CN103336124A - 一种检测朊病毒蛋白(PrPSC)的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种灵敏特异的朊病毒蛋白(PrP^SC)检测方法与检测试剂，其技术要点在于：将蛋白酶处理后的样本流经偶联能与朊病毒蛋白（PrP^SC）特异识别并结合的重组G5P蛋白的Ni⁺-NTA树脂，洗涤后经洗脱缓冲液洗脱并收集，洗脱液所含的朊病毒蛋白（PrP^SC）通过其特异抗体进行免疫印迹检测或电泳后染色可被检测。该方法结合了PrPSC蛋白酶抗性和与G5P高亲和特性，有效消除正常PrP所致的假阳性，特异性强；蛋白纯化效果好，抗体免疫检测灵敏度高；该方法具有广泛的应用前景和价值。该方法的建立对朊病毒的研究、疾病的诊断和控制有着重要的意义。

Description

一种检测朊病毒蛋白(PrPSC)的方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及朊病毒蛋白的分子生物学纯化与检测技术，具体地说是通过表达重组G5P蛋白对朊病毒蛋白高度分离纯化富集，然后利用免疫印迹法检测朊病毒蛋白(PrP^SC)。

背景技术

朊病毒(prion)是由朊蛋白异常折叠形成的一种对理化作用抵抗力极强，并具有传染性的蛋白质颗粒，这种异常折叠朊蛋白(PrP^SC)为蛋白质侵染因子，属于小分子疏水性蛋白质，可侵染动物并在宿主细胞内复制，引起哺乳动物和人的中枢神经系统病变如海绵状脑病(疯牛病)，临床诊断传染性海绵状脑炎(TSE)的确切指标是检测PrP^SC蛋白为阳性。

免疫学方法目前已成为检测朊病毒蛋白的主要方法，例如组织印迹、斑点印迹、免疫印迹、免疫组化、ELISA等。但最重要也是最关键的环节是需要对样品蛋白进行适当的分离纯化及富集，才能提高检出率并排除假阳性。目前，有关PrP^SC的分离纯化及抽提检测方法有两大类型：一类是利用PrP^SC区别与其他蛋白的特殊理化性质完成富集或贫化过程，另一类是利用特定的蛋白质间相互作用对PrP^SC加以捕获。例如：前者最初由Diringer提出的1%sarco syl提取法，需用去垢剂来提取组织匀浆，配以高差速离心浓缩PrP^SC；后来建立的有利用离子交换层析纯化法(奥克塔法马有限公司，专利名称：分离和纯化靶蛋白使其不含PrP^SC的方法，公开(公告)号：CN101842121A)，还有混合有机溶剂提取法(ALPERT ANDREW J，SCHMERR MARYJO，发明名称：Method and kit forextracting prion protein，公开(公告)号：HK1044588A1)以及多离子原料结合法(MICROSENS BIOPHAGE LTD，发明名称：BINDING OF PATHOLOGICAL FORMS OFPRION PROTEINS，公开(公告)号：US2010184054A1)。而近几年国外针对PrP^SC的生物特性利用肽类或蛋白类对其富集检测亦建立了不同的方法，如配体法(NOVARTISVACCINES & DIAGNOSTIC，发明名称：Prion-specific peptide reagents，公开(公告)号：AU2009225337A1；PATHOGEN REMOVAL AND DIAGNOSTI，UNIV NORTHCAROLINA STATE，发明名称：Prion protein ligands and methods of use，公开(公告)号：AU2010201499A1)，结合法(PATHOGEN REMOVAL AND DIAGNOSTI，UNIV NORTHCAROLINA STATE，发明名称：PRION PROTEIN BINDING MATERIALS ANDMETHODS OF USE，公开(公告)号：KR20070117533A)，鸡尾酒法(US AGRICULTURE，发明名称：MONOCLONAL ANTIBODIES AND ANTIBODY COCKTAIL FORDETECTION OF PRION PROTEIN AS AN INDICATION OF TRANSMISSIBLESPONGIFORM ENCEPHALOPATHIES，公开(公告)号：BG106415A)等等，上述各种利用生物蛋白相互作用建立的PrP^SC检测方法能够有效提高蛋白检测特异性，或可通过减少杂蛋白增强检测灵敏度。

近年研究发现，丝状噬菌体gV基因表达的pV蛋白能与PrP^SC蛋白特异结合，而与正常的PrP的结合能力低(Jin-Der Wen，et al．Selection of genomic sequences that bindtightly to Ff gene 5protein：primer-free genomic．Nucleic Acids Research，2004，32(22)：e182；Wen Quan Zou，et al．Antibody to DNA detects scrapie but not normal prionprotein．PANS，2003，101(5)：1380-1385)。本发明拟利用丝状噬菌体gV基因序列通过基因克隆高表达G5P蛋白，并将G5P偶联于固体介质上，利用G5P与PrP^SC高特异性结合，以及正常PrP可被蛋白酶水解而PrP^SC具有蛋白酶抗性的特性，对待测样品中的PrP^SC蛋白进行分离纯化富集，洗脱后免疫印迹检测，建立一种有效针对样本PrP^SC的纯化富集或贫化的方法。

发明内容

本发明的目的是：提供一种分离纯化富集PrP^SC的方法及其检测试剂盒，即通过制备特异识别并富集PrP^SC的重组G5P蛋白，对生物样品中的PrP^SC进行纯化富集，洗脱后进行免疫检测。本发明的目的可以通过下述技术方案来达到。

一种检测朊病毒蛋白(PrP^SC)的方法，包括以下步骤：

步骤一：将待测样本经10μM蛋白酶K消化，使样本中正常的PrP被水解，而PrP^SC因其蛋白酶抗性不被水解，以消除正常PrP的影响；

步骤二：将步骤一处理后的待测样本流经饱和偶联能与朊病毒蛋白(PrP^SC)特异识别并结合的重组G5P蛋白的Ni⁺-NTA树脂，利用重组G5P蛋白捕获待测样本中的朊病毒蛋白(PrP^SC)，所述的能与朊病毒蛋白(PrP^SC)特异识别并结合的重组G5P蛋白是由序列表中序列1基因编码表达的；

步骤三：用洗脱缓冲液对经过步骤二后的饱和偶联能与朊病毒蛋白(PrP^SC)特异识别并结合的重组G5P蛋白的Ni⁺-NTA树脂进行洗脱，收集洗脱液，所述的洗脱缓冲液体系的组成及浓度为：20mmol/L Tris-Cl，150mmol/LNaCl，500mmol/L咪唑，该洗脱缓冲液的pH为7.0；

步骤四：用以下方法检测步骤三收集到的洗脱液中的朊病毒蛋白(PrP^SC)：

(a)洗脱的PrP^SC的为不溶性蛋白，量多则可见白色沉淀；或

(b)洗脱后凝胶电泳经考马斯亮蓝染色出现明显条带即为PrP^SC；或

(c)利用PrP^SC单克隆抗体进行PrP^SC的Western blot检测。

一种用于检测朊病毒蛋白(PrP^SC)的试剂盒，包括：

(a)朊病毒蛋白(PrP^SC)的富集洗脱体系：即饱和偶联能与朊病毒蛋白(PrP^SC)特异识别并结合的重组G5P蛋白的Ni⁺-NTA树脂和洗脱缓冲液，所述的能与朊病毒蛋白(PrP^SC)特异识别并结合的重组G5P蛋白是由序列表中序列1基因编码表达的；所述的洗脱缓冲液体系的组成及浓度为：20mmol/L Tris-Cl，150mmol/L NaCl，500mmol/L咪唑，该洗脱缓冲液的pH为7.0；

(b)蛋白酶K，用于样本处理；

(c)PrP^SC单克隆抗体，用于洗脱的朊病毒蛋白(PrP^SC)免疫印迹检测；

(d)说明书。

一种重组表达载体，其特征在于它与序列表中序列1所示的能与朊病毒蛋白(PrP^SC)特异识别并结合的重组G5P蛋白的编码基因形成重组子可融合表达其所含的His-Tag标签，该载体为pET-28a(+)质粒。

一种能与朊病毒蛋白(PrP^SC)特异识别并结合的重组G5P蛋白的克隆表达方法，包括以下步骤：

步骤1、G5P重组子的构建：

(1)参照GeneBank(Accession No.J02450)上G5P氨基酸序列对应的基因序列，根据大肠杆菌BL21(DE3)密码子偏爱性设计出序列表中序列1所示的重组G5P蛋白表达基因；

(2)通过DNASTAR比对，用引物设计软件设计合成序列表中序列1所示基因的8段引物，并在两端引入同pET-28a(+)质粒一样含有的EcoR I和Xho I酶切位点，以便酶切连接。8段引物如下：

Pr1:CGGAATTCATGATTAAAGTTGAAATT

Pr2:GAAACACCAGAACGGGTGGTGAACTGCGCCTGAGACGGTTTAATTTCAACTTTAATCAT

Pr3:CACCCGTTCTGGTGTTTCTCGTCAGGGCAAACCGTATTCAGTGAATGAGCAGCTGTGTT

Pr4:AATCTTGACCAGCACCGGATACTGATTACCCAGATCAACGTAACACAGCTGCTCATTCA

Pr5:CCGGTGCTGGTCAAGATTACCCTGGATGAAGGTCAGCCGGCCTATGCGCCGGGTCTGTA

Pr6:AACCGAACTGACCAACTTTGAACGAGGACAGATGAACGGTGTACAGACCCGGCGCATAG

Pr7:AAGTTGGTCAGTTCGGTTCCCTGATGATTGATCGTCTGCGCCTGGTTCCGGCGAAATAA

Pr8:ATCTCGAGTTATTTCGCCGGAACCAG

其中Pr1的划线部分是EcoR I酶切位点，Pr8的划线部分是Xho I酶切位点。

(3)利用重叠延伸PCR合成目的基因序列，并PCR扩增目的基因；

重叠延伸PCR反应体系：

PCR扩增目的基因的条件：

(4)分别用Xho I和EcoR I于37℃水浴双酶切目的基因和质粒pET-28a(+)-c(+)4h，各自回收后，将两者用T4 DNA连接酶于16℃连接反应10h，得到重组子pET-28a(+)-c(+)-G5P，琼脂糖凝胶电泳鉴定；

步骤2、G5P重组子的表达：

(1)将重组子pET-28a(+)-c(+)-G5P转化于E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜；

(2)取少量上述菌液按1：100比例转接到新鲜LB液体培养基中，于37℃、200r/min摇床培养至OD600=0.6~0.8；

(3)加入一定量的IPTG(0.2-1.2mM)诱导2-12h；

(4)将诱导后的菌液冰浴30min，8000rpm离心20min，4℃，弃上清；

(5)裂解液(NaH₂PO₄ 20mmol/L，NaCl 0.5mol/L，1%TritonX-100，pH7.4)重悬细菌沉淀，超声波破碎，4℃，12000rpm离心20min，收集上清液；

(6)加入终浓度为5ug/ml的DNase和RNase，30℃水浴30min，消除核酸干扰，收集上清，利用重组G5P蛋白融合表达的His标签与Ni⁺-NTA树脂形成稳定的亲和偶联特性，使用Ni⁺-NTA琼脂糖层析柱纯化上清液中相对分子质量为9.5KD的重组G5P蛋白，并SDS-PAGE分析鉴定。

本发明内容涉及有：

克隆表达可与PrP^SC特异识别并结合的重组G5P蛋白，建立分离纯化和富集生物样本中PrP^SC的方法，该重组蛋白与丝状噬菌体gV基因表达的pV蛋白性质相似，具有特异亲和PrP^SC的能力，而与正常结构PrP结合力低；

重组G5P蛋白的表达基因序列(GeneBank Accession No.J02450)如下：843-5’ATGATTAAAGTTGAAATTAAACCGTCTCAAGCGCAATTTACTACCCGTTCTGGTGTTTCTCGTCAGGGCAAGCCTTATTCACTGAATGAGCAGCTTTGTTACGTTGATTTGGGTAATGAATATCCGGTGCTTGTCAAGATTACTCTCGACGAAGGTCAGCCAGCGTATGCGCCTGGTCTGTACACCGTGCATCTGTCCTCGTTCAAAGTTGGTCAGTTCGGTTCTCTTATGATTGACCGTCTGCGCCTCGTTCCGGCTAAGTAA3’-1106；

与G5P基因序列重组的载体为含有EcoR I和Xho I酶切位点的pET-28a(+)质粒，宿主细胞为BL21(DE3)，诱导表达的条件为：0.2-1.2mM的IPTG诱导2-12h。表达的重组G5P蛋白相对分子质量为9.5KD，结构上含有6×His标签，该标签与Ni⁺-NTA树脂形成稳定的亲和偶联，该偶联可被凝血酶水解，酶切缓冲液为20mmol/L Tris-Cl，150mmol/L NaCl，2.5mmol/LCaCl，PH8.0；

待测样本经10μM蛋白酶K处理后，样本中正常的PrP被水解，而PrP^SC因其蛋白酶抗性不被水解，消除正常PrP的影响。该处理样本温育或流经偶联树脂时G5P可捕获其中的PrP^SC；随后洗脱PrP^SC，洗脱缓冲液为：20mmol/L Tris-Cl，150mmol/L NaCl，500mmol/L咪唑，PH7.0，获得纯化的PrP^SC；

检测PrP^SC方法包括：

(1)洗脱的PrP^SC的为不溶性蛋白，量多则可见白色沉淀；

(2)洗脱后凝胶电泳经考马斯亮蓝染色出现明显条带即为PrP^SC；

(3)利用PrP^SC单克隆抗体进行PrP^SC的Western blot检测。

形成一种用于检测PrP^SC的试剂盒，包括：

(1)PrP^SC的富集洗脱体系，主要为饱和偶联重组G5P的Ni⁺-NTA树脂；

(2)蛋白酶K，用于样本处理；

(3)PrP^SC单克隆抗体；

(4)说明书。

本发明方法所涉及的流程为：

1、通过基因工程构建G5P重组子

2、G5P重组子的表达与诱导优化

3、用树脂纯化并偶联重组G5P蛋白

4、偶联重组G5P蛋白的树脂对经蛋白酶K处理的蛋白样本温育或层析

5、洗涤后洗脱靶蛋白，分析重组G5P蛋白和朊蛋白间的结合力

6、对洗脱的朊蛋白电泳，染色或Western blot检测

本发明通过以下步骤来实现：

一、重组G5P的克隆表达与条件优化

1、G5P重组子的构建

(1)参照GeneBank(Accession No.J02450)上G5P氨基酸序列对应的基因序列，根据大肠杆菌BL21(DE3)密码子偏爱性部分修改基因序列

(2)通过DNASTAR比对，用引物设计软件设计引物并引入酶切位点

(3)利用重叠延伸PCR合成目的基因序列，并PCR扩增目的基因

(4)分别用Xho I和EcoR I于37℃水浴双酶切目的基因和质粒pET-28a(+)-c(+)4h，各自回收后，将两者用T4 DNA连接酶于16℃连接反应10h

2、G5P重组子的表达

(1)将重组子pET-28a(+)-c(+)-G5P转化于E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜

(2)取少量上述菌液按1：100比例转接到新鲜LB液体培养基中，于37℃、200r/min摇床培养至OD600=0.6~0.8

(3)加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG诱导10h

(4)收集上清并提取菌体蛋白进行SDS-PAGE电泳鉴定

3、优化诱导重组G5P蛋白表达条件

(1)IPTG浓度：从0.2mmol/L到1.2mmol/L确定最适浓度

(2)反应时间：从2h到12h确定最适反应时间

4、重组G5P蛋白的纯化与偶联

(1)将诱导后的菌液冰浴30min，8000rpm离心20min，4℃，弃上清

(2)裂解液重悬细菌沉淀，超声波破碎，4℃，12000rpm离心20min，收集上清液

(3)加入终浓度为5ug/ml的DNase和RNase，30℃水浴30min.，收集上清液

(4)利用Ni⁺-NTA层析柱纯化并偶联上清液中带有6×His标签的重组G5P

(5)凝血酶酶切24h水解偶联，离心取上清SDS-PAGE分析鉴定G5P

二、偶联重组G5P的Ni⁺-NTA树脂对PrP^SC的纯化富集

1、生物样本处理

(1)称取适量兔脑样本、研磨、离心收集蛋白并定量，以PrP27-30蛋白掺入其中配成浓度为0.5pmol/L、1pmol/L、2pmol/L、3pmol/L、4pmol/L的模拟检测样本

(2)对上述模拟样本以终浓度为10μM蛋白酶K37℃消化1h，1mM的PMSF终止消化，可消化样本中可能存在的正常的朊蛋白

2、纯化富集程序

(1)取1ml上述处理的蛋白样本和50ul的偶联有重组G5P蛋白的Ni⁺-NTA树脂于1.5mLEP管中震摇2h后8000g离心5min去上清液

(2)洗涤：EP管加入1ml洗涤Buffer，震摇10min，8000g离心1min，去上清，重复三次

(3)洗脱：EP管加入50uL洗脱Buffer，充分混匀，10000g 1min收集洗脱液，蛋白定量

3、重组G5P与PrP^SC蛋白间亲和力测定

(1)将一定含量的重组G5P与Ni⁺-NTA树脂偶联，依次加入不同浓度的PrP27-30蛋白，确定最大结合量，根据Seatchard方程计算结合常数Ka1

(2)同样，将克隆表达带有His标签的重组PrP27-30蛋白与Ni⁺-NTA树脂偶联固定，次加入不同浓度的被凝血酶切除His标签的重组G5P蛋白，确定最大结合量，计算结合常数Ka2

(3)比较Ka1、Ka2，分析G5P与PrP^SC间的亲和力

三、PrP^SC蛋白检测

1、对定量后的洗脱液以10%聚丙烯酰胺凝胶电泳1h，电流20~40mA，电压60~120V

2、凝胶室温考马斯亮蓝染色2h左右，室温脱色4-8h，期间更换脱色液3-4次，直至能够区分蛋白条带

3、或者对凝胶转膜，利用PrP^SC单克隆抗体进行免疫印迹检测即Western blot检测

四、PrP^SC蛋白阳性结果判断

1、如果PrP^SC量多，离心后于EP管底可见沉淀物

2、电泳后考马斯亮蓝染色相应位置出现浓集单一蛋白条带

3、抗体ECL显影出现唯一条带

附图说明

图1重组G5P蛋白的表达及纯化

泳道M：蛋白分子量标准；泳道1：未诱导的BL21(DE)-pET-28a-c(+)全菌蛋白；泳道2：未诱导的BL21(DE)-pET-28a-c(+)-G5P全菌蛋白；泳道3：经IPTG诱导的BL21(DE)-pET-28a-c(+)全菌蛋白；泳道4：经IPTG诱导的BL21(DE)-pET-28a-c(+)-G5P全菌蛋白；泳道5：纯化后的重组G5P蛋白

图2重组G5P富集PrP^SC蛋白后考马斯亮蓝染色

泳道0：诱导表达pET-28a-c(+)-G5P全菌蛋白，泳道M：蛋白分子量标准；泳道1~7：分别偶联不同浓度G5P对同一浓度的PrP^SC富集后收集的洗脱液电泳。

图3重组G5P蛋白富集PrP^SC蛋白后Western blot检测

泳道1~5：依次为掺入PrP27-30浓度为0.5，1，2，3，4pmol/L的兔脑样品富集后免疫印迹检测。

本发明所具有的优点：

该方法结合了PrP^SC蛋白酶抗性和与G5P高亲和特性，有效消除正常PrP所致的假阳性，特异性强；蛋白纯化效果好，抗体免疫检测灵敏度高；该方法具有广泛的应用前景和价值。

具体实施方式

为进一步详细阐述本发明，下面结合具体实施例。

实施例：

材料

1、菌株及动物：大肠杆菌BL21(DE3)菌株，DH5α菌株，质粒pET-28a(+)，1.5-2kg新西兰雄性大白兔

2、试剂：限制性内切酶Xho I、EcoR I；T4连接酶；1 kbplus DNA Ladder；50bpDNA LadderMarker；DL100；PCR产物纯化试剂盒；DNA凝胶回收试剂盒；质粒小量制备试剂盒；Pfu DNA聚合酶；中分子量标准蛋白；蛋白胨；酵母浸提物；Ni⁺-NTA树脂；咪唑；SDS；IPTG；丙烯酰胺；甲叉双丙烯酰胺；Tris碱；甘氨酸；考马斯亮蓝G-250；溶菌酶；TEMED；TritonX-100；蛋白酶K；蛋白G琼脂糖凝胶；Tween-20；辣根过氧化物酶(HRP)；标记羊抗兔IgG；PDVF膜；NC膜；ECL试剂

3、仪器：高速冷冻离心机、自动凝胶成像分析系统、PCR仪、电泳仪、恒温水浴锅、恒温摇床、超净工作台、生化培养箱、双垂直电泳槽、脱色摇床、化学发光成像系统、半湿转膜器

方法与结果

一：偶联重组G5P蛋白的Ni⁺-NTA树脂的制备

1、G5P重组子的构建

(1)参照GeneBank上G5P氨基酸序列对应的基因序列，根据大肠杆菌BL21(DE3)密码子偏爱性部分修改基因序列

(2)通过DNASTAR比对，用引物设计软件设计引物并引入酶切位点

(3)利用重叠延伸PCR合成目的基因序列，并PCR扩增目的基因

(4)分别用Xho I和EcoR I于37℃水浴双酶切4h目的基因及质粒pET-28a(+)-c(+)，各自回收后，将酶切回收的目的基因和质粒用T4 DNA连接酶于16℃进行连接反应10h

2、G5P重组子的表达

(1)将重组子pET-28a(+)-c(+)-G5P转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜

(2)取少量上述菌液按1：100比例转接到新鲜LB液体培养基中，于37℃、200r/min摇床培养至OD600=0.6~0.8

(3)在含重组子的菌液中加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG诱导10h

(4)收集菌体，提取蛋白进行SDS-PAGE电泳检测(图1)

3、优化诱导表达重组G5P蛋白的条件

诱导剂IPTG浓度从0.2mmo/L到1.2mmo/L诱导2h到12h，结果显示0.8mmol/LIPTG诱导6h表达量最高

4、重组G5P蛋白的纯化与偶联

(1)将诱导后的菌液冰浴30min，8000r/min离心20min，4℃，弃上清

(2)细菌沉淀用裂解液(50mmoL/L Tris-Cl pH8.0，2mmoL/L EDTA，1%TritonX-100)重悬，超声波破碎(工作5s，间歇5s，功率200W，60次)，于4℃，12000r/min离心20min，收集细胞上清液

(3)加入终浓度为5ug/ml的DNase和RNase，30℃水浴30min

(4)利用Ni⁺-NTA亲和层析柱结合带有6×His标签的G5P性质，纯化并偶联上清液中的重组G5P目的蛋白

(5)重组G5P蛋白的鉴定：凝血酶水解偶联，酶切24h，10000g离心10min，取上清进行SDS-PAGE分析(图1)

二、偶联重组G5P蛋白的Ni⁺-NTA树脂对PrP^SC的纯化富集

1、生物样本处理

(1)称取适量兔脑样本、研磨、离心收集蛋白并定量，以PrP27-30蛋白掺入其中配成浓度为0.5pmol/L、1pmol/L、2pmol/L、3pmol/L、4pmol/L的模拟检测样本

(2)对上述模拟样本以终浓度为10μM蛋白酶K37℃消化1h，1mM的PMSF终止消化

2、纯化富集程序

(1)取1ml上述处理的蛋白样本和50ul的偶联有重组G5P蛋白的Ni⁺-NTA树脂于1.5mLEP管中震摇2h后8000g离心5min去上清液

(2)洗涤：EP管加入1ml洗涤Buffer(20mmol/L Tris-Cl，150mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑，PH7.0)，震摇10min，8000g离心1min，去上清，重复三次

(3)洗脱：EP管加入50uL洗脱Buffer(20mmol/L Tris-Cl，150mmol/LNaCl，500mmol/L咪唑，PH7.0)，充分混匀，10000g 1min收集洗脱液，即为纯化富集后的目的蛋白，进行蛋白定量

3、重组G5P与PrP^SC蛋白间结合力测定

(1)将一定含量的重组G5P与Ni⁺-NTA树脂偶联，依次加入不同浓度的PrP27-30蛋白，确定最大结合量，根据Seatchard方程计算结合常数Ka1=1.019×10⁵mol/L

(2)同样，将克隆表达带有His标签的重组PrP27-30蛋白与Ni⁺-NTA树脂偶联固定，依次加入不同浓度的被凝血酶切除His标签的重组G5P蛋白，确定最大结合量，计算结合常数Ka2=1.167×10⁵mol/L

(3)分析比较Ka1、Ka2，重组G5P与PrP^SC间的结合常数Ka值均较大，约为10⁵，数值接近，可以判断重组G5P蛋白与PrP^SC间有较好的结合能力且结果可靠

三、富集后PrP^SC的免疫印迹检测

1、SDS-PAGE电泳：取10~20ul富集后的样本蛋白煮沸5min，上样，60~120V电泳60min

2、电转移：转膜仪中10mA，电转20min，将分离胶上蛋白转至PDVF或NC膜上

3、抗体封闭：TBS-Tween洗涤PVDF膜，37℃BSA封闭1h缓摇，然后PrP^SC抗体(1：100~1000)4℃封闭过夜，一抗封闭完后TBS-Tween洗3次，用二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(1：1000)37℃平摇封闭1h

4、ECL显影：加入ECL显色液，置于化学发光成像系统中观察结果

四、PrP^SC蛋白阳性结果判断：

1、聚丙烯酰胺凝胶电泳后考马斯亮蓝染色相应位置出现条带即为PrP^SC蛋白(图2)

2、ECL显影PDVF或NC膜上出现唯一条带时即为G5P富集后的PrP^SC蛋白，纯化富集后，免疫印迹检出限为1pmol/L(图3)。

序列表

 

Claims (4)

1.一种检测朊病毒蛋白(PrP^SC)的方法，包括以下步骤：

步骤一：将待测样本经10μM蛋白酶K消化，使样本中正常的PrP被水解，而PrP^SC因其蛋白酶抗性不被水解，以消除正常PrP的影响；

步骤二：将步骤一处理后的待测样本流经饱和偶联能与朊病毒蛋白(PrP^SC)特异识别并结合的重组G5P蛋白的Ni⁺-NTA树脂，利用重组G5P蛋白捕获待测样本中的朊病毒蛋白(PrP^SC)，所述的能与朊病毒蛋白(PrP^SC)特异识别并结合的重组G5P蛋白是由序列表中序列1基因编码表达的；

步骤三：用洗脱缓冲液对经过步骤二后的饱和偶联能与朊病毒蛋白(PrP^SC)特异识别并结合的重组G5P蛋白的Ni⁺-NTA树脂进行洗脱，收集洗脱液，所述的洗脱缓冲液体系的组成及浓度为：20mmol/L Tris-Cl，150mmol/LNaCl，500mmol/L咪唑，该洗脱缓冲液的pH为7.0；

步骤四：用以下方法检测步骤三收集到的洗脱液中的朊病毒蛋白(PrP^SC)：

(a)洗脱的PrP^SC的为不溶性蛋白，量多则可见白色沉淀；或

(b)洗脱后凝胶电泳经考马斯亮蓝染色出现明显条带即为PrP^SC；或

(c)利用PrP^SC单克隆抗体进行PrP^SC的Western blot检测。

2.一种用于检测朊病毒蛋白(PrP^SC)的试剂盒，包括：

(a)朊病毒蛋白(PrP^SC)的富集洗脱体系：即饱和偶联能与朊病毒蛋白(PrP^SC)特异识别并结合的重组G5P蛋白的Ni⁺-NTA树脂和洗脱缓冲液，所述的能与朊病毒蛋白(PrP^SC)特异识别并结合的重组G5P蛋白是由序列表中序列1基因编码表达的；所述的洗脱缓冲液体系的组成及浓度为：20mmol/L Tris-Cl，150mmol/L NaCl，500mmol/L咪唑，该洗脱缓冲液的pH为7.0；

(b)蛋白酶K，用于样本处理；

(c)PrP^SC单克隆抗体，用于洗脱的朊病毒蛋白(PrP^SC)免疫印迹检测；

(d)说明书。

3.一种重组表达载体，其特征在于它与序列表中序列1所示的能与朊病毒蛋白(PrP^SC)特异识别并结合的重组G5P蛋白的编码基因形成重组子可融合表达其所含的His-Tag标签，该载体为pET-28a(+)质粒。

4.一种能与朊病毒蛋白(PrP^SC)特异识别并结合的重组G5P蛋白的克隆表达方法，包括以下步骤：

步骤1、G5P重组子的构建：

(1)参照GeneBank(Accession No.J02450)上G5P氨基酸序列对应的基因序列，根据大肠杆菌BL21(DE3)密码子偏爱性设计出序列表中序列1所示的重组G5P蛋白表达基因；

(2)通过DNASTAR比对，用引物设计软件设计合成序列表中序列1所示基因的8段引物，并在两端引入同pET-28a(+)质粒一样含有的EcoR I和Xho I酶切位点，以便酶切连接。8段引物如下：

Pr1:CGGAATTCATGATTAAAGTTGAAATT

Pr2:GAAACACCAGAACGGGTGGTGAACTGCGCCTGAGACGGTTTAATTTCAACTTTAATCAT

Pr3:CACCCGTTCTGGTGTTTCTCGTCAGGGCAAACCGTATTCAGTGAATGAGCAGCTGTGTT

Pr4:AATCTTGACCAGCACCGGATACTGATTACCCAGATCAACGTAACACAGCTGCTCATTCA

Pr5:CCGGTGCTGGTCAAGATTACCCTGGATGAAGGTCAGCCGGCCTATGCGCCGGGTCTGTA

Pr6:AACCGAACTGACCAACTTTGAACGAGGACAGATGAACGGTGTACAGACCCGGCGCATAG

Pr7:AAGTTGGTCAGTTCGGTTCCCTGATGATTGATCGTCTGCGCCTGGTTCCGGCGAAATAA

Pr8:ATCTCGAGTTATTTCGCCGGAACCAG

其中Pr1的划线部分是EcoR I酶切位点，Pr8的划线部分是Xho I酶切位点。

(3)利用重叠延伸PCR合成目的基因序列，并PCR扩增目的基因；

重叠延伸PCR反应体系：

PCR扩增目的基因的条件：

(4)分别用Xho I和EcoR I于37℃水浴双酶切目的基因和质粒pET-28a(+)-c(+)4h，各自回收后，将两者用T4DNA连接酶于16℃连接反应10h，得到重组子pET-28a(+)-c(+)-G5P，琼脂糖凝胶电泳鉴定；

步骤2、G5P重组子的表达：

(1)将重组子pET-28a(+)-c(+)-G5P转化于E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜；

(2)取少量上述菌液按1：100比例转接到新鲜LB液体培养基中，于37℃、200r/min摇床培养至OD600=0.6~0.8；

(3)加入一定量的IPTG(0.2-1.2mM)诱导2-12h；

(4)将诱导后的菌液冰浴30min，8000rpm离心20min，4℃，弃上清；

(5)裂解液(NaH₂PO₄20mmol/L，NaCl 0.5mol/L，1%TritonX-100，pH7.4)重悬细菌沉淀，超声波破碎，4℃，12000rpm离心20min，收集上清液；

(6)加入终浓度为5ug/ml的DNase和RNase，30℃水浴30min，消除核酸干扰，收集上清，利用重组G5P蛋白融合表达的His标签与Ni⁺-NTA树脂形成稳定的亲和偶联特性，使用Ni⁺-NTA琼脂糖层析柱纯化上清液中相对分子质量为9.5KD的重组G5P蛋白，并SDS-PAGE分析鉴定。

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