CN103319696A

CN103319696A - 一种羟基磷灰石/可生物降解聚酯复合材料及其制备方法

Info

Publication number: CN103319696A
Application number: CN2012100797895A
Authority: CN
Inventors: 甘志华; 杜珂
Original assignee: Institute of Chemistry CAS
Current assignee: Institute of Chemistry CAS
Priority date: 2012-03-23
Filing date: 2012-03-23
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2032-03-23
Also published as: CN103319696B

Abstract

本发明公开了一种羟基磷灰石/可生物降解聚酯复合材料及其制备方法。该包括如下步骤：在无水无氧和氩气保护的条件下，羟基磷灰石与脂肪族环状单体在辛酸亚锡的催化下经原位聚合反应即得所述复合材料；所述脂肪族环状单体为丙交酯、ε-己内酯和乙交酯至少一种；本发明提供的复合材料由羟基磷灰石和可生物降解聚酯组成。本发明提供的复合材料表面富集具有生物活性的羟基磷灰石层，具备优异的生物相容性和生物活性；该生物活性界面能够快速诱导生理环境中钙离子沉积从而诱导磷灰石的成核和生长，并且在组成上模仿了天然骨基质中的无机/有机成分；基于上述特点，该改性的羟基磷灰石/可生物降解聚酯复合材料是良好的骨缺损的修复的支架材料，在细胞扩增和骨组织工程领域有良好的应用前景。

Description

一种羟基磷灰石/可生物降解聚酯复合材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种羟基磷灰石/可生物降解聚酯复合材料及其制备方法，属于材料科学与生物医学的交叉领域。

背景技术

骨缺损治疗是长期困扰临床医学领域的一个棘手难题。临床已经证明，自体骨移植是治疗骨缺损的最佳方法，但是由于其来源问题，以及对患者取骨区的损伤限制了其广泛的应用。异体骨取材简便，但是在生物安全性上存在相当的隐患，患者可能存在免疫排斥反应，并且存在因外源骨材料植入感染病毒的风险。所以，临床上越来越广泛地采用人工制备的材料作为硬组织修复材料。人工材料的选取要考虑以下几个要求(骨组织工程支架材料，邢辉，陈晓明等，生物骨科材料与临床研究，2004，5)：1)良好的生物相容性，在体外培养时无细胞毒性，植入体内不会引起机体炎症和排斥反应；2)具有良好的表面活性，促进细胞的黏附以及为细胞的增殖提供有利的微环境；3)具有三维立体结构，疏松多孔，从而有利于细胞的植入和黏附，同时便于细胞营养成分的输入和代谢产物的排出；4)具有可塑性，及一定的机械强度，在植入体内一段时间后仍可保持初始形状；5)具备可生物降解性，支架在组织形成过程中逐渐被降解，同时不影响新生组织的结构和功能。

羟基磷灰石是构成人体硬组织无机质的主要成分，能与骨组织形成牢固的生物键合，从而具有生物活性。纳米级羟基磷灰石约占骨基质重量的65％左右。在众多的硬组织修复材料中，羟基磷灰石(HA)/可吸收聚合物复合生物材料由于能够兼具二者的优异性能而备受研究者的关注。在体内组织重建过程中，理想的生物材料首先通过黏附或生长受体的特异作用，征集受损组织周边的目标细胞使其迁移进入支架，促进其增殖与分化，覆盖受损部位(Griffith，L.G.and G.Naughton，.Science，2002.295(5557)：p.1009-1013)。在组织工程中，细胞黏连在细胞外基质(ECM)上发挥其黏附，迁移，分化和增殖功能。聚羟基酯作为人工ECMs材料，可大规模生产，细微结构可调，力学和降解行为可控。最大的缺点是缺乏细胞识别信号，不利于细胞特异性黏附和特异基因的激活(姚康德，尹玉姬等，组织工程相关生物材料，化学工业出版社，2003)。将具有生物活性和骨整合性的HA纳米粒子引入支架材料能够有效地改善合成基质缺乏特异性细胞信号、不能有效种植细胞的弊端。

聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料是目前研究较多的一类杂化材料。目前常用的制备方法有熔融共混法，溶液共混法，以及原位聚合法等。利用简单的机械共混的方法，羟基磷灰石颗粒和聚合物基质两相间缺乏有效的键合，界面结合强度差，同时羟基磷灰石颗粒在聚合物基质中易于团聚，分散不均匀。这些弊端势必影响复合材料的性能。所以原位聚合的方法受到越来越广泛的关注。但是，纵观目前对原位聚合制备复合材料的研究进展，可发现对这种复合材料的进一步的改性以调控具有生物活性的羟基磷灰石在聚合物表界面的分布鲜有报导。

发明内容

本发明的目的是提供一种羟基磷灰石/可生物降解聚酯复合材料及其制备方法，本发明提供的复合材料表面富集羟基磷灰石层，极大提高了其生物活性以及表面的成骨能力。

本发明提供的一种羟基磷灰石/可生物降解聚酯复合材料的制备方法，包括如下步骤：

在无水无氧和氩气保护的条件下，羟基磷灰石与脂肪族环状单体在辛酸亚锡的催化下经原位聚合反应即得所述复合材料；

所述脂肪族环状单体为丙交酯(LA)、ε-己内酯(CL)和乙交酯(GA)至少一种。

上述的制备方法中，所述羟基磷灰石的粒径可为10nm～100μm；所述丙交酯可为左旋丙交酯(LLA)、右旋丙交酯(DLA)和消旋丙交酯(DLLA)中至少一种。

上述的制备方法中，所述原位聚合反应的溶剂可为甲苯、二甲苯或四氢呋喃等；所述原位聚合反应的温度可为60～160℃，具体可为110℃或160℃，时间可为24～72小时，具体可为48小时。

上述的制备方法中，所述羟基磷灰石占所述脂肪族环状单体的质量百分比可为1％～40％，具体可为1％或33.3％；所述辛酸亚锡占所述脂肪族环状单体的摩尔百分比可为0.01％～2％，具体可为0.57％或1.43％。

上述的制备方法中，所述方法还包括将所述复合材料制备成型的步骤。

上述的制备方法中，所述制备成型包括下述1)～3)中任一步骤：

1)用熔融热压法将所述复合材料压制成膜材料；

2)用溶剂挥发法将所述复合材料制备微球材料；

3)用超临界二氧化碳萃取方法制备多孔泡沫材料。

上述的制备方法中，所述方法还包括对所述复合材料进行改性的步骤，所述改性的步骤包括下述1)或2)中的步骤：

1)将所述复合材料浸没于氢氧化钠水溶液中；

2)将所述复合材料浸没于PS脂肪酶水溶液中。

上述的制备方法中，方法1)中所述氢氧化钠水溶液的质量百分含量可为0.1～10％，如4％，所述浸没的时间为0.5～4h，具体可为5min或1h；方法2)中所述PS脂肪酶的pH值可为7.0～8.0，如7.4，所述浸没的时间可为0.5～4h，具体可为1h。

本发明进一步提供了由上述方法制备的羟基磷灰石/可生物降解聚酯复合材料；所述复合材料由羟基磷灰石和可生物降解聚酯组成，其中所述羟基磷灰石的质量百分含量为1％～50％，具体可为25％；所述可生物降解聚酯为聚丙交酯、聚(ε-己内酯)、聚乙交酯或丙交酯、ε-己内酯和乙交酯中任二种或三种单体聚合得到的二元共聚物或三元共聚物；所述二元共聚物为二元无规共聚物或二元嵌段共聚物，所述三元共聚物为三元无规共聚物或三元嵌段共聚物。

本发明提供的羟基磷灰石/可生物降解聚酯复合材料，表面富集具有生物活性的羟基磷灰石层，具备优异的生物相容性和生物活性；该生物活性界面能够快速诱导生理环境中钙离子沉积从而诱导磷灰石的成核和生长，并且在组成上模仿了天然骨基质中的无机/有机成分；基于上述特点，该改性的羟基磷灰石/可生物降解聚酯复合材料是良好的骨缺损的修复的支架材料，在细胞扩增和骨组织工程领域有良好的应用前景。

附图说明

图1为PDLLA/HA纳米复合物膜经碱处理5min和60min后的表面形貌。

图2为MG-63细胞在碱处理后的PDLLA/HA纳米复合物膜上培养4天后的形貌。

图3为纯PDLLA膜、未处理的PDLLA/HA纳米复合物膜以及碱处理改性的PDLLA/HA纳米复合物膜的细胞毒性结果(MTT实验)。

图4为细胞在纯PDLLA膜、未处理的PDLLA/HA纳米复合物膜、碱处理改性的PDLLA/HA纳米复合物膜(原位聚合法制备)、碱处理改性的PDLLA/HA纳米复合物膜(溶液共混法制备)随培养时间的增殖结果。

图5为碱处理改性的PDLLA/HA纳米复合微球形貌。

图6为碱处理改性的PDLLA/HA纳米复合微球原位矿化1天后的形貌。

图7为PDLLA/HA纳米复合多孔泡沫经碱处理改性后的形貌。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、原位聚合制备PDLLA/HA纳米复合材料

HA(羟基磷灰石)纳米粒子(粒径约为50～200nm)反应前在真空干燥箱中100℃干燥2天。

在无水无氧和氩气保护下，将干燥后的HA纳米粒子1g预分散在蒸馏过的甲苯中，然后加入3g D，L-LA单体和43μL辛酸亚锡催化剂(摩尔浓度为0.982mol/L)，再次加入蒸馏后的甲苯20ml(该体系中，HA占D，L-LA单体的质量百分比为33.3％，辛酸亚锡占D，L-LA单体的质量百分比为0.57％，磁力搅拌，反应温度为110℃，反应时间为48小时；反应结束后，反复用二氯甲烷溶解产物，冰甲醇沉淀产物；经过多次洗涤后将产物真空干燥即得PDLLA/HA纳米复合材料；该复合材料中，HA的质量百分含量为25％。

实施例2、原位聚合制备PDLLA/HA纳米复合材料

在无水无氧和氩气保护下，将干燥后的HA纳米粒子1g预分散在蒸馏过的甲苯中，然后加入3g D，L-LA单体和108μL辛酸亚锡催化剂(摩尔浓度为0.982mol/L)，再次加入蒸馏后的甲苯20ml(该体系中，HA占D，L-LA单体的质量百分比为33.3％，辛酸亚锡占D，L-LA单体的质量百分比为1.43％，磁力搅拌，反应温度为110℃，反应时间为48小时；反应结束后，反复用二氯甲烷溶解产物，冰甲醇沉淀产物；经过多次洗涤后将产物真空干燥即得PDLLA/HA纳米复合材料；该复合材料中，HA的质量百分含量为25％。

实施例3、原位聚合制备PDLLA/HA纳米复合材料

在无水无氧和氩气保护下，将干燥后的HA纳米粒子0.1g预分散在蒸馏过的甲苯中，然后加入10g D，L-LA单体和144μL辛酸亚锡催化剂(摩尔浓度为0.982mol/L)，再次加入蒸馏后的甲苯20ml(该体系中，HA占D，L-LA单体的质量百分比为1％，辛酸亚锡占D，L-LA单体的质量百分比为0.57％，磁力搅拌，反应温度为110℃，反应时间为48小时；反应结束后，反复用二氯甲烷溶解产物，冰甲醇沉淀产物；经过多次洗涤后将产物真空干燥即得PDLLA/HA纳米复合材料；该复合材料中，HA的质量百分含量为1％。

实施例4、原位聚合制备PCL/HA纳米复合材料

HA纳米粒子(粒径约为50～200nm)反应前在真空干燥箱中100℃干燥2天。

在无水无氧和氩气保护下，将干燥后的HA纳米粒子1g预分散在蒸馏过的甲苯中，然后加入3g ε-CL单体和43μL辛酸亚锡催化剂(摩尔浓度为0.982mol/L)，再次加入蒸馏后的甲苯20ml(该体系中，HA占ε-CL单体的质量百分比为33.3％，辛酸亚锡占ε-CL单体的质量百分比为0.57％)，磁力搅拌，反应温度为110℃，反应时间为48小时；反应结束后，反复用二氯甲烷溶解产物，冰甲醇沉淀产物；经过多次洗涤后将产物真空干燥即得PCL/HA纳米复合材料；该复合材料中，HA的质量百分含量为25％。

实施例5、原位聚合制备PLGA/HA纳米复合材料

在无水无氧和氩气保护下，将干燥后的HA纳米粒子1g预分散在二甲苯中，然后加入1.5gGA单体、1.5g L-LA单体和43μL辛酸亚锡催化剂(摩尔浓度为0.982mol/L)，再次加入二甲苯20ml(该体系中，HA占GA和L-LA单体的质量百分比为33.3％，辛酸亚锡占GA和L-LA单体的质量百分比为0.57％)，磁力搅拌，反应温度为160℃，反应时间为48小时；反应结束后，用氯仿溶解产物，冰甲醇沉淀产物；经过多次洗涤后将产物真空干燥即得PLGA/HA纳米复合材料；该复合材料中，HA的质量百分含量为25％。

实施例6、以PDLLA/HA纳米复合物为例的材料成型加工

(1)PDLLA/HA熔融压膜制备膜材料

PDLLA/HA 0.15mm厚的薄膜是通过以下方法制得的：以0.15mm厚的聚四氟乙烯膜为模具，裁剪聚四氟乙烯膜使其模板形状为50mm×20mm的矩形；将此模板夹在另外两片聚四氟乙烯膜之间；复合物粉料置于模具中，在预热为120℃的压机上，以50kg·cm^-2的压力熔融压膜，保压10min后取出冷却至室温，最后得到尺寸为50mm×20mm×0.15mm的矩形膜片。

(2)溶剂挥发法制备PDLLA/HA纳米复合微球

直径范围为50～200μm的PDLLA/HA复合物微球是通过以下方法得到的：配制7.5ml 0.05g/ml PDLLA/HA纳米复合物的CH₂Cl₂溶液，向该聚合物溶液中注入0.5ml预先配制好的0.01g/ml的PVA水溶液后，迅速放置于超声波细胞粉碎机的超声探头下进行超声乳化得到初乳液(超声波细胞粉碎机的参数设置：超声功率为200W，超声时间为4s，间隔为4s，共超声3min)；迅速将初乳液转移到配备机械搅拌(搅拌速率：400rpm)的0.0025g/ml的PVA水溶液中，室温下搅拌4小时，结束后洗涤并收集PDLLA/HA纳米复合物微球，冷冻干燥。

(3)超临界二氧化碳技术制备PDLLA/HA多孔泡沫

将该实施例中的步骤(1)中得到的样条置于高压釜中，通入40℃/8MPa的CO₂，恒温恒压6小时后从高压釜中取出，在施加超声波的水浴中发泡(超声波功率为50W，超声波频率为30kHz)，发泡温度为40℃，发泡时间为300s。

实施例7、以PDLLA/HA纳米复合物为例的水解处理改性

配制浓度为1mol/L的NaOH水溶液(质量百分含量为4％)，然后将制备得到的PDLLA/HA纳米复合物膜浸入其中，磁力搅拌，1小时后取出，用大量去离子水洗涤，冷冻干燥；其中处理5min和60min的表面形貌如图1所示。

用同样的方法对PDLLA/HA纳米复合物微球进行碱改性处理，其形貌如图5所示。

用同样的方法对PDLLA/HA多孔泡沫孔进行碱改性处理，其形貌如图7所示。

通过场发射扫描电子显微镜(SEM)和原子力显微镜(AFM)表征观察到经过改性后PDLLA/HA纳米复合物膜表面具有致密的HA富集层；X射线光电子能谱分析(XPS)对材料表面成分进行分析发现经过改性处理后的复合物材料表面钙、磷离子含量增加；X射线衍射图谱(XRD)分析表明经过改性处理后的复合物膜表面出现羟基磷灰石的特征衍射峰，以上表征说明经过水解处理后PDLLA/HA纳米复合物膜材料表面富集羟基磷灰石层。

体外细胞实验结果表明，经过8天培养，与纯PDLLA以及未处理的PDLLA/HA纳米复合材料相比，MG-63细胞在经过碱处理改性的PDLLA/HA纳米复合物膜上数量多于对照组(1.6倍于纯PDLLA材料，1.4倍于未处理PDLLA/HA复合物)，同时SEM和CLSM结果显示细胞在改性后的PDLLA/HA纳米复合材料的HA富集上铺展面积更大，铺展充分，说明这种改性后得到的HA富集层有更好的细胞亲和性；MG-63细胞在经过碱处理改性的PDLLA/HA纳米复合物膜上培养4天后的形貌如图2所示。

实施例8、以PCL/HA纳米复合物支架为例的酶溶液处理改性

配制浓度为1mg/ml的PS脂肪酶的磷酸缓冲溶液(pH＝7.40)，然后将制备得到的PCL/HA纳米复合物支架浸入其中，于37℃在摇床中震荡(100rpm)，1小时候取出，用大量去离子水洗涤，冷冻干燥。

通过场发射扫描电子显微镜(SEM)表征观察到经过改性处理后PCL/HA纳米复合物支架表面富集具有致密的HA层；X射线光电子能谱分析(XPS)对材料表面成分进行分析发现到经过改性处理后的复合物材料表面钙、磷离子含量增加，C元素含量相应降低；X射线衍射图谱(XRD)分析表明经过改性处理后的复合物材料表面出现羟基磷灰石的特征衍射峰，以上表征说明经过酶降解处理后PCL/HA纳米复合物支架材料表面富集羟基磷灰石层。

实施例9、改性PDLLA/HA纳米复合物支架在模拟体液中的模拟骨矿化

(1)SBF溶液的配制：

配制1.5倍模拟体液(SBF溶液)，在37℃时在聚乙烯塑料烧杯中依次加入去700ml离子水、11.994g NaCl、0.525g NaHCO₃、0.336g KCL、0.342g K₂HPO₄·3H₂O、0.458gMgCl₂·6H₂O、0.417g CaCl₂和0.107g Na₂SO₄，配制成均一溶液，其中各物质摩尔浓度为：NaCl为0.20mol/L、NaHCO₃为6.25mmol/L、KCL为4.50mmol/L、K₂HPO₄·3H₂O为1.10mmol/L、MgCl₂·6H₂O为2.25mmol/L、CaCl₂为3.75mmol/L、Na₂SO₄为0.75mmol/L；用9.086g(CH₂OH)₃CNH₂和约60ml HCl作为缓冲溶液调节最终溶液的pH值为7.4；将上述溶液转移到容量瓶中配成1L的溶液。

(2)模拟骨矿化过程：

将实施例5制备的改性后的PDLLA/HA纳米复合物支架置于上述配制的SBF溶液中，于37℃，100rpm的摇床中矿化3天，矿化完成后将复合物支架取出，大量去离子水洗涤，干燥。

实验结果表明，与纯PDLLA聚合物以及未经处理的PDLLA/HA纳米复合微球对照组相比，经过碱改性处理后的PDLLA/HA纳米复合微球能够更加快速诱导模拟体液环境中的磷灰石成核和生长，图6为碱改性处理后的PDLLA/HA纳米复合微球矿化1天后的形貌。

实施例10、细胞在改性复合物支架上的生长行为

(1)细胞毒性测试

MG-63细胞复苏传代后，在对数生长期内，用质量分数为0.25％的胰酶消化后吹打，加DMEM培养液调整至细胞密度为2×10⁴/ml；向96孔板各孔中加入分散均匀的细胞悬液150μl，待细胞长至孔底面积的90％时放入复合物支架材料(分别为纯PDLLA膜、未处理的PDLLA/HA纳米复合物膜以及经碱处理改性的PDLLA/HA纳米复合物膜)；37℃下孵育，每隔一段时间后进行MTT测试，结果如图3所示；细胞毒性实验结果显示细胞毒性分级为0级或I级，符合ISO10993中对体内植入材料的要求，表明所述复合物材料无明显细胞毒性。

(2)细胞增殖测试

MG-63细胞复苏传代后，在对数生长期内，用质量分数为0.25％的胰酶消化后吹打，加DMEM培养液调整至细胞密度为2×10⁴/ml；首先向96孔板各孔中放入待测试的复合物支架材料(分别为纯PDLLA膜、未处理的PDLLA/HA纳米复合物膜、碱处理改性的PDLLA/HA纳米复合物膜(原位聚合法制备)、碱处理改性的PDLLA/HA纳米复合物膜(溶液共混法制备，其具体的制备方法为：1g粒径范围约为50～200nm的HA纳米粒子与3g分子量Mn为50000的PDLLA聚合物分散在20ml四氢呋喃、三氯甲烷、二氯甲烷或甲苯中，HA占PDLLA聚合物的质量百分比为33.3％，搅拌，然后用甲醇或乙醚沉降，干燥得到溶液共混复合材料；在该复合材料中，PDLLA的质量百分比含量为75％)。然后加入分散均匀的细胞悬液200μl，保证细胞悬液完全浸没待测材料；37℃下孵育，每隔一段时间后进行MTT测试，结果如图4所示，细胞增殖实验结果显示改性复合物支架材料具有良好的细胞相容性，MG-63细胞在支架材料表面生长良好并且有明显的增殖行为。

(3)细胞粘附实验

将消毒后的改性支架材料放入24孔板，每孔加入300μl细胞密度为5×10⁴/ml的均匀细胞悬液，于37℃培养，每隔一段时间后终止培养，用PBS洗涤支架，用浓度为2％的戊二醛固定细胞30min；用梯度乙醇脱水，然后冷冻干燥；样品喷金后场发射扫描电子显微镜(SEM)观察细胞在改性后的复合物材料表面的形态；实验结果表明MG-63细胞易于在羟基磷灰石层表面黏附，细胞伪足与羟基磷灰石纳米颗粒接触紧密，并且细胞伪足深入到改性复合物材料表面的羟基磷灰石纳米颗粒之间形成一种牢固的锚状结构(如图2-右图)，随着培养时间的增加，细胞面积变大，细胞之间通过伪足相互接触，培养较长时间后可见细胞呈复层生长。

Claims

1.一种羟基磷灰石/可生物降解聚酯复合材料的制备方法，包括如下步骤：

所述脂肪族环状单体为丙交酯、ε-己内酯和乙交酯至少一种。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述羟基磷灰石的粒径为10nm～100μm；所述丙交酯为左旋丙交酯、右旋丙交酯和消旋丙交酯中至少一种；

所述原位聚合反应的溶剂为甲苯、二甲苯或四氢呋喃；所述原位聚合反应的温度为60～160℃，时间为24～72小时。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述羟基磷灰石占所述脂肪族环状单体的质量百分比为1％～40％；所述辛酸亚锡占所述脂肪族环状单体的摩尔百分比为0.01％～2％。

4.根据权利要求1-3中任一所述的制备方法，其特征在于：所述方法还包括将所述复合材料制备成型的步骤。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述制备成型包括下述1)～3)中任一步骤：

1)用熔融热压法将所述复合材料压制成膜材料；

2)用溶剂挥发法将所述复合材料制备微球材料；

3)用超临界二氧化碳萃取方法制备多孔泡沫材料。

6.根据权利要求1-5中任一所述的制备方法，其特征在于：所述方法还包括对所述复合材料进行改性的步骤，所述改性的步骤包括下述1)或2)中的步骤：

1)将所述复合材料浸没于氢氧化钠水溶液中；

2)将所述复合材料浸没于PS脂肪酶水溶液中。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：方法1)中所述氢氧化钠水溶液的质量百分含量为0.1～10％，所述浸没的时间为0.5～4h；方法2)中所述PS脂肪酶的pH值为7.0～8.0，所述浸没的时间为0.5～4h。

8.权利要求书1-7中任一所述方法制备的羟基磷灰石/可生物降解聚酯复合材料。

9.根据权利要求9所述的复合材料，其特征在于：所述复合材料由羟基磷灰石和可生物降解聚酯组成，其中所述羟基磷灰石的质量百分含量为1％～50％；所述可生物降解聚酯为聚丙交酯、聚(ε-己内酯)、聚乙交酯或丙交酯、ε-己内酯和乙交酯中任二种或三种单体聚合得到的二元共聚物或三元共聚物；

所述二元共聚物为二元无规共聚物或二元嵌段共聚物，所述三元共聚物为三元无规共聚物或三元嵌段共聚物。

10.权利要求9或10所述复合材料在制备骨缺损修复材料中的应用。