CN103305624B - 一种高消化率高粱品系的分子鉴定法 - Google Patents

一种高消化率高粱品系的分子鉴定法 Download PDF

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Abstract

一种高消化率高粱品系的分子鉴定法，属于分子育种技术。本方法是利用分子标记方法鉴定、选择携带有bmr-6基因的单株，简化选择程序，操作简易，能够加快育种进程。

Description

一种高消化率高粱品系的分子鉴定法
技术领域
一种高消化率高粱品系的分子鉴定法属于高粱分子育种技术，更具体的说是一种通过分子标记鉴定高消化率高粱基因的方法。
背景技术
高粱褐色中脉是一种叶脉和茎杆木质部的变异现象。这种突变体与普通的白色中脉高粱相比消化率提高40%-60%，适口性明显改善，各种放牧家畜特别喜食，同样的饲喂量可获得更高的经济效益。褐色中脉类型有三十多种，而其中消化率最高的为bmr-6类型。常规的培育褐色中脉（bmr-6类型）高粱与苏丹草的方法是利用表型来进行选择，由于褐色中脉是隐性性状，在回交当代不能直接通过表型进行鉴定。如进行表型鉴定需自交一代后再种植鉴定，这样需要2个生长季才能完成，费时、费工；而利用分子标记方法鉴定、选择携带有bmr-6基因的单株，可在几天时间内完成bmr-6基因的鉴定、选择工作，且准确性高，结果可靠。本方法可简化选择程序，节约选择时间，操作简便，能够加快育种进程。目前，还未见该方法的相关报道。
发明内容
本发明的目的是采用分子标记的方法来鉴定高粱品系中控制高消化率的的基因，缩短鉴定时间，以期达到方法易行，快速方便，效果良好的技术效果。
本发明是这样实现的：
一种高消化率高粱品系的分子鉴定法的特征在于，利用SSR引物进行PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳检测，得到目的片段回收后酶切DNA，再用琼脂糖凝胶电泳检测所得酶切片段，确定植株是否携带bmr-6基因。
本发明包括如下步骤：
①选用引物B-1：前引物为，GACGGCCGGCACGCG；后引物为，TTCAGACTTCAGACCAAC。
②PCR扩增：扩增程序为，94℃ 预变性 5min；94℃变性 30s，58℃退火30s，68℃ 延伸30s，34个循环；最后再延伸7 min，4℃保存。
③电泳检测：取扩增好的DNA产物5μL，用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，如有一条长度200bp左右的带则说明目标序列已扩增好。
④酶切：利用DNA回收试剂盒将扩增好的溶液回收，取20μL用Mlu I酶进行酶切。
⑤电泳检测酶切片段：用3%的琼脂糖凝胶电泳检测酶切后的DNA，电压150V，电泳30分钟，用成像仪拍照观察，如出现2条带说明该单株携带bmr-6基因，如只有1条带则不携带该基因。
2.步骤②中所述的PCR扩增的总体系为30μL：DNA 100ng， 2mM 引物 5μL，2 mM dNTP 6μL，KOD酶 0.5U，2倍缓冲液15μL，剩余用双蒸水补齐。
3.步骤④所述的酶切体系40μL：DNA 20μL，内切酶3μL，10倍酶切缓冲液4μL，双蒸水13μL。
本发明的有益效果：一种高消化率高粱品系的分子鉴定法利用分子标记方法鉴定、选择携带有bmr-6基因的单株，简化选择程序。本方法简便，操作容易，能够加快育种进程。另外，本发明也可用于高消化率苏丹草品系的分子鉴定。
具体实施方式：
下面结合具体实例对本发明进行进一步的描述。
实施例1：高消化率的高粱品系的分子标记鉴定
1. 高消化率品系杂交：利用褐色中脉高粱品系U68（bmr-6类型）与高粱品系Tx623B杂交。
2. 第一次回交：以杂交种为母本，高粱Tx623B为父本进行回交，获得BC1F1。
3. 后代单株分子标记鉴定：BC1F1种20株，分单株提取DNA，对携带褐色中脉基因的单株进行PCR扩增鉴定。
鉴定程序如下：
①.利用引物B-1（前引物为：GACGGCCGGCACGCG；后引物为：TTCAGACTTCAGACCAAC）对这20个单株DNA进行扩增（总体系为30μL: DNA 100ng 2mM 引物 5μL，2 Mm dNTP 6μL，KOD酶 0.5U，2倍缓冲液15μL，剩余用双蒸水补齐。扩增程序为：94℃ 预变性 5min；94℃变性 30s，58℃退火30s，68℃ 延伸30s，34个循环；最后再延伸7 min，4℃保存。）
②. 取扩增好的DNA产物5μL，用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，如有一条长度200bp左右的带则说明目标序列已扩增好。
③. 利用DNA回收试剂盒将扩增好的溶液回收，取20μL用Mlu I酶切（酶切体系40μL：DNA 20μL，内切酶3μL，10倍酶切缓冲液4μL，双蒸水13μL）。
④. 用3%的琼脂糖凝胶电泳检测酶切后的DNA，电压150V，电泳30分钟，用成像仪拍照观察，如出现2条带说明该单株携带bmr-6基因，如只有1条带则不携带该基因。
通过以上步骤在获得了高消化率的高粱品系Tx623B-bmr6。相比于常规的利用表型鉴定的方法，本方法节省了一年时间。
实施例2：高消化率的苏丹草品系的分子标记鉴定
1. 高消化率品系杂交：利用褐色中脉高粱品系U68（bmr-6类型）与苏丹草品系S722杂交。
2. 第一次回交：以杂交种为母本，苏丹草品系S722为父本进行回交，获得BC1F1。
3. 后代单株分子标记鉴定：BC1F1种20株，分单株提取DNA，对携带褐色中脉基因的单株进行PCR扩增鉴定。
鉴定程序如下：
①.利用引物B-1（前引物为：GACGGCCGGCACGCG；后引物为：TTCAGACTTCAGACCAAC）对这20个单株DNA进行扩增（总体系为30μL: DNA 100ng 2mM 引物 5μL，2 Mm dNTP 6μL，KOD酶 0.5U，2倍缓冲液15μL，剩余用双蒸水补齐。扩增程序为：94℃ 预变性 5min；94℃变性 30s，58℃退火30s，68℃ 延伸30s，34个循环；最后再延伸7 min，4℃保存。）
②. 取扩增好的DNA产物5μL，用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，如有一条长度200bp左右的带则说明目标序列已扩增好。
③. 利用DNA回收试剂盒将扩增好的溶液回收，取20μL用Mlu I酶切（酶切体系40μL：DNA 20μL，内切酶3μL，10倍酶切缓冲液4μL，双蒸水13μL）。
④. 用3%的琼脂糖凝胶电泳检测酶切后的DNA，电压150V，电泳30分钟，用成像仪拍照观察，如出现2条带说明该单株携带bmr-6基因，如只有1条带则不携带该基因。
通过以上步骤获得了高消化率的苏丹草新品系S722-bmr6。相比于常规的利用表型鉴定进行回交的方法，本方法节省了一年时间。

Claims (3)

1.一种高消化率高粱品系的分子鉴定法，其特征在于，它包括如下步骤：
①选用引物B-1：前引物为，GACGGCCGGCACGCG；后引物为，TTCAGACTTCAGACCAAC；
②PCR扩增：扩增程序为，94℃ 预变性 5min；94℃变性 30s，58℃退火30s，68℃ 延伸30s，34个循环；最后再延伸7 min，4℃保存；
③电泳检测：取扩增好的DNA产物5μL，用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，如有一条长度200bp左右的带则说明目标序列已扩增好；
④酶切：利用DNA回收试剂盒将扩增好的溶液回收，取20μL用Mlu I酶进行酶切；
⑤电泳检测酶切片段：用3%的琼脂糖凝胶电泳检测酶切后的DNA，电压150V，电泳30分钟，用成像仪拍照观察，如出现2条带说明该单株携带bmr-6基因，如只有1条带则不携带该基因。
2.根据权利要求1所述的高消化率高粱品系分子鉴定法，其特征在于，步骤②中所述的PCR扩增的总体系为30μL：DNA 100ng， 2mM 引物 5μL，2 mM dNTP 6μL，KOD酶 0.5U，2倍缓冲液15μL，剩余用双蒸水补齐。
3.根据权利要求1所述的高消化率高粱品系分子鉴定法，其特征在于，步骤④所述酶切的体系40μL：DNA 20μL，内切酶3μL，10倍酶切缓冲液4μL，双蒸水13μL。
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褐色中脉bmr高粱研究与利用进展;张福耀等;《中国农业科技导报》;20091231;第11卷(第2期);全文 *
高粱与苏丹草的遗传及其杂种优势利用的研究;詹秋文;《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20090215(第2期);第78-79、87页 *
高粱棕色中脉基因bmr-6的遗传分析和SSR标记定位;李杰勤等;《草业学报》;20101031;第19卷(第5期);全文 *

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