探针还不能做到十分有效，这些都降低了这些方法的有用性。
因此，设计出一种更为快速、灵敏、有效的腈水解酶的检测方法是相当必要和迫切的，比较好的选择是应用荧光探针技术。但是，不论是在国内还是国际上，通过荧光探针检测和分析腈水解酶的理论和方法都是极为缺少的，到目前为止还未有一种荧光探针可直接用来探测腈水解酶活性。
(三)发明内容
本发明即是为了提供一种快速、灵敏、高效的腈水解酶活性的荧光检测方法。
为达到发明目的本发明采用的技术方案是：
一种腈水解酶活性的荧光检测方法，所述方法是以腈水解酶水解荧光探针形成荧光物质，测定荧光强度，获得腈水解酶活性数据；所述荧光探针为水杨腈类化合物；所述水杨腈类化合物结构如式(1)所示：
式中，R为H、或Cl、或Br、或F、或OCH3、或CH3、或Ph、或COOH、或COOCH3、或COOC2H3。
所述的方法为将可能含有腈水解酶的待测样品溶于EP管中，取部分放入Tris缓冲液(pH8.0)中，置于恒温水浴摇床中，30℃预热后，加入水杨腈类化合物反应，反应结束后，在全功能荧光分光光度计中的96孔筛板中依次加入梯度浓度的反应液、Tb3+溶液、EDTA，用全功能荧光分光光度计检测。
所述的水杨腈类化合物优选为水杨腈、或5-氯水杨腈、5-氟水杨腈。
所述的方法为将可能含有腈水解酶的待测样品溶于1ml EP管中，取100uL放入1ml 50mM Tris缓冲液(pH8.0)中，置于恒温水浴摇床中，30℃预热5min，加入10μl邻羟基苯腈(浓度为0.1mM)反应，反应结束后，在全功能荧光分光光度计中的96孔筛板中依次加入上述转化液200μl，2μlTb3+溶液(0.1mol/l)，2μl EDTA(0.1mol/l)，并用NaOH溶液将pH调至12-13，用全功能荧光分光光度计检测，测知腈水解酶的存在与否或者活性大小。
所述水杨腈类化合物由如下方法制备得到：将所述水杨腈类化合物的原料：水杨醛肟类化合物与乙酸酐混合，于反应器中加热至回流温度下反应8～10小时，蒸馏除去多余乙酸酐，加入NaOH溶液至液体为澄明，再加入无水乙醇至液体呈均一色，于70～85℃水浴反应2～3小时，反应液经分离纯化的到所述的水杨腈类化合物。
所述分离纯化方法如下：往反应液中加入HCl溶液调节pH值为5～6，用乙酸乙酯萃取，萃取得到液体脱水、过滤、蒸干，即得所述水杨腈类化合物。
所述水杨醛肟类化合物制备方法如下：将所述水杨醛肟类化合物前体：水杨醛类化合物与盐酸羟胺混合，加入到NaOH溶液中，于50～60℃水浴中反应2～3小时，加入乙酸调节至中性，于冰浴中析出白色晶体，即为所述水杨醛肟类化合物。
具体的，所述水杨腈类化合物由如下方法制备得到：将物质的量之比为1.2∶1的水杨醛类化合物与盐酸羟胺混合，加入到含有NaOH物质的量为所述水杨醛类化合物物质的量2倍的NaOH溶液中，于50℃水浴中反应2小时，加入质量浓度36％的乙酸调节至中性，于冰浴中析出白色晶体，即为所述水杨醛肟类化合物；将质量比2∶1的水杨醛肟类化合物与乙酸酐混合，于反应器中加热至回流温度下反应8～10小时，蒸馏除去多余乙酸酐，加入质量浓度10％的NaOH溶液至液体为澄明，再加入无水乙醇至液体呈均一色，于80℃水浴反应2小时，反应结束后往反应液中加入质量浓度10％的HCl溶液调节pH值为6，用乙酸乙酯萃取，萃取得到液体加入无水硫酸镁脱水、过滤、蒸干，即得所述水杨腈类化合物。
所述检测方法如下：取腈水解酶发酵液，离心，取沉淀用生理盐水溶解，离心，取沉淀加入pH8.0的Tris缓冲液溶解，加入荧光探针进行反应，反应结束后转化液离心取上清液与Tb3+溶液、EDTA一起加入到全功能荧光分光光度计的96孔筛板中，调pH值至12～13，检测荧光强度。
或者，所述检测方法如下：取腈水解酶固体酶溶于pH8.0的Tris缓冲液中加入荧光探针进行反应，反应结束后转化液离心取上清液与Tb3+溶液、EDTA一起加入到全功能荧光分光光度计的96孔筛板中，调pH值至12～13，检测荧光强度。
本发明所述的腈水解酶活性的荧光检测方法的有益效果主要体现在：(1)所用荧光探针制备所需要的设备简单，操作过程简便，原料来源都已商品化容易得到，并且所制备的这种新型的腈水解酶荧光探针性质很稳定，纯度也很高(99％以上)；(2)与目前所用的检测腈水解酶活性的基本方法-HPLC法相比较，其精确度、灵敏度和检测速率(可以同时检测96种腈水解酶的活性，耗时仅需几分钟)都有很大的提高。
(四)附图说明
图1为实施例1多种酶荧光检测结果图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
取3.90g的水杨醛和1.86g盐酸羟胺加入0.066mol的氢氧化钠溶液中。然后反应混合液在50℃水浴中搅拌反应2小时，得一颜色(黄色)均一的溶液，用36％的乙酸进行pH的调节，直至中性，在将其置于冰浴中，将会有晶体析出，之后进行过滤，水洗，风干，得到产物2.50g(水杨醛肟)，此产物的产率为67.8％。然后取1.00g水杨醛肟和0.50g乙酐加入反应器中，用油浴(160℃)进行加热搅拌回流，反应10小时。加热回流后，将反应液旋转蒸馏，蒸馏掉未反应的乙酸酐，并向蒸馏后剩下的液体中加入10％的NaOH溶液，直到液体为一澄明液为止，再加入适量的无水乙醇，使液体呈均一色(颜色为黄色)，之后，将液体置于80℃水浴中反应2小时。2小时后，停止反应，并使液体冷却到室温，再向液体中加入10％的HCl溶液，调节pH至弱酸性，然后用乙酸乙酯进行萃取。向萃取后的液体加入无水硫酸镁进行脱水，2分钟后进行过滤，最后将过滤液旋转蒸干，便可以得到白色晶体产物—水杨腈(其纯度可以达到99％以上)。
用制备所得的水杨腈对腈水解酶的活性进行检测(以腈水解酶：Rhrodococcus equi.CCTCC.M.205114为例)：
取腈水解酶发酵液1ml分装于1ml EP管中，9000rpm离心8min，弃上清液，沉淀用1ml0.9％生理盐水溶解，9000rpm离心8min，弃上清液，沉淀加1ml 50mM Tris缓冲液(pH8.0)溶解。置于恒温水浴摇床中，30℃预热5min，此时加入10μl底物水杨腈(浓度为0.1mol/ml)，反应3h。反应结束后，转化液12000rpm离心4min，取上清。与全功能荧光分光光度计中的96孔筛板中依次加入上述转化液200μl，2μlTb3+溶液(0.1mol/l)，2μlEDTA(0.1mol/l)，并用NaOH溶液将pH调至12-13，用全功能荧光分光光度计检测。
实验证明，只要存在微量的腈水解酶(10-5mol/ml)，就能高效的水解荧光探针，通过全功能微孔板检测系统测定出荧光强度(变化的幅度较大)的变化，直观地得出腈水解酶的活性。
同时，采用其他的酶制剂按照上述方法对底物进行作用。他们分别是脂肪酶(EC 3.1.1.3 Type VII from Candida rugosa，和hog pancreas国药集团化学试剂有限公司)，磷酸酶(Phosphatase，Alkaline bovine)，多种蛋白酶(Protease from Aspergillus oryzae，Protease from Aspergillus sojae，Protease from bovine pancreas)和一种复合酶(BS-031江门市莲江区拜奥生物化学厂)。在Tb3+及EDTA的存在下，只有腈水解酶显示强烈的荧光，结果如图1所示，只有腈水解酶能使底物转化，也说明了起到水解作用的是我们发酵所得的腈水解酶，而其他的酶对底物没有作用。
结论，水杨腈不被上述几种水解酶所水解，从而证明了水杨腈专一的为腈水解酶水解。
实施例2：
在30ml的NaOH溶液(2mol/ml)中先后加入2.00g的5-氯水杨醛和1.00g的盐酸羟胺，(此时所得溶液并不是均一的，其中含有少量颗粒的固体，于是，在反应液中滴加微量无水乙醇使反应液中少量固体颗粒溶解在反应液中)并将反应混合液在50℃水浴中搅拌反应2小时，再加入36％的乙酸调节pH至中性，有白色粉末状固体析出，然后将反应器置于冰水浴中静置一会儿，接着进行过滤，所得白色粉末状固体即为5-氯水杨醛肟，此产物的产率为90％以上。然后取1.00g5-氯水杨醛肟和0.50g乙酐加入反应器中，用油浴(160℃)进行加热搅拌回流，反应7小时。加热回流后，将反应液旋转蒸馏，蒸馏掉未反应的乙酸酐，并向蒸馏后剩下的液体中加入10％的NaOH溶液，直到液体为一澄明液为止，再加入适量的无水乙醇，使液体呈均一色(颜色为黄色)，之后，将液体置于80℃水浴中反应2小时。2小时后，停止反应，并使液体冷却到室温，再向液体中加入10％的HCl溶液，调节pH至弱酸性，然后用乙酸乙酯进行萃取。向萃取后的液体加入无水硫酸镁进行脱水，2分钟后进行过滤，最后将过滤液旋转蒸干，便可以得到白色晶体产物-5-氯水杨腈(其纯度可以达到99％以上)。
用制备所得的水杨腈对腈水解酶的活性进行检测(以腈水解酶：Rhrodococcus equi.CCTCC.M.205114为例)：
取腈水解酶发酵液1ml分装于1ml EP管中，9000rpm离心8min，弃上清液，沉淀用1ml0.9％生理盐水溶解，9000rpm离心8min，弃上清液，沉淀加1ml 50mM Tris缓冲液(pH8.0)溶解。置于恒温水浴摇床中，30℃预热5min，此时加入10μl底物水杨腈(浓度为0.1mol/ml)，反应3h。反应结束后，转化液12000rpm离心4min，取上清。与全功能荧光分光光度计中的96孔筛板中依次加入上述转化液200μl，2μlTb3+溶液(0.1mol/l)，2μlEDTA(0.1mol/l)，并用NaOH溶液将pH调至12-13，用全功能荧光分光光度计检测。
实验证明，只要存在微量的腈水解酶(10-5mol/ml)，就能高效的水解5-氯水杨腈，通过全功能微孔板检测系统测定出荧光强度(变化的幅度较大)的变化，直观地得出腈水解酶的活性。
同时，采用其他的酶制剂按照上述方法对底物进行作用。他们分别是脂肪酶(EC 3.1.1.3 Type VII from Candida rugosa，和hog pancreas国药集团化学试剂有限公司)，磷酸酶(Phosphatase，Alkaline bovine)，多种蛋白酶(Protease from Aspergillus oryzae，Protease from Aspergillus sojae，Protease from bovine pancreas)和一种复合酶(BS-031江门市莲江区拜奥生物化学厂)。结果只有腈水解酶能使5-氯水杨腈转化，同时在Tb3+及EDTA的存在下，显示强烈的荧光，证明(1)5-氯水杨腈也专一的为腈水解酶水解。(2)5-氯水杨酸也能很好的与Tb3+及EDTA结合，发出强烈的荧光。
实施例3：
取1.00g5-氟水杨醛和0.50g盐酸羟胺，先后加入到30ml的NaOH(2mol/ml)溶液中，并将反应混合液在50℃水浴中搅拌反应2小时，再加入36％的乙酸调节pH至中性，有白色粉末状固体析出，然后将反应器置于冰水浴中静置一会儿，接着进行过滤，所得白色粉末状固体即为5-氟水杨醛肟，此产物的产率为95％。然后取1.00g5-氟水杨醛肟和0.50g乙酐加入反应器中，用油浴(160℃)进行加热搅拌回流，反应8小时。加热回流后，将反应液旋转蒸馏，蒸馏掉未反应的乙酸酐，并向蒸馏后剩下的液体中加入10％的NaOH溶液，直到液体为一澄明液为止，再加入适量的无水乙醇，使液体呈均一色(颜色为黄色)，之后，将液体置于80℃水浴中反应2小时。2小时后，停止反应，并使液体冷却到室温，再向液体中加入10％的HCl溶液，调节pH至弱酸性，然后用乙酸乙酯进行萃取。向萃取后的液体加入无水硫酸镁进行脱水，2分钟后进行过滤，最后将过滤液旋转蒸干，便可以得到白色晶体产物-5-氟水杨腈(其纯度可以达到99％以上)。
用制备所得的5-氟水杨腈对腈水解酶的活性进行检测(以腈水解酶：Rhrodococcus equi.CCTCC.M.205114为例)：
取腈水解酶发酵液1ml分装于1ml EP管中，9000rpm离心8min，弃上清液，沉淀用1ml0.9％生理盐水溶解，9000rpm离心8min，弃上清液，沉淀加1ml 50mM Tris缓冲液(pH8.0)溶解。置于恒温水浴摇床中，30℃预热5min，此时加入10μl底物5-氟水杨腈(浓度为0.1mol/ml)，反应3h。反应结束后，转化液12000rpm离心4min，取上清。与全功能荧光分光光度计中的96孔筛板中依次加入上述转化液200μl，2μlTb3+溶液(0.1mol/l)，2μlEDTA(0.1mol/l)，并用NaOH溶液将pH调至12-13，用全功能荧光分光光度计检测。
同时，采用其他的酶制剂按照上述方法对底物5-氟水杨腈进行作用。他们分别是脂肪酶，磷酸酶，多种蛋白酶和一种复合酶，以及腈水合酶。结果只有腈水解酶能使底物转化，并且在Tb3+及EDTA的存在下，显示强烈的荧光，证明5-氟水杨腈也专一的为腈水解酶水解。
Claims (10)
1.一种腈水解酶活性的荧光检测方法，所述方法是以腈水解酶水解荧光探针形成荧光物质，测定荧光强度，获得腈水解酶活性数据；其特征在于：所述荧光探针为水杨腈类化合物；所述水杨腈类化合物结构如式(1)所示：
式中，R为H、或Cl、或Br、或F、或OCH3、或CH3、或Ph、或COOH、或COOCH3、或COOC2H3。
2.如权利要求1所述的腈水解酶活性的荧光检测方法，其特征在于所述的方法为将可能含有腈水解酶的待测样品溶于EP管中，取部分放入pH8.0的Tris缓冲液中，置于恒温水浴摇床中，30℃预热后，加入水杨腈类化合物反应，反应结束后，在全功能荧光分光光度计中的96孔筛板中依次加入梯度浓度的反应液、Tb3+溶液、EDTA，用全功能荧光分光光度计检测。
3.如权利要求1或2所述的腈水解酶活性的荧光检测方法，其特征在于所述的水杨腈类化合物为水杨腈、或5-氯水杨腈、或5-氟水杨腈。
4.如权利要求3所述的腈水解酶活性的荧光检测方法，其特征在于所述的水杨腈类化合物为水杨腈，所述的方法为将可能含有腈水解酶的待测样品溶于1ml EP管中，取100uL放入1ml 50mM pH8.0的Tris缓冲液中，置于恒温水浴摇床中，30℃预热5min，加入10μl浓度为0.1mM水杨腈反应，反应结束后，在全功能荧光分光光度计中的96孔筛板中依次加入上述反应液200μl，2μl浓度0.1mol/l的Tb3+溶液，2μl浓度0.1mol/l的EDTA，并用Na0H溶液将pH调至12-13，用全功能荧光分光光度计检测。
5.如权利要求3所述的腈水解酶活性的荧光检测方法，其特征在于所述水杨腈类化合物由如下方法制备得到：将所述水杨腈类化合物的原料：水杨醛肟类化合物与乙酸酐混合，于反应器中加热至回流温度下反应8～10小时，蒸馏除去多余乙酸酐，加入NaOH溶液至液体为澄明，再加入无水乙醇至液体呈均一色，于70～85℃水浴反应2～3小时，反应液经分离纯化的到所述的水杨腈类化合物。
6.如权利要求5所述的腈水解酶活性的荧光检测方法，其特征在于所述分离纯化方法如下：往反应液中加入HCl溶液调节pH值为5～6，用乙酸乙酯萃取，萃取得到液体脱水、过滤、蒸干，即得所述水杨腈类化合物。
7.如权利要求5所述的腈水解酶活性的荧光检测方法，其特征在于所述水杨醛肟类化合物制备方法如下：将所述水杨醛肟类化合物前体：水杨醛类化合物与盐酸羟胺混合，加入到NaOH溶液中，于50～60℃水浴中反应2～3小时，加入乙酸调节至中性，于冰浴中析出白色晶体，即为所述水杨醛肟类化合物。
8.如权利要求5所述的腈水解酶活性的荧光检测方法，其特征在于所述水杨腈类化合物由如下方法制备得到：将物质的量之比为1.2∶1的水杨醛类化合物与盐酸羟胺混合，加入到含有NaOH物质的量为所述水杨醛类化合物物质的量2倍的NaOH溶液中，于50℃水浴中反应2小时，加入质量浓度36％的乙酸调节至中性，于冰浴中析出白色晶体，即为所述水杨醛肟类化合物；将质量比2∶1的水杨醛肟类化合物与乙酸酐混合，于反应器中加热至回流温度下反应8～10小时，蒸馏除去多余乙酸酐，加入质量浓度10％的NaOH溶液至液体为澄明，再加入无水乙醇至液体呈均一色，于80℃水浴反应2小时，反应结束后往反应液中加入质量浓度10％的HCl溶液调节pH值为6，用乙酸乙酯萃取，萃取得到液体加入无水硫酸镁脱水、过滤、蒸干，即得所述水杨腈类化合物。
9.如权利要求1所述的腈水解酶活性的荧光检测方法，其特征在于所述检测方法如下：取腈水解酶发酵液，离心，取沉淀用生理盐水溶解，离心，取沉淀加入pH8.0的Tris缓冲液溶解，加入荧光探针进行反应，反应结束后转化液离心取上清液与Tb3+溶液、EDTA一起加入到全功能荧光分光光度计的96孔筛板中，调pH值至12～13，检测荧光强度。
10.如权利要求1所述的腈水解酶活性的荧光检测方法，其特征在于所述检测方法如下：取腈水解酶固体酶溶于pH8.0的Tris缓冲液中加入荧光探针进行反应，反应结束后转化液离心取上清液与Tb3+溶液、EDTA一起加入到全功能荧光分光光度计的96孔筛板中，调pH值至12～13，检测荧光强度。
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