CN1820202A - 用于检测朊病毒蛋白的致病形式的方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于检测样品中的朊病毒蛋白的致病形式的方法，所述方法包括：提供一种容器；预处理该容器以在该容器的表面上沉积一种纤维素衍生物的包被，所述纤维素衍生物能促使致病性朊病毒蛋白优于细胞朊病毒蛋白结合到所述容器表面上；在所述容器中温育所述样品以将存在于该样品中的任何致病性朊病毒蛋白结合到所述容器表面上；如果存在被固定化的致病性朊病毒蛋白，则使用能结合致病性朊病毒蛋白的抗朊病毒抗体以合适的标记试剂标记所得被固定化的致病性朊病毒蛋白；以及检测是否存在附着于所述容器表面的标记试剂。通过增强致病性朊病毒蛋白的结合和/或减少细胞(非致病性)朊病毒蛋白的结合，用硝化纤维素包被微量滴定板孔的表面使得可以通过ELISA检测对可疑样品中的致病性朊病毒，尤其是在用酶(例如蛋白酶K)对该样品进行酶消化后，进行定量。

Description

用于检测朊病毒蛋白的致病形式的方法
技术领域：
本发明涉及朊病毒疾病的领域。这些疾病，也被叫做传染性海绵状脑病(TSE)，包括牛海绵状脑病(BSE)或牛的疯牛病、羊搔痒症和人的克雅氏病(CJD)。
更特别地，本发明涉及诊断方法领域和朊病毒疾病或TSE的诊断。典型地，这样的方法期望检测天然的(非致病性)朊病毒蛋白的(致病性)构象异构体(conformer)，尤其是在动物或人脑中，在淋巴液中；或在可能发现这样的构象异构体的体液中，例如血液、血浆、血清或尿液。
背景技术：
本发明涉及在组织样品和其它生物学样品(例如体液)中诊断朊病毒疾病或TSE的方法。
朊病毒疾病或TSE是一组致死性、非炎症性的神经退行性紊乱，例如牛的BSE、羊搔痒症和人的CJD1。朊病毒疾病是传染性疾病，被推测是通过天然存在的朊病毒蛋白(PrP)的构象异构体进行传播，但是朊病毒疾病也可以自发发生或由于遗传诱因而发生。TSE的特征在于其较长的潜伏期(例如在人＞10年)，并典型地使得其构象异构体(朊病毒蛋白的致病形式或搔痒症形式，PrPSc)在大脑中蓄积，有时也在淋巴组织中蓄积2，3。
朊病毒蛋白是一种内源性蛋白，在正常条件下也被表达于脑和各种其它组织中。该PrPC(代表正常或细胞朊病毒蛋白)和致病形式或搔痒症形式PrPSc是同一蛋白的不同构象。此外，PrPC和PrPSc在其物化特性和生化特性上有所不同：PrPC是可溶的，以非-团聚形式存在，并且对于蛋白酶的降解敏感；而PrPSc是不可溶的，以团聚形式存在，并且对于蛋白酶的降解相对耐受4。PrPC和PrPSc之间的直接的蛋白-蛋白接触被假设成是诱导PrPC到PrPSc的构象变化所必需的。最后，PrPSc形成团聚体并在脑中蓄积。在该病的最后阶段，在脑中发生神经退行性改变，这与几种神经功能异常和最终的死亡联系起来。
各种动物物种的PrP基因已经被克隆并测序5。该蛋白在一个单独的外显子内被编码，其由一长N-末端信号序列及随后的约250个氨基酸残基所组成。C-末端含有一约22个残基的序列，其编码糖基磷脂酰肌醇锚的连接位点，该位点被多种中其它膜蛋白共享。此外，该蛋白含有一个二硫键和两个潜在的天冬酰胺-糖基化位点。该蛋白的序列在不同的动物物种间高度保守。
尽管已经鉴定到了PrPSc和PrPC在二级结构上的差异，但与PrPC相比，PrPSc增强的团聚性和蛋白水解抗性的结构基础仍未被解析。此外，缺乏存在PrPSc的不同毒株，即具有不同的潜伏期的朊病毒的分子基础；尽管这些毒株被假定为很可能代表了在构象上具有细微差别的PrPSc。6
TSE诊断的关键是利用例如免疫组织化学或蛋白质印迹对脑中的PrPSc进行检测。在更容易获得的样品，优选血液中的PrPSc的检测也将辅助TSE的诊断。但是仅能得到非常不完善的数据表明PrPSc存在于血液和尿液中。7，8，9，10多克隆和单克隆抗体常被用于体外诊断方法中，11，12但是在迄今为止的文献中所描述的绝大多数抗朊病毒抗体在PrPC和PrPSc之间没有区别。已有一些描述构象异构体特异性抗体的文章和专利，但是不适用于是常规的免疫诊断。13
为了克服所使用的抗体的缺乏特异性的问题，诊断方法主要是基于PrPC和PrPSc在物化和生化特性上的差异。一个被广泛使用的鉴别方法是用酶例如蛋白酶K(PK)进行消化，所述酶在特定条件下将使得PrPC完全消化，而PrPSc对蛋白酶处理则保留了相对的耐受性。随后，剩下的PrPSc可以用传统的免疫学方法，如蛋白质印迹、ELISA和类似的方法进行检测。其他鉴别构象异构体的方法是基于溶解度、选择性沉淀或团聚状态的差异。
通过蛋白质印迹分析对朊病毒蛋白进行检测是繁重而耗时的方法，因此不是十分有用。免疫测定的使用，例如ELISA，通常是更实用的，但看上去不适于对用PK处理后的样品的PrPSc进行特异性的、灵敏的和可靠的检测。伴随夹层ELISA，PK消化中所用的去污剂产生了一个问题。所述去污剂可能妨碍朊病毒结合到被抗体包被的微量滴定板上。另一个问题是由捕捉抗体对可能残留的PK活性的灵敏性所引起的。直接ELISA的一个问题是PrPSc恰巧仅微弱地结合，尤其是用PK处理后；在所述直接ELISA中，朊病毒蛋白被直接结合到微量滴定板上。这使得对PrPSc进行定量检测实际上是不可能的。不以PK进行酶处理，另外一个难题是PrPC和PrPSc结合到微量滴定板上的强度相同。
DD 236400和EP 211229公开了抗体和其它蛋白质与微量滴定板的孔表面的直接结合通常可以通过采用薄硝化纤维素包被所述表面而被提高。它们不涉及朊病毒蛋白，也未给出硝化纤维素包被的应用会对具有不同构象的蛋白具有不同的影响的任何暗示。
本发明的一个目的是提供一种用于检测样品中的朊病毒蛋白的致病形式的方法，该方法解决了上述的问题。
本发明的一个特别的目的是提供一种诊断方法，该方法使得可以对样品中的PrPSc进行灵敏的和可靠的定量。
本发明的另一个目的是提供一种用于对经过酶例如蛋白酶K进行酶消化的样品中的PrPSc进行定量的ELISA型免疫测定法，所述酶消化使得PrPSc与微量滴定板强结合。
本发明的另一个目的是提供一种用于定量测定朊病毒蛋白的致病形式的ELISA，当能在微量培养板读数计中对酶产生的染色直接读数时获得PrPSc与微量滴定板孔的表面的强结合。
本发明的另一个目的是提供一种用于对朊病毒蛋白的致病形式进行可靠的和灵敏的定量的免疫测定法，其中当天然或细胞朊病毒蛋白与微量滴定板孔的结合被降低时，这些致病形式与微量滴定板孔的结合被增强。
本发明的另一个目的是提供一种用于诊断朊病毒疾病或TSE的改进方法，其中得到假阳性结果和/或假阴性结果的风险被降低。
发明概述：
本发明通过至少一些孔经过预处理的微量滴定板的使用达到上述目的，对所述预处理通过增强朊病毒蛋白的致病形式结合到其上或减少细胞朊病毒蛋白结合到其上，或同时增强朊病毒蛋白致病形式的结合并减少细胞朊病毒蛋白的结合，以促使致病性朊病毒蛋白优于细胞朊病毒蛋白进行结合。本发明使用了一种微量滴定板，该微量滴定板与普通的微量滴定板相比，朊病毒蛋白的致病形式或搔痒症形式(PrPSc)的结合增强。此外，该微量滴定板与普通的微量滴定板相比，优选朊病毒蛋白的正常形式或细胞形式(PrPC)的结合减少。与蛋白质印迹分析相比，这将产生用于PrPSc的更具特异性但也更灵敏、更简洁和更快捷的检测系统。与微量滴定板形式具有的高通量相结合，用如本文所公开的经化学修饰的透明微量滴定板进行的ELISA促进生成了较蛋白质印迹分析更为适合的诊断工具。本发明对于动物和人朊病毒疾病的诊断是有利的。
微量滴定板的化学修饰包括在常规的微量滴定板的孔的底部使用一层清晰的硝化纤维素涂层，或其它适合的纤维素衍生物的清晰涂层，从而产生与蛋白质印迹分析相比更具特异性和灵敏性、但也更简洁、更快捷和更高通量的用于PrPSc的检测系统。
用几种抗体对各种生物学材料中的PrPC和PrPSc的检测被示于经化学修饰的微量滴定板上。本发明将通过以下对本发明的描述而更全面地被理解。
附图说明：
图1：与标准微量滴定板(Std-板)相比，PrPSc和PrPC在硝化纤维素包被的板(NC-板)上的结合特性。用或不用蛋白酶K(PK)处理搔痒症感染的仓鼠的脑(263K毒株)或正常鼠脑的匀浆(0.1％)。随后，将样品在NC-或Std-板上进行温育。用HRP-标记的抗朊病毒抗体检测被结合的朊病毒蛋白，并用TMB底物进行显色。在本申请的其它地方有该方法的详述。
图2：牛(BSE感染的和未感染的)、仓鼠(263K感染的和未感染的)、羊(搔痒症感染的和未感染的)，人(sCJD和vCJD感染的和未感染的)的脑样品中的朊病毒蛋白的分析。用或不用PK处理匀浆(0.1％)。随后将样品在NC-板上进行温育。用HRP-标记的抗朊病毒抗体检测被结合的朊病毒蛋白，并用TMB底物进行显色。在本申请的其它地方有该方法的详述。
图3：用各种抗朊病毒抗体检测NC-板上结合的朊病毒蛋白，用或不用PK处理搔痒症感染的仓鼠的脑(263K毒株)或正常鼠脑的匀浆(0.1％)。随后，将样品在硝化纤维素包被的微量滴定板上进行温育。用各种抗朊病毒抗体(3F4、6H4或1E4)检测被结合的朊病毒蛋白，随后相继用HRP-标记的抗鼠抗体和TMB底物进行温育以显色。在本申请的其它地方有该方法的详述。
发明详述：
许多免疫测定法，尤其那些被用于在生物学材料中的定量的免疫测定法，以特征性的夹层形式存在，其中抗体被包被到聚苯乙烯微量滴定板上。这一所谓的捕捉抗体能够特异性地与蛋白质结合。随后，通过温育含有酶标或荧光标记的第二种蛋白特异性抗体而完成该测定，使得对样品中存在的蛋白的量进行量化成为可能。
对于朊病毒蛋白而言，大多数朊病毒特异性抗体与PrPSc和PrPC两者起反应，且用PK消化对于PrPSc的检测是必需的。对含有PrPSc的样品以PK进行消化以降解PrPC是在用于最佳消化的去污剂的相对高的浓度存在的条件下进行的。但是，这样的去污剂浓度容易妨碍朊病毒结合到被抗体包被的微量滴定板上。需要对这样的夹层测定的反应条件进行复杂的优化才能揭示对于PK消化后残留的朊病毒蛋白的灵敏检测的条件。这一方法中的夹层ELISA的另一个缺点是捕捉抗体对于消化后可能残留的PK活性的灵敏性。对样品进行消化后，加入蛋白酶抑制剂(例如PMSF)以阻断PK活性，但是这些蛋白酶抑制剂的功效是不确定的(未公开的内部数据)。
因此，申请人考虑使用将朊病毒蛋白直接结合到微量滴定板上的方法。导致本发明的产生的最初的观测是存在于生物学材料例如脑均浆中的PrPSc微弱地结合到常规微量滴定板上，尤其是用PK处理后这一发现。因此，PrPSc的定量检测直接应用于常规微量滴定板上实际上是不可能的。直接地(点印)或通过蛋白质印迹技术将朊病毒结合到尼龙(例如PVDF或Biodyne)或硝化纤维素膜上是可能的，但不能对朊病毒蛋白的量进行简单的量化。对于以点印对各种蛋白进行的滴定方法使得半定量成为可能已有记载，但是这些方法非常耗时并难以实现自动化。14，15被置于常规微量滴定板上的醋酸纤维素、肼解dacron或者硝化纤维素的纸穿孔平板也在研究设定中被尝试，使得以微量滴定板形式进行定量成为可能。除制备拥有这样的平板常规微量滴定板繁重而麻烦外，在微量滴定板读数计中对酶产生的染色直接读数是不可能的，因为光束被这些平板所阻挡。所产生的染色必须被转移至空的微量滴定板中以为使得可以进行定量。同样，所谓的ELISPOT平板，即具有尼龙或硝化纤维素底的微量滴定板缺乏透明度，也具有同样的问题。这样的方法不是十分实用，尤其是在高通量应用上，例如筛选被屠宰的牛的脑中的BSE。
在本发明中，硝化纤维素对于致病性朊病毒蛋白的极佳的结合特性与使用微量滴定板形式的明显优点结合起来。将溶解在合适的溶剂(不对平板产生侵蚀)中(例如甲醇或乙醇)的硝化纤维素添加到该微量滴定板的每一孔中，随后将溶剂蒸发。在如本文中所详述的适当的条件下，清晰的硝化纤维素涂层在该微量滴定板的底部形成。病性朊病毒蛋白结合到该硝化纤维素涂层上后，该测定与常规ELISA一样进行。
对常规微量滴定板使用清晰的硝化纤维素涂层非常适合于朊病毒的研究和诊断领域。本发明对于来自人、牛、羊和啮齿动物朊病毒模型的各种材料的致病性朊病毒蛋白的检测被示于以下实施例。
本发明提供了一种用于对样品中的朊病毒的致病形式进行检测的方法，该方法包括：提供一种容器；预处理该容器以在该容器的表面上沉积一种纤维素衍生物的包被，所述纤维素衍生物能促使致病性朊病毒蛋白优于细胞朊病毒蛋白结合到所述容器表面上；在所述容器中温育所述样品以将存在于该样品中的任何致病性朊病毒蛋白结合到所述容器表面上；如果存在被固定化的致病性朊病毒蛋白，则使用能结合致病性朊病毒蛋白的抗朊病毒抗体以合适的标记试剂标记所得被固定化的致病性朊病毒蛋白；以及检测是否存在附着于所述容器表面的标记试剂。
优选地，用于对样品中的朊病毒的致病形式进行检测的该方法是酶联免疫吸附测定(ELISA)方法，该方法包括：提供一种容器；预处理该容器以在该容器的表面上沉积一种纤维素衍生物的包被，所述纤维素衍生物能促使致病性朊病毒蛋白优于细胞朊病毒蛋白结合到所述容器表面上；在所述容器中温育所述样品以将存在于该样品中的任何致病性朊病毒蛋白结合到所述容器表面上；如果存在被固定化的致病性朊病毒蛋白，则使用能结合致病性朊病毒蛋白的抗朊病毒抗体以合适的标记酶标记所得被固定化的致病性朊病毒蛋白；将标记酶的合适底物与该容器温育；和对该底物向有色的、荧光的或发光的产物的转化进行检测。
因此，在一个优选的实施方式中，该方法是使用标记酶作为标记试剂的酶联免疫吸附测定(ELISA)，其中通过将标记酶的合适底物与该容器温育并检测该底物转化为有色的、荧光的或发光的产物来检测是否存在附着于所述容器表面的标记酶。
优选地，所用的纤维素衍生物通过增强致病性朊病毒与容器表面的结合和/或减少细胞(非致病性)朊病毒蛋白与容器表面的结合而促使致病性朊病毒蛋白优于细胞朊病毒蛋白结合到所述容器表面上。因此，得到假阳性或假阴性结果的奉贤被显著地降低，且改善了定量。如将在实施例中进行例证的那样，用纤维素衍生物对固相进行合适的预处理使得细胞朊病毒蛋白的结合大大降低。
优选该容器是透明的。通常，该容器是微量滴定板的孔，所述微量滴定板可以是传统的或非传统的微量滴定板，例如由聚苯乙烯或聚氯乙烯所制备的传统的微量滴定板。
被沉积到该容器表面的纤维素衍生物包被优选是透明的。如果该容器自身及其表面上的包被都是透明的，则有可能使用例如传统的ELISA读数计对结果进行直接读数。
为防止样品随后在容器中被温育时纤维素衍生物被溶解，所用的纤维素衍生物优选不溶于水。合适的纤维素衍生物是硝化纤维素；但也可以使用其它合适的纤维素衍生物，例如火棉胶、醋酸纤维素等等。
优选地，所述预处理包括用溶于非侵蚀性的溶剂，例如甲醇或乙醇中的合适的纤维素衍生物溶液对所述容器进行温育；随后蒸发该溶剂。侵蚀性溶剂，例如丙酮，可能影响容器的期望透明度，并因此较不适合。甲醇是优选的溶剂。蒸发通常在室温下进行；或者在稍高的温度下，直至约50或60℃，或甚至直至100℃。蒸发也可以在降压下进行(真空中)。
已经发现所述溶液可以含有从0.001至20mg/ml的纤维素衍生物。优选地，纤维素衍生物的浓度为至少0.01mg/ml。所述溶液以确保所述纤维素衍生物以从1至20,000ng/mm2的量被沉积到所述容器的表面上，优选从8至16,000ng/mm2。当较小的量被沉积时，致病性朊病毒蛋白的结合的增强以及细胞朊病毒蛋白的结合的降低的程度最低；当更高的量被沉积时，所述包被的透明度变为最佳度以下。通常，对于传统的微量滴定板，以10-250微升溶液，优选25-50微升，填充到每一待包被的孔中。所述包被将通常具有从100至1000nm的厚度，优选300-700nm。
根据本发明，十分优选用能消化细胞朊病毒蛋白的酶预处理所述样品。一种合适的酶是蛋白酶K，但是也可以使用其它能有效地降解任意细胞朊蛋白同时在致病性朊病毒蛋白的降解上远没那么有效的酶。其它有用的酶的一个例子是链霉蛋白酶。
如果处理得当，这样的酶预处理使得正常(细胞)朊病毒蛋白完全消化，同时对致病性朊病毒蛋白的效果被大大地限制。尽管所述酶处理将通常除去所述分子的N-末端部分，大部分致病性朊病毒蛋白(具有约27-30kDa的分子量)保持完整。各种抗朊病毒抗体的表位，例如1E4、3F4和6H4，都被包含在该致病性朊病毒蛋白的蛋白酶K抗性部分。
在本发明的这一实施方式中，非常有利的是纤维素衍生物对所述容器的预处理是通过增强经酶预处理的致病性朊病毒蛋白与所述容器表面的结合和/或减少经酶预处理的细胞朊病毒蛋白与所述容器表面的结合而促使经酶预处理的致病性朊病毒蛋白的结合优于经酶预处理的细胞朊病毒蛋白的结合。因此，得到假阳性或假阴性结果的风险被显著降低，且改善了定量。如将在实施例中所例证的那样，如果不用纤维素衍生物进行预处理，经酶预处理的致病性朊病毒蛋白很难结合到固相上。当使用经过恰当的预处理的固相时，经酶预处理的致病性朊病毒蛋白仍然强结合。在本发明的一个优选的实施方式中，通过短暂地将样品加热至70-100℃以灭活所述酶而将酶消化终止。此后，所述样品被用去污剂在70-100℃进行处理以使得所述样品中的蛋白变性。
被固定化到所述容器表面的任何致病性朊病毒蛋白的标记用酶标抗朊病毒抗体直接进行，或用未标记的抗朊病毒抗体并继以能结合到所述抗朊病毒抗体上的酶标抗体间接地进行。本领域技术人员知悉这些方法及其它替代方式。非常实用的方法是间接方法，因为酶标抗体(例如酶标山羊抗鼠抗体)是一种可被用于众多不同的测定中的广泛有效的试剂。
所述抗朊病毒抗体优选是单克隆抗体。优选抗体结合到致病性朊病毒蛋白的蛋白酶K抗性部分的表位上。合适的例子是单克隆抗体3F4、6H4和1E4。尤其优选使用单克隆抗体1E4(CNCMI-2906)。
可以使用任何传统的或非传统的标记酶。一个众所周知的例子，过氧化物酶，例如辣根过氧化物酶(HRP)，可以被用做标记酶。其它的酶，例如碱性磷酸酶等也可以被替代使用。
待使用的底物依赖于所选择的标记酶。在使用HRP的情况下，可以使用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺作为标记酶的底物。本领域技术人员知悉所述标记酶和所述底物的替代方式。
然而更为优选的是所述酶和底物被选择以例如能对结果容易读数，优选定量读数，也就是说它们被选择以使得所述底物转化产生能通过吸光率的直接读数被检测的有色物质。
尽管本发明包括仅仅对样品中的朊病毒蛋白的致病形式进行定性检测的方法，优选地对样品中的朊病毒蛋白的致病形式进行定量。
在本发明的一个特别的实施方式中，ELISA包括将不对所述容器进行预处理的平行ELISA作为细胞朊病毒蛋白被完全酶消化的对照。
在本发明的方法中，所述样品通常将来自人或动物的脑或淋巴组织。其它种类的样品也是有用的，尤其是体液，例如血液、血浆、脑脊液、唾液、痰液、精液、阴道液和尿液。死后分析为死亡原因和/或(动物的)动物的感染状态的诊断提供了可能。着眼于治疗和/或预防进一步感染的措施而言，活体分析是有用的。
此外，本发明提供了一种用于从含有致病性朊病毒蛋白和细胞朊病毒蛋白的混合物中分离致病性朊病毒蛋白的方法，该方法包括：用优先结合致病性朊病毒蛋白的表面接触所述混合物；和从所述表面分离未结合的物质。
因此，在本发明中，所述表面优选由非水溶性纤维素衍生物例如硝化纤维素所制成或由其所包被。但是，所述表面也可以是由硝化纤维素所制成或由其所包被的珠或柱填充物的表面。
同样在本发明的这一方面，优选所述混合物由能消化细胞朊病毒蛋白的酶，例如蛋白酶K预处理。此外，优选在酶消化后首先灭活消化酶，然后将存在于该混合物中的蛋白质变性。
本发明现在将通过以下实施例进行说明，这些实施例无意于对本发明进行限制。
实施例：
为了证明清晰的硝化纤维素涂层对于微量滴定板的朊病毒结合特性的影响，申请人以硝化纤维素包被的微量滴定板(NC-板)或标准微量滴定板(Std-板)进行了直接ELISA。用或不用PK处理搔痒症感染的仓鼠的脑(263K毒株)或正常鼠脑的匀浆(0.1％)；并在NC-板(0.1％的硝化纤维素包被)或Std-板上进行温育。用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗朊病毒抗体1E4检测被结合的朊病毒蛋白，随后用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)底物进行染色。
如在图1中所示，存在于被PK消化的搔痒症感染的仓鼠脑中的朊病毒蛋白(PrPSc)与NC-板结合，但不与Std板结合。此外，存在于未被消化的正常鼠脑中的朊病毒蛋白(PrPC)与NC-板的结合较与Std-板的结合弱。
为了证明NC-板的朊病毒结合特性，申请人用来自牛(BSE感染的和未感染的)、仓鼠(263K感染的和未感染的)、羊(搔痒症感染的和未感染的)，人(sCJD和vCJD感染的和未感染的)的脑样品进行了直接ELISA。用或不用PK处理这些样品，并对NC-板用0.1％的硝化纤维素包被。用HRP-标记的抗朊病毒抗体1E4检测被结合的朊病毒蛋白，并随后用TMB底物进行显色。
被PK消化的来自TSE-感染的动物或患者的样品被发现呈强阳性，被PK消化的来自未感染的动物或人的样品被发现呈阴性(图2)。所有未被消化的样品被发现呈阳性，这表明了对于特异性检测PrPSc来说，该测定对PK消化的严重依赖性。
为了证明NC-板用于朊病毒蛋白的检测的适合性，申请人使用各种抗朊病毒抗体进行了直接ELISA(图3)。用或不用PK处理搔痒症感染的仓鼠的脑(263K毒株)或正常鼠脑的匀浆(0.1％)。随后，将样品在NC-板上进行温育。用各种抗朊病毒抗体(3F4[DAKO]、6H4[Prionics]或1E4[Sanquin])检测被结合的朊病毒蛋白，并相继用HRP-标记的抗鼠抗体和TMB底物进行温育以显色。
所有抗体对PK-消化的搔痒症感染的仓鼠脑样品的检测均为呈阳性。
方法：
硝化纤维素被溶解在甲醇或乙醇中至终浓度为0.01或20mg/ml。40μl体积的该混合物被添加到96孔微量滴定板(NUNC maxisorptype F96)的每一孔中，并通过在烘箱中于80℃加热该板30-60分钟蒸发掉该溶剂以在该微量滴定板的底部保留一层清晰的硝化纤维素涂层。所使用的硝化纤维素的量为8-16,000ng/mm2。
各种物种的脑样品在磷酸盐缓冲液(pH 7.4的PBS)或蔗糖溶液中被均质化至终浓度为10％(W/V)。用消化缓冲液(100mMTris/HCl，pH 7.5；0.05％ SDS)进一步将这些匀浆稀释至终浓度为0.1％，并用或不用PK在50℃温育30分钟(终浓度为30μg/ml-0.6U/ml)。为终止PK消化，将所述样品加热至96℃，1分钟；然后冷却至室温(RT)。处理后，通过添加样品缓冲液(200mMTRIS/HCl[pH 8.5]，6％ SDS)使体积增强了1/3；并将该混合物于96℃加热10分钟。
随后将40μl处理过样品转移至硝化纤维素包被的微量滴定板(NUNC maxisorp type F96)的孔中，并于室温摇动温育1小时。用洗涤缓冲液(PBS，0.15％ Tween-20)洗涤后，用40μl被稀释在温育缓冲液(PBS，0.15％ Tween-20，0.5％ PEG 4000)中的抗朊病毒抗体于室温温育该板1小时。随后用HRP-标记的山羊-抗鼠抗体洗涤并温育该板1小时。通过于100mM的醋酸盐缓冲液(pH5.5)中的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)/H2O2，以100μl/孔的量对被结合的过氧化物酶进行检测。温育20分钟后，通过添加100μl的1M H2SO4终止酶反应，在Anthos ELISA读数计中读出450nm处的吸光率(690nm被用做参比)。
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Claims (30)

1.一种用于检测样品中的朊病毒蛋白的致病形式的方法，该方法包括：提供一种容器；预处理该容器以在该容器的表面上沉积一种纤维素衍生物的包被，所述纤维素衍生物能促使致病性朊病毒蛋白优于细胞朊病毒蛋白结合到所述容器表面上；在所述容器中温育所述样品以将存在于该样品中的任何致病性朊病毒蛋白结合到所述容器表面上；如果存在被固定化的致病性朊病毒蛋白，则使用能结合致病性朊病毒蛋白的抗朊病毒抗体以合适的标记试剂标记所得被固定化的致病性朊病毒蛋白；以及检测是否存在附着于所述容器表面的标记试剂。
2.权利要求1的方法，其是将标记酶用做标记试剂的酶联免疫吸附测定(ELISA)，其中通过将标记酶的合适底物与该容器温育并检测该底物转化为有色的、荧光的或发光的产物来检测是否存在附着于所述容器表面的标记酶。
3.权利要求1或2的方法，其中所用的纤维素衍生物通过增强致病性朊病毒与容器表面的结合和/或减少细胞朊病毒蛋白与容器表面的结合而促使致病性朊病毒蛋白优于细胞朊病毒蛋白结合到所述容器表面上。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述容器是透明的。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述容器是微量滴定板的孔。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中沉积到所述容器表面上的纤维素衍生物包被是透明的。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所用的纤维素衍生物是不溶于水的。
8.权利要求7的方法，其中所述纤维素衍生物是硝化纤维素。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述预处理包括用溶于非侵蚀性溶剂中的合适的纤维素衍生物溶液温育所述容器，所述溶剂例如是甲醇或乙醇；随后将所述溶剂蒸发。
10.权利要求9的方法，其中所述溶液含有从0.001至20mg/ml的纤维素衍生物。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述纤维素衍生物以从1至20,000ng/mm2的量被沉积到所述容器的表面上。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中用能消化细胞朊病毒蛋白的酶预处理所述样品。
13.权利要求12的方法，其中所述的酶是蛋白酶K。
14.权利要求12或13的方法，其中所述酶消化通过短暂地将所述样品加热至70至100℃的温度以灭活所述酶而被终止。
15.权利要求14的方法，其中在酶失活后，在70至100℃的温度下用去污剂处理所述样品以使样品中的蛋白质变性。
16.权利要求12-15中任一项的方法，其中纤维素衍生物对所述容器的预处理通过增强经酶预处理的致病性朊病毒蛋白与容器表面的结合和/或减少经酶预处理的细胞朊病毒蛋白与容器表面的结合而促使经酶预处理的致病性朊病毒蛋白的结合优于经酶预处理的细胞朊病毒蛋白的结合。
17.权利要求1-16中任一项的方法，其中对被固定化到所述容器表面的任何致病性朊病毒蛋白的标记用酶标抗朊病毒抗体直接进行，或用未标记的抗朊病毒抗体并继以能结合到所述抗朊病毒抗体上的酶标抗体间接地进行。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中过氧化物酶，例如辣根过氧化物酶被用做标记酶。
19.权利要求1-18中任一项的方法，其中3，3′，5，5′-四甲基联苯胺被用做标记酶的底物。
20.权利要求1-19中任一项的方法，其中底物转化生成有色物质，该有色物质通过吸光率的直接读数被检测。
21.权利要求1-20中任一项的方法，其中对样品中的朊病毒蛋白的致病形式进行定量。
22.权利要求1-21中任一项的方法，其中的ELISA包括将不对所述容器进行预处理的平行ELISA作为细胞朊病毒被完全酶消化的对照。
23.权利要求1-22中任一项的方法，其中所述样品来自人或动物的脑或淋巴组织。
24.权利要求1-22中任一项的方法，其中所述样品是体液，例如血液、血浆、脑脊液、唾液、痰液、精液、阴道液或尿液。
25.一种用于从含有致病性朊病毒蛋白和细胞朊病毒蛋白的混合物中分离致病性朊病毒蛋白的方法，该方法包括：用优先结合致病性朊病毒蛋白的表面接触所述混合物；和从所述表面分离未结合的物质。
26.权利要求25的方法，其中所述表面由非水溶性纤维素衍生物例如硝化纤维素所制成或由其所包被。
27.权利要求25或26的方法，其中所述表面是以一层硝化纤维素包被的微量滴定板孔的表面。
28.权利要求25或26的方法，其中所述表面是由硝化纤维素所制成或由其所包被的珠或柱填充物的表面。
29.权利要求25-28中任一项的方法，其中所述混合物由能消化细胞朊病毒蛋白的酶，例如蛋白酶K预处理。
30.权利要求29的方法，其中在酶消化后首先灭活消化酶，然后将存在于该混合物中的蛋白质变性。
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