CN103333095B - 己二酰二d-羟脯氨酸衍生物及其作为核酸疫苗佐剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域。本发明提供了一类己二酰二D-羟脯氨酸衍生物及其药学上可接受的盐，结构通式如下：

Description

己二酰二D-羟脯氨酸衍生物及其作为核酸疫苗佐剂的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一类己二酰二D-羟脯氨酸衍生物及其作为佐剂应用于核酸疫苗以提升疫苗的免疫水平。

背景技术

做为第三代新型疫苗的核酸疫苗，从90年代末诞生起就受到了广泛重视，成为现代疫苗发展的重要方向之一。核酸疫苗从其研发效率，制备工艺，基因可操控性等多个工艺方面均相对于传统疫苗具有显著的优势，尤其是其具有直接转染抗原递呈细胞，通过内源抗原递呈途径诱导细胞免疫的特殊能力使其在预防及治疗胞内菌感染，病毒感染，肿瘤等疾病上具有巨大潜力。然而，近年来核酸疫苗在多项大规模临床实验中却遭遇了致命打击，在啮齿类等小动物上取得的良好效果难以在人类体内重现，必须的免疫剂量的大大增加，使得核酸疫苗的发展受到很大限制，而如何进一步提高人类体内免疫效力也成为了核酸疫苗继续发展中急需解决的关键问题。

已有的研究表明，人血清淀粉样蛋白（SAP）作为一种DNA结合蛋白在核酸疫苗免疫中是一种重要的抑制性屏障（Wang Y,Guo Y,Wang X,Huang J,Shang J and Sun S，Serum amyloid P component facilitates DNA clearance andinhibits plasmid transfection:implications for human DNA vaccine.Gene Therapy，2012；19：70–77）。人SAP与质粒DNA结合，抑制其转入细胞并促使DNA被巨噬细胞吞噬。因此导致质粒DNA的抗原基因表达及诱导的免疫应答也显著下降。研究中采用人SAP的抑制剂己二酰二D-羟脯氨酸能有效地提高核酸疫苗诱导的抗原特异性体液和细胞免疫应答。

己二酰二D-羟脯氨酸（CPHPC）首先由M.B.Pepys等筛选合成（Pepys M，Herbert J,Hutchinson W,et al.Targeted pharmacological depletion of serumamyloid P component for treatment of human amyloidosis.Nature,417:254-259.）。该药物可作为SAP结合淀粉样原纤维的竞争性抑制剂。其与SAP的结合可导致SAP分子之间的交联和二聚体化并在肝脏被快速清除。该CPHPC被作为阿尔兹海默和二型糖尿病中系统性和局部淀粉样变性的候选治疗药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一类己二酰二D-羟脯氨酸衍生物，本发明的另一目的在于提供该类己二酰二D-羟脯氨酸衍生物作为核酸疫苗佐剂的应用。

本发明人首次将己二酰二D-羟脯氨酸（CPHPC）用于疫苗免疫，作为核酸疫苗特异性的佐剂。但生物体内SAP是一种高表达水平的蛋白，对其抑制的效果与核酸疫苗的免疫应答强度密切相关。直接采用CPHPC作为佐剂对核酸疫苗诱导的体液、细胞免疫的增强作用还非常有限，因此有必要筛选更强的SAP抑制物。进一步地，为筛选出对SAP抑制效应更强的抑制物，本发明人在CPHPC的基础上进行了改造和修饰，经过对64种己二酰二D-羟脯氨酸衍生物的合成和筛选，我们发现，其中两个经修饰的CPHPC衍生物较CPHPC作为核酸疫苗佐剂能诱导更为有效的体液和细胞免疫应答。

本发明的第一方面，是提供一类己二酰二D-羟脯氨酸衍生物及其药学上可接受的盐，其结构通式如下：

其中：

化合物1：R₁：S-OH，R₂：R-OCH₃；

化合物2：R₁：R-N₃，R₂：R-F。

化合物1即表1中的化合物38（CPHPC-M38），结构式如下：

命名:

1-[6-(4S-羟基-2R-羧基-1-吡咯烷基)-6-氧代己酰基]-吡咯烷-4R-甲氧基-2R-羧酸¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆,ppm)δ:11.26(brs,2H),4.36(m,2H),3.75～3.55(m,5H),3.35(m,1H),3.26(s,3H),2.34(m,4H),2.07(t,J =7.2Hz,4H),1.63(t,J=7.2Hz,4H)。MS（ESI⁺）m/z：409.23（M+Na⁺，100％）。

化合物2即表1中的化合物63（ CPHPC-M63），结构式如下：

命名：

1-[6-(4R-叠氮基-2R-羧基-1-吡咯烷基)-6-氧代己酰基]-吡咯烷-4R-氟-2R-羧酸

¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆,ppm)δ:11.24(brs,2H),4.35(m,2H),3.81(m,1H),3.65～3.50(m,4H),2.50～2.1(m,5H),2.05(t,J=7.2Hz,4H),1.61(t,J=7.2Hz,4H)。MS（ESI⁺）m/z：422.18（M+Na⁺，100％）。

所述的药学上可接受的盐，还包括其无机碱盐，无机碱包括（但不限于）氢氧化钠、氢氧化钾或其他药用无机碱。

本发明的第二方面，是提供上述的己二酰二D-羟脯氨酸衍生物在制备核酸疫苗佐剂中的应用。

己二酰二D-羟脯氨酸衍生物在制备核酸疫苗佐剂中的应用，所述的核酸疫苗为乙型肝炎核酸疫苗。

本发明合成了65个己二酰二D-羟脯氨酸衍生物，经对核酸疫苗体液免疫应答实验，证实CPHPC-M38和CPHPC-M63与未修饰的CPHPC相比，能显著提高疫苗诱导的特异性抗体滴度。经对核酸疫苗细胞免疫应答实验，证实CPHPC-M38和CPHPC-M63能比未修饰的CPHPC辅助诱导更强的CTL应答水平。

附图说明

图1是小鼠血清抗HBsAg特异性IgG滴度测定结果图

**表示与对照组（hSAP Tg+CPHPC）相比，p<0.01；

图2是小鼠血清抗HBsAg特异性IgG1和IgG2a亚型滴度测定结果图

**表示与对照组（hSAP Tg+CPHPC）相比，p<0.01；

图3是疫苗及佐剂诱导的小鼠脾细胞HBsAg特异性IFN-γ测定结果图

（脾细胞经10μg/ml和1μg/ml，2种不同浓度抗原肽刺激后特异性IFN-γ的蛋白浓度）

**表示与对照组（hSAP Tg+CPHPC）相比，p<0.01；

图4是疫苗及佐剂诱导的小鼠脾细胞HBsAg特异性CTL应答结果图

图中所示为小鼠接种疫苗和不同疫苗佐剂后的特异性CTL应答，横坐标所示为不同的效靶比；纵坐标所示为细胞裂解百分比；

图A为野生型小鼠；图B-E为hSAP转基因小鼠；图C-E分别为核酸疫苗混合不同的佐剂组（CPHPC，CPHPC-M38，CPHPC-M63）；

图中所示实心标志为HBsAg肽刺激后进行检测的单个小鼠样本，空心标志为未经HBsAg肽刺激的阴性对照；

**表示与对照组（hSAP Tg+CPHPC）相比，p<0.01。

图5是效靶比为30时不同佐剂组脾细胞HBsAg特异性CTL应答影响的结果图（n=5）。

**表示与对照组（hSAP Tg+CPHPC）相比，p<0.01。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例1:1-[6-[4R-羟基-2R-羧基-1-吡咯烷基]-6-氧代己酰基]-吡咯烷-4R-羟基-2R-羧酸（1）的制备

2.9g（20.0mmol）4R-羟基-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐溶于100mL无水二氯甲烷，于0℃下加入3.5mL二异丙基乙基胺（DIPEA）、1.46g（10.0mmol）己二酸、3.4g（25.2mmol）N-羟基苯并三氮唑（HOBt）及4.8g（25.6mmol）1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl），搅拌反应24h，减压回收溶剂，油状残液加入100mL乙酸乙酯和50mL10％（w/v）柠檬酸水液，充分振摇，分取乙酸乙酯层，并依次用饱和碳酸钠水液、水、饱和食盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥，回收溶剂，再加80mL甲醇及0.5mol/L的氢氧化钠水溶液80mL，搅拌反应2h，稀硫酸调节pH至5～6，用乙酸乙酯萃取（100mL×3），无水Na₂SO₄干燥，回收溶剂后经硅胶H柱色谱分离得白色固体己二酰二-4-羟基-D-脯氨酸12.4g，收率64.5％。MS（ESI+）m/z：395.21（M+Na⁺，100％）。

按实施例1制备方法，用4S-羟基-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4R-叠氮基-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4S-叠氮基-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4R-甲氧基-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4S-甲氧基-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4R-三氟甲基-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4S-三氟甲基-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4R-氟-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4S-氟-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4R-氯-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4S-氯-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4R-溴-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4S-溴-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4R-碘-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐和4S-碘-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐依次代替4R-羟基-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐可分别制得白色固体己二酰二-D-4-取代脯氨酸化合物2、4、5、10、11、13、14、16、17、19、20、22、23、25和26（化学结构式见表1）。

化合物4和5在乙醇溶液中经10%Pd-C催化常压氢化分别定量制得化合物7和8（化学结构式见表1）。

实施例2：1-[6-[4R-羟基-2R-羧基-1-吡咯烷基]-6-氧代己酰基]-吡咯烷-4S-羟基-2R-羧酸（3）的制备

1.45g（10.0mmol）4R-羟基-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐溶于50mL无水二氯甲烷，于0℃下加入2.0mL DIPEA及1.28g（10.0mmol）己二酸酐，搅拌反应24h，再加4S-羟基-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐1.45g（10.0mmol）、1.5mLDIPEA1.7g（12.6mmol）HOBt及2.4g（12.8mmol）EDC·HCl，继续搅拌反应24h，减压回收溶剂，油状残液加入100mL乙酸乙酯和50mL10％（w/v）柠檬酸水液，充分振摇，分取乙酸乙酯层，并依次用饱和碳酸钠水液、水、饱和食盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥，回收溶剂，再加80mL甲醇及0.5mol/L的氢氧化钠水溶液80mL，搅拌反应2h，稀硫酸调节pH至5～6，用乙酸乙酯萃取（100mL×3），无水Na₂SO₄干燥，回收溶剂后经硅胶H柱色谱分离得白色固体己二酰二-4-羟基-D-脯氨酸3（化学结构式见表1）2.6g，收率69.9％。MS（ESI⁺）m/z：395.21（M+Na⁺，100％）。

按实施例2制备方法，以4R-羟基-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐为起始原料，并用4R-叠氮基-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4S-叠氮基-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4R-甲氧基-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4S-甲氧基-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4R-三氟甲基-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4S-三氟甲基-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4R-氟-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4S-氟-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4R-氯-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4S-氯-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4R-溴-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4S-溴-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4R-碘-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐和4S-碘-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐依次代替4S-羟基-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐可分别制得白色固体己二酰二-D-4-取代脯氨酸化合物28、29、36、37、40、41、44、45、48、49、52、53、56和57（化学结构式见表1）。

按实施例2制备方法，以4S-羟基-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐为起始原料，并用4R-叠氮基-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4S-叠氮基-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4R-甲氧基-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4S-甲氧基-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4R-三氟甲基-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4S-三氟甲基-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4R-氟-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4S-氟-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4R-氯-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4S-氯-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4R-溴-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4S-溴-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐、4R-碘-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐和4S-碘-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐依次代替4S-羟基-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐可分别制得白色固体己二酰二-D-4-取代脯氨酸化合物30、31、38、39、42、43、46、47、50、51、54、55、58和59（化学结构式见表1）。

化合物28、29、30和31在乙醇溶液中经10%Pd-C催化常压氢化分别定量制得化合物32、33、34和35（化学结构式见表1）。

实施例3：1-[6-[4R-叠氮基-2R-羧基-1-吡咯烷基]-6-氧代己酰基]-吡咯烷-4S-叠氮基-2R-羧酸（6）的制备

1.70g（10.0mmol）4R-叠氮基-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐溶于50mL无水二氯甲烷，于0℃下加入2.0mL DIPEA及1.28g（10.0mmol）己二酸酐，搅拌反应24h，再加4S-叠氮基-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐1.70g（10.0mmol）、1.5mL DIPEA1.7g（12.6mmol）HOBt及2.4g（12.8mmol）EDC·HCl，继续搅拌反应24h，减压回收溶剂，油状残液加入100mL乙酸乙酯和50mL10％（w/v）柠檬酸水液，充分振摇，分取乙酸乙酯层，并依次用饱和碳酸钠水液、水、饱和食盐水洗涤，无水Na₂SO₄干燥，回收溶剂，再加80mL甲醇及0.5mol/L的氢氧化钠水溶液80mL，搅拌反应2h，稀硫酸调节pH至5～6，用乙酸乙酯萃取（100mL×3），无水Na₂SO₄干燥，回收溶剂后经硅胶H柱色谱分离得白色固体己二酰二-4-叠氮基D-脯氨酸63.3g，收率82.9％。MS（ESI⁺）m/z：445.25（M+Na⁺，100％）。

按实施例3制备方法，以4R-叠氮基-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐为起始原料，并用4R-氟-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐和4S-氟-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐依次代替4S-叠氮基-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐可分别制得白色固体己二酰二-D-4-取代脯氨酸化合物63和65（化学结构式见表1）。化合物6、63和65在乙醇溶液中经10%Pd-C催化常压氢化分别定量制得化合物9、60和62（化学结构式见表1）。

按实施例3制备方法，以4R-甲氧基-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐为原料，并用4S-甲氧基-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐代替4S-叠氮基-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐可制得白色固体己二酰二-D-4-甲氧基脯氨酸化合物12（化学结构见表1）。

按实施例3制备方法，以4R-三氟甲基-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐为原料，并用4S-三氟甲基-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐代替4S-叠氮基-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐可制得白色固体己二酰二-D-4-三氟甲基脯氨酸化合物15（化学结构式见表1）。

按实施例3制备方法，以4R-氟-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐为原料，并用4S-氟-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐代替4S-叠氮基-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐可制得白色固体己二酰二-D-4-氟脯氨酸化合物18（化学结构式见表1）。

按实施例3制备方法，以4R-氯-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐为原料，并用4S-氯-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐代替4S-叠氮基-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐可制得白色固体己二酰二-D-4-氯脯氨酸化合物21（化学结构式见表1）。

按实施例3制备方法，以4R-溴-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐为原料，并用4S-溴-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐代替4S-叠氮基-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐可制得白色固体己二酰二-D-4-溴脯氨酸化合物24（化学结构式见表1）。

按实施例3制备方法，以4R-碘-顺式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐为原料，并用4S-碘-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐代替4S-叠氮基-反式-D-脯氨酸甲酯盐酸盐可制得白色固体己二酰二-D-4-碘脯氨酸化合物27（化学结构式见表1）。

化合物64在乙醇溶液中经10%Pd-C催化常压氢化分别定量制得化合物61（化学结构式见表1）。

表1.本发明合成的己二酰二D-羟脯氨酸衍生物化学结构式中各取代基R₁及R₂的组合

实施例4：己二酰二D-羟脯氨酸衍生物对核酸疫苗体液免疫应答的影响

1、实验材料

1.1试剂

用于小鼠免疫接种的疫苗质粒：是将编码乙肝病毒表面抗原HBs的cDNA插入真核表达载体pVAX1(Invitrogen)多克隆位点，制备DNA疫苗质粒pVAX-HBs（Wang,Y.,D.A.Li,Y.Hey,F.Wang,Y.J.Guo,F.Yang,Q.Zhou,and S.H.Sun.2007.Proteomic analysis of augmented immune responses in mouseby primeand-boost immunization strategy with DNA vaccine coding HBsAg andrHBsAg protein.Vaccine25:8146–8153.）。质粒在大肠杆菌中扩增后，采用Endo-free Plasmid Mega Kit(Qiagen China,Shanghai,China)试剂盒提取质粒（提取步骤按说明书进行操作）。

1.2小鼠

人SAP转基因小鼠（hSAP Tg mice）(Tg[Alb,SAP];C57BL/6,H-2b)由南京大学模式动物研究中心制备。该转基因小鼠含有人SAP（hSAP）全长开放阅读框，具备小鼠白蛋白启动子，能在血清中产生高水平的hSAP。C57BL/6小鼠由上海实验动物中心购得。

1.3动物免疫

SPF级小鼠于无菌条件下饲养。疫苗免疫方案：每只小鼠股四头肌注射50μg pVAX-HBs质粒，共免疫3次，每次间隔2周。采用佐剂CPHPC或CPHPC衍生物的实验组中佐剂剂量为50μg质粒/g体重。

1.4抗体检测方法

HBsAg特异性抗体分析Ag特异性IgG及IgG1和IgG2a的产生情况。免疫后的小鼠于末次免疫接种后2周尾静脉采血，进行ELISA，检测抗HBsAg的特异性抗体滴度。

2、实验结果

将65种经修饰的己二酰二D-羟脯氨酸衍生物（表1）分别作为佐剂与疫苗质粒混合免疫hSAP转基因小鼠，每组5只。末次免疫后14天采血进行抗HBsAg特异性IgG的滴度检测。同时设未修饰的己二酰二D-羟脯氨酸佐剂对照、无佐剂对照以及野生型小鼠免疫疫苗质粒pVAX-HBs的对照。

结果显示，65种经修饰的衍生物中，CPHPC-M38和CPHPC-M63与未修饰的CPHPC相比，能显著提高疫苗诱导的特异性抗体滴度。表2所列为65种CPHPC衍生物与未修饰的CPHPC相比在hSAP转基因小鼠中作为乙肝核酸疫苗佐剂诱导HBsAg特异性IgG的滴度比值。图1和图2所示为部分经修饰的衍生物佐剂（CPHPC-M38，CPHPC-M11，CPHPC-M32，CPHPC-M25，CPHPC-M63）诱导的抗体滴度示意图。

其他63种衍生物作为核酸疫苗佐剂未能显著提高疫苗诱导的抗体滴度。

表2.不同CPHPC衍生物与CPHPC相比在hSAP转基因小鼠中作为乙肝核酸疫苗佐剂诱导HBsAg特异性IgG的滴度比值

*滴度比值大于1.5倍的数值。

实施例5：己二酰二D-羟脯氨酸衍生物对核酸疫苗细胞免疫应答的影响

1、实验材料

1.1试剂

①疫苗质粒的来源及扩增同实施例4。

②IFN-γ的蛋白水平检测所用的ELISA试剂盒为BD Pharmagen商品化试剂。实验操作按试剂盒说明书进行。

③乳酸脱氢酶活性检测试剂购自Roche Applied Science，实验操作按试剂盒说明书进行。

④所采用的刺激多肽为来自乙肝病毒表面抗原HBs的人工合成多肽，其序列为：ILSPFLPL(HBsAg S208-215)。

1.2小鼠和动物免疫

同实施例4。

1.3细胞因子检测

细胞因子mRNA水平采用实时定量PCR分析，Step-one Plus Real-TimePCR Systems(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)。IFN-γ的蛋白水平用ELISA（BD Pharmingen）法分析。

1.4细胞免疫检测方法

末次免疫接种后1周，分离小鼠脾细胞进行抗原特异性CTL活性分析。采用稳定表达HBsAg的一株鼠黑色素瘤细胞系B16（H-2b）作为HBsAg特异性CTL应答检测的靶细胞(B16/S)。体外分离培养的脾细胞经多肽刺激7天，1×10⁵的CTL效应细胞与2×10³的B16/S细胞在200ml/孔培养皿中共培养4小时。CTL活性的细胞毒性采用比色法（Roche Applied Science,Mannheim,Germany）测定从损伤细胞胞浆中释放出的乳酸脱氢酶活性。同时，分离后的脾细胞以10mg/ml的多肽刺激，37°C，5%CO2培养24h。收集培养上清用商品化试剂盒（R&D Systems,Minneapolis,MN）进行IFN-γ水平分析。

2、实验结果

不同实验组及对照组的小鼠，在末次免疫接种后1周，分离小鼠脾细胞进行抗原特异性CTL活性分析及IFN-γ分泌情况分析。与体液免疫应答情况相对应的是，CPHPC-M38和CPHPC-M63与未修饰的C相比，能显著提高脾细胞抗原特异性IFN-γ的分泌（图3）。10μg/ml的抗原刺激条件下，CPHPC-M38和CPHPC-M63佐剂组诱导的脾细胞IFN-γ浓度分别为0.88ng/ml和0.79ng/ml；而CPHPC佐剂组仅0.52ng/ml。另一些衍生物，如CPHPC-M11、CPHPC-M32和CPHPC-M25等实验组诱导的IFN-γ浓度弱于或仅略高于实验组。

1μg/ml的抗原刺激条件下，CPHPC-M38和CPHPC-M63佐剂组仍显示出高于未修饰对照组的IFN-γ诱导活性。

进一步的抗原特异性CTL应答表明也表明CPHPC-M38和CPHPC-M63能比未修饰的CPHPC辅助诱导更强的CTL应答水平（图4）。不同效靶比（效应细胞：靶细胞）条件下，CPHPC（图4-C）、CPHPC-M38（图4-D）和CPHPC-M63（图4-E）佐剂组诱导的靶细胞裂解作用均强于未用佐剂的hSAP Tg对照组（图4-B）。但CPHPC-M38和CPHPC-M63佐剂组的CTL应答要更强于CPHPC组。效靶比为100时，CPHPC-M38组两只小鼠细胞检测值为89%和83%；CPHPC-M63组两只小鼠细胞检测值为76%和86%；而CPHPC组两只小鼠细胞检测值仅为80%和57%。同样，其它浓度的效靶比条件下，CPHPC组诱导的裂解率也低于CPHPC-M38和CPHPC-M63佐剂组。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (5)

1.一种己二酰二D-羟脯氨酸衍生物及其药学上可接受的盐，其特征在于，己二酰二D-羟脯氨酸衍生物的结构通式如下：

其中：

化合物1：R₁为S-OH，R₂为R-OCH₃；

化合物2：R₁为R-N₃，R₂为R-F。

2.根据权利要求1所述的己二酰二D-羟脯氨酸衍生物及其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的药学上可接受的盐为己二酰二D-羟脯氨酸衍生物的无机碱盐。

3.根据权利要求2所述的己二酰二D-羟脯氨酸衍生物及其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的无机碱盐中的无机碱为氢氧化钠或氢氧化钾。

4.一种如权利要求1所述的己二酰二D-羟脯氨酸衍生物及其药学上可接受的盐在制备核酸疫苗佐剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的己二酰二D-羟脯氨酸衍生物及其药学上可接受的盐在制备核酸疫苗佐剂中的应用，其特征在于，所述的核酸疫苗为乙型肝炎核酸疫苗。