CN103304661B

CN103304661B - 一种肽醛的制备方法

Info

Publication number: CN103304661B
Application number: CN201310222464.2A
Authority: CN
Inventors: 张文治; 刘建; 马亚平; 袁建成
Original assignee: Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2013-06-06
Filing date: 2013-06-06
Publication date: 2016-06-01
Anticipated expiration: 2033-06-06
Also published as: CN103304661A

Abstract

本发明属于药物合成技术领域，公开了一种肽醛的制备方法，其依次包括制备保护的氨基醛、制备氨基醛连接臂、制备肽醛-树脂复合物和切割纯化得到肽醛纯品的步骤，其中在制备氨基醛连接臂时所采用的连接臂为二丙醇胺或二丁醇胺。本发明所采用的二丙醇胺和二丁醇胺作为连接臂制备肽醛的方法对20种常用氨基酸均适用，适用范围更广，并且有效克服了紧邻消旋杂峰的存在。因此，本发明提供了一种简便、高效的制备肽醛方法，解决了目前肽醛制备工艺繁琐、周期长、产率低、易消旋等问题。

Description

一种肽醛的制备方法

技术领域

本发明涉及药物合成技术领域，具体涉及一种肽醛的制备方法。

背景技术

肽醛是指C端为醛基的多肽类似物，主要作为丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶以及金属蛋白酶等四类蛋白水解酶的抑制剂。对于丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶，肽醛通过与丝氨酸或半胱氨酸残基活性位点结合形成半缩醛或半硫缩醛，发挥蛋白酶抑制作用。对于天冬氨酸和金属蛋白酶，肽醛与其键合形成水合物来达到抑制作用。上述肽醛的蛋白酶抑制作用都是通过与蛋白酶活性位点形成稳定的类四面体结构，从而阻止了蛋白底物与酶的结合。随着人们对药物研究的表明，含有氨基醛的多肽在很多疾病中表现出很好的生理作用，因此发展低成本、高收率、易操作的合成氨基醛的方法有着十分重要的经济价值。

醛基作为一类特殊的化学官能团，在有机化学反应中扮演者重要的角色。基于醛自身的化学特性，一方面醛基不稳定，很容易被氧化成羧基或者被还原成醇羟基，另一方面醛基在酸性或碱性条件下都容易发生缩合反应，导致醛的合成在化学合成工艺中一直是个难点。

目前肽醛的制备方法主要分为液相法和固相法两类。

（1）液相法。主要有还原法和氧化法制得肽醛。此类方法主要参见以下文献：J.Med.Chem.,1998,41,4301-4308；J.Med.Chem.,1998，41，2786-2805等。液相法存在的主要问题是中间产物分离麻烦，制备周期长，由于醛基的不稳定带来的后处理困难等。

（2）固相法。相对于液相法，固相法存在制备简便、周期短的优势，更符合快速制备肽醛的要求。固相法目前主要包括还原法、氧化法和水解法。此类方法主要参见以下文献：Tetrahedron.Lett,1995，36，7871-7874；J.Com.Chem,2000,2,172-181；Tetrahedron.Lett,1997,38,7749-7742；TetrahedronLett，1997，38，7119-7122。当前固相法中存在的主要问题是缺乏合适的连接臂将氨基醛固载化到固相载体上，反应条件较苛刻、易消旋，产率低。

中国专利CN102329372A采用了一种新的连接臂二乙醇胺，提供了一种简便、高效的肽醛制备方法，解决了目前肽醛制备工艺繁琐、周期长、产率低的问题。但其在生产实践中仍然存在可使用的氨基酸范围有限以及有紧邻消旋杂峰存在的缺陷，影响后续纯化。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，惊奇地发现二乙醇胺的同系物二丙醇胺和二丁醇胺都可以非常好地作为连接臂，用于肽醛的固相合成。因此，本发明提供了一种操作简便，氨基酸适用范围更广、产率高、低消旋的新型的肽醛的制备方法。

为此，本发明一方面提供了一种肽醛的制备方法，其依次包括制备保护的氨基醛、制备氨基醛连接臂、制备肽醛-树脂复合物和切割纯化得到肽醛纯品的步骤。在制备氨基醛连接臂时，所采用的连接臂为二丙醇胺或二丁醇胺。

在本发明的方法中，制备保护的氨基醛步骤中所采用的保护的氨基酸为N-(9-芴甲氧羰酰基)-氨基酸，氨基酸为20种常见氨基酸。针对20种常见的保护氨基酸，在制备保护的氨基醛时，按照其是否有侧链保护基而采用不同的合成方法。

其中针对侧链具有保护基的氨基酸而言（以制备Fmoc-Asp(OtBu)-H为例），具体步骤如下：

1、在氩气保护的条件下，以干燥的四氢呋喃做反应溶剂，-20℃～-10℃的低温条件下加入Fmoc保护的侧链具有保护基的氨基酸及1.2eq氯代甲酸异丁酯、1.2eqDIPEA进行搅拌反应。反应结束后过滤除去不溶物，将滤液直接在-10℃低温条件下加入2.1eq硼氢化钠进行还原，得到白色固体。

2、在氩气的保护条件下，以乙酸乙酯为溶剂，将上一步得到的白色固体溶解完全后，再加入1eqIBX在40℃反应，最后得到Fmoc保护的侧链具有保护基的氨基醛。

而针对侧链不具有保护基的氨基酸而言（以制备Fmoc-Phe-H为例），具体步骤如下：

1、以DCM为溶剂，加入1eqFmoc保护的侧链不具有保护基的氨基酸、1eqHBTU、3eqDIPEA，及1.2eqN,O-二甲基羟胺盐酸盐，反应结束经过洗涤后处理，得到Fmoc保护的weinreb酰胺粗品。

2、在0-5℃的低温条件下、氮气保护下，将前面获得的Fmoc保护的weinreb酰胺粗品用四氢呋喃溶解并用氢化铝锂还原得到Fmoc保护的侧链不具有保护基的氨基醛，用饱和的食盐水洗、无水硫酸钠干燥，减压浓缩即得氨基醛的粗品，用THF/石油醚或者EtOAc/石油醚对粗产物进行重结晶得淡黄色固体。

在本发明的方法中，所采用的缩合试剂选自HBTU、HATU、BOP或PyBOP。固相合成树脂选自三苯甲基氯树脂、2-氯三苯甲基氯树脂、4-甲基三苯甲基氯树脂或4-甲氧基三苯甲基氯树脂。切割试剂为乙酸和二氯甲烷的混合溶液，乙酸占混合溶液的体积比为10%-20%。

在本发明的另一方面提供了二丙醇胺和二丁醇胺作为连接臂在制备肽醛中的用途。

在本发明所述的用途中，制备保护的氨基醛步骤中所采用的保护的氨基酸为N-(9-芴甲氧羰酰基)-氨基酸，氨基酸为20种常见氨基酸。

由上述描述可知，与现有技术相比，本发明提供了一类新型的连接臂，即二丙醇胺和二丁醇胺。此外，由于本发明所采用的二丙醇胺和二丁醇胺作为连接臂制备肽醛的方法对20种常用氨基酸均适用，适用范围更广，并且有效克服了紧邻消旋杂峰的存在。因此，本发明同时也提供了一种简便、高效的制备肽醛方法，解决了目前肽醛制备工艺繁琐、周期长、产率低、易消旋等问题。

附图说明

图1：实施例9中采用二乙醇胺作为连接臂制备得到的SDAS-CHO粗肽纯化后获得的精肽谱图。

其中，保留时间T=14.331分钟处为产品目标峰，纯度为70.30%。并且在保留时间T=13.496处，存在消旋杂峰，纯度为11.38%。

图2：实施例9中采用二丙醇胺作为连接臂制备得到的SDAS-CHO粗肽纯化后获得的精肽谱图。

其中，保留时间T=14.331分钟处为产品目标峰，纯度为87.30%。并且在保留时间T=13.496处，未检出消旋杂峰。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。

本发明所使用的缩写的含义列于下表中。

英文缩写	中文含义
		HBTU	O-苯并三氮唑-N,N,N,N-四甲脲六氟磷酸酯
HATU	2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N,N-四甲脲六氟磷酸酯
		BOP	卡特缩合剂
PyBOP	六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷
		Fmoc-AA-OH	N-(9-芴甲氧羰酰基)-氨基酸

实施例1：制备保护的氨基醛Fmoc-Phe-H

于干燥的圆底烧瓶中依次加入Fmoc-Phe-OH15.61g(40mmol)、DCM120mL，慢慢加入15.19g(40mmol)的HBTU，DIPEA21mL(120mmol)，搅拌10min，然后慢慢加入N,O-二甲基羟胺盐酸盐4.9g(48mmol)，剧烈搅拌，用TLC跟踪反应直至原料反应完毕。反应完成后，减压除去溶剂，用适量的乙酸乙酯洗涤，收集有机相，分别用1mol/L的盐酸，饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩即得到Fmoc保护的weinreb酰胺粗品。经快速硅胶色谱纯化可得到白色固体16.42g，产率95%。

在氮气保护的条件下，于干燥的圆底烧瓶中依次加入前面所得白色固体4.42g(10mmol)，四氢呋喃80mL，反应过程中用冰浴将反应体系的温度控制在0-5℃，然后慢慢加入0.51g氢化铝锂，在5min内投料完毕，用TLC跟踪反应情况，直至反应完全。反应结束后，加入20ml盐酸水溶液，然后减压除去THF，无水乙醚萃取3次，收集有机相，依次用饱和的食盐水洗、无水硫酸钠干燥，减压浓缩即得氨基醛的粗品。用THF/石油醚或者EtOAc/石油醚对粗产物进行重结晶得淡黄色固体3.12g，收率85%。

实施例2：制备保护的氨基醛Fmoc-Asp(OtBu)-H

在氩气保护的条件下，于干燥的圆底烧瓶中依次加入Fmoc-Asp(OtBu)-OH41.1g(100mmol)，干燥的四氢呋喃300mL，用干冰将反应体系的温度控制在-20℃，再慢慢加入氯代甲酸异丁酯120mL(120mmol),DIPEA15.6mL(120mmol)，然后慢慢的将反应体系回温至-10℃，搅拌反应1小时。反应结束后，过滤除去不溶物，并用干燥的四氢呋喃洗涤滤饼，收集滤液直接用于下一步反应，继续用干冰将反应液的温度控制到-10℃，慢慢加入硼氢化钠8.01g(211mmol)，甲醇100mL，20分钟内滴加完毕，保持-10℃的温度继续反应1小时。反应结束后，用饱和的氯化铵溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取3次（200×3mL），合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压过滤、浓缩，乙醚重结晶，得白色固体30.7g，产率77.3%。

在氩气的保护条件下，于圆底烧瓶中依次加入前面所得白色固体19.9g(50mmol)、IBX28g(100mmol)、乙酸乙酯200mL，控制反应温度为40℃，剧烈搅拌反应24小时。待反应结束后，将反应体系的温度恢复至室温，减压过滤，用乙酸乙酯洗涤滤饼，收集滤液，减压浓缩，得到Fmoc-Asp(OtBu)-H为亮棕色油状液体17.6g，产率89.1%。

实施例3：制备氨基醛连接臂

向装有Fmoc-Phe-H(9.5mmol)的反应器中加入二丙醇胺(10.0mmolg)，TLC检测至反应结束，加入乙酸乙酯萃取，100ml×3,10g无水硫酸纳干燥，旋蒸后得到氨基醛连接臂9.4mmol，收率98.9%。

实施例4：制备氨基醛连接臂

向装有Fmoc-Phe-H(9.5mmol)的反应器中加入二丁醇胺(10.0mmolg)，反应结束后，TLC检测至反应结束，加入乙酸乙酯萃取，100ml×3,10g无水硫酸纳干燥，旋蒸后得到氨基醛连接臂9.1mmol，收率95.8%。

实施例5：制备氨基醛连接臂

向装有Fmoc-Asp(OtBu)-H(9.5mmol)的反应器中加入二丙醇胺(10.0mmolg)，TLC检测至反应结束，加入乙酸乙酯萃取，100ml×3,10g无水硫酸纳干燥，旋蒸后得到氨基醛连接臂9.2mmol，收率96.8%。

实施例6：制备氨基醛连接臂

向装有Fmoc-Asp(OtBu)-H(9.5mmol)的反应器中加入二丁醇胺(10.0mmolg)，反应结束后，TLC检测至反应结束，加入乙酸乙酯萃取，100ml×3,10g无水硫酸纳干燥，旋蒸后得到氨基醛连接臂9.0mmol，收率94.7%。

实施例7：制备肽醛-树脂复合物

向装有2-氯三苯甲基氯树脂(3.2g,1mmol/g)的砂芯反应器中加入10ml二氯甲烷，静置，过滤，向砂芯反应器中加入3mmol氨基醛连接臂及二异丙基乙胺(6mmol)。反应结束后，加入10ml二甲基甲酰胺洗涤树脂，并过滤，向砂芯反应器中加入10ml20%的哌啶和二甲基甲酰胺混合溶液脱保护。反应结束后加入10ml二甲基甲酰胺洗涤树脂，向砂芯反应器中加入C端第二个氨基酸Fmoc-AA₂-OH(6.0mmol)、HBTU(6.0mmol)、二异丙基乙胺(12.0mmol)，缩合反应结束后加入10ml二甲基甲酰胺洗涤树脂，过滤，按照多肽从C端到N端的顺序，更换氨基酸，重复脱保护和缩合反应，得到肽醛-树脂复合物。

实施例8：切割纯化得到肽醛纯品

向装有肽醛-树脂复合物的反应器中加入体积比为10%乙酸的二氯甲烷混合溶液，反应结束后，过滤。收集滤液，旋蒸后得到肽醛粗品。采用C18类型的反相色谱柱分离纯化，得到肽醛纯品。

实施例9：分别采用二乙醇胺、二丙醇胺和二丁醇胺三种不同的连接臂合成SDAS-CHO对比实验

1、参照实施例2的方法制备Fmoc-Ser(tBu)-CHO，再按照实施例5的方法分别合成Fmoc-Ser(tBu)-CHO-二乙醇胺连接臂、Fmoc-Ser(tBu)-CHO-二丙醇胺连接臂和Fmoc-Ser(tBu)-CHO-二丁醇胺各3mmol。

2、向装有2-氯三苯甲基氯树脂(3.2g,1mmol/g)的砂芯反应器中加入10ml二氯甲烷，静置，过滤，向砂芯反应器中加入3mmolFmoc-Ser(tBu)-CHO-二乙醇胺连接臂及二异丙基乙胺(6mmol)。反应结束后，加入10ml二甲基甲酰胺洗涤树脂，并过滤，向砂芯反应器中加入10ml20%的哌啶和二甲基甲酰胺混合溶液脱保护。反应结束后加入10ml二甲基甲酰胺洗涤树脂，向砂芯反应器中加入C端第二个氨基酸Fmoc-AA₂-OH(6.0mmol)、HBTU(6.0mmol)、二异丙基乙胺(12.0mmol)，缩合反应结束后加入10ml二甲基甲酰胺洗涤树脂，过滤，按照多肽从C端到N端的顺序，更换氨基酸，重复脱保护和缩合反应，得到SDAS-CHO-树脂复合物，按实施例8进行裂解，得粗肽0.789g，合成收率70.3%，粗肽纯度75.92%，有紧邻消旋杂峰纯度11.38%，影响后续纯化。

3、向装有2-氯三苯甲基氯树脂(3.2g,1mmol/g)的砂芯反应器中加入10ml二氯甲烷，静置，过滤，向砂芯反应器中加入3mmolFmoc-Ser(tBu)-CHO-二丙醇胺连接臂及二异丙基乙胺(6mmol)。反应结束后，加入10ml二甲基甲酰胺洗涤树脂，并过滤，向砂芯反应器中加入10ml20%的哌啶和二甲基甲酰胺混合溶液脱保护。反应结束后加入10ml二甲基甲酰胺洗涤树脂，向砂芯反应器中加入C端第二个氨基酸Fmoc-AA₂-OH-OH(6.0mmol)、HBTU(6.0mmol)、二异丙基乙胺(12.0mmol)，缩合反应结束后加入10ml二甲基甲酰胺洗涤树脂，过滤，按照多肽从C端到N端的顺序，更换氨基酸，重复脱保护和缩合反应，得到SDAS-CHO-树脂复合物，按实施例8进行裂解，得粗肽0.825g，粗肽纯度87.30%，未检出消旋前杂峰。

4、按照与第3部分完全相同的试验方案制备SDAV-CHO-树脂复合物，不同之处仅在于用二丁醇胺替代二丙醇胺作为连接臂，并按实施例8进行裂解，结果与第3部分相同，也未检出消旋前杂峰的存在。

Claims

1.一种肽醛的制备方法，依次包括制备保护的氨基醛、制备氨基醛连接臂、制备肽醛-树脂复合物和切割纯化得到肽醛纯品的步骤，其特征在于，制备氨基醛连接臂采用的连接臂为二丙醇胺或二丁醇胺。

2.根据权利要求1所述的方法，其中制备保护的氨基醛步骤中所采用的保护的氨基酸为N-(9-芴甲氧羰酰基)-氨基酸，氨基酸为20种常见氨基酸。

3.根据权利要求2所述的方法，其中针对侧链具有保护基的氨基酸而言，制备保护的氨基醛的步骤如下：

(1)在氩气保护的条件下，以干燥的四氢呋喃做反应溶剂，-20℃～-10℃的低温条件下加入Fmoc保护的侧链具有保护基的氨基酸及1.2eq氯代甲酸异丁酯、1.2eqDIPEA进行搅拌反应，反应结束后过滤除去不溶物，将滤液直接在-10℃低温条件下加入2.1eq硼氢化钠进行还原，得到白色固体；

(2)在氩气的保护条件下，以乙酸乙酯为溶剂，将上一步得到的白色固体溶解完全后，再加入1eqIBX在40℃反应，最后得到Fmoc保护的侧链具有保护基的氨基醛。

4.根据权利要求3所述的方法，其中Fmoc保护的侧链具有保护基的氨基酸是Fmoc-Asp(OtBu)-H。

5.根据权利要求2所述的方法，其中针对侧链不具有保护基的氨基酸而言，制备保护的氨基醛的步骤如下：

(1)以DCM为溶剂，加入1eqFmoc保护的侧链不具有保护基的氨基酸、1eqHBTU、3eqDIPEA，及1.2eqN,O-二甲基羟胺盐酸盐，反应结束经过洗涤后处理，得到Fmoc保护的weinreb酰胺粗品；

(2)在0-5℃的低温条件下、氮气保护下，将前面获得的Fmoc保护的weinreb酰胺粗品用四氢呋喃溶解并用氢化铝锂还原得到Fmoc保护的侧链不具有保护基的氨基醛，用饱和的食盐水洗、无水硫酸钠干燥，减压浓缩即得氨基醛的粗品，用THF/石油醚或者EtOAc/石油醚对粗产物进行重结晶得淡黄色固体。

6.根据权利要求5所述的方法，其中Fmoc保护的侧链不具有保护基的氨基酸是Fmoc-Phe-H。

7.根据权利要求1所述的方法，其中制备保护的氨基醛、制备肽醛-树脂复合物的过程采用了缩合试剂，所述缩合试剂选自HBTU、HATU、BOP或PyBOP。

8.根据权利要求1所述的方法，其中制备肽醛-树脂复合物所采用的树脂选自三苯甲基氯树脂、2-氯三苯甲基氯树脂、4-甲基三苯甲基氯树脂或4-甲氧基三苯甲基氯树脂。

9.根据权利要求1所述的方法，其中切割纯化所采用的切割试剂为乙酸和二氯甲烷的混合溶液，乙酸占混合溶液的体积比为10％-20％。

10.二丙醇胺作为连接臂在制备肽醛中的用途。

11.二丁醇胺作为连接臂在制备肽醛中的用途。

12.根据权利要求10或11所述的用途，其中制备肽醛过程中所采用的保护的氨基酸为N-(9-芴甲氧羰酰基)-氨基酸，氨基酸为20种常见氨基酸。