CN103304391B

CN103304391B - 一种联苯类化合物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN103304391B
Application number: CN201310225729.4A
Authority: CN
Inventors: 高雪梅; 胡秋芬; 李银科; 杜刚; 叶艳青
Original assignee: Yunnan Minzu University
Current assignee: Yunnan Minzu University
Priority date: 2013-06-07
Filing date: 2013-06-07
Publication date: 2014-10-08
Anticipated expiration: 2033-06-07
Also published as: CN103304391A

Abstract

本发明公开了一种联苯类化合物及其制备方法与应用，所述的联苯类化合物分子式为C₂₂H₂₆O₈，该化合物命名为neglignanD，具有下述结构式：所述制备方法是以干燥的五味子属乔木枝条、叶和/或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离步骤。所述的应用为联苯类化合物在制备抗癌药物中的应用。经细胞毒活性实验，neglignanD对NB4,A549，SHSY5Y，PC3和MCF7细胞株具有较好的细胞毒活性。本发明化合物结构简单活性好，可作为抗癌药物的先导性化合物，有良好的应用前景。

Description

一种联苯类化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于植物有效成分提取技术领域，具体涉及一种联苯类化合物及其制备方法与应用。

背景技术

五味子科 (Schisandraceae) 为双子叶植物, 只有南五味子属 (Kadsura) 和五味子属 (Schisandra) 两属, 共50种, 分布于东亚、东南亚及北美南部, 我国两属均产之, 约30余种, 产于西南部至东北部, 但主产地为西南部和中南部。五味子属 (Schisandra) 约有25种, 我国有19种, 分布于西南至东南部。

目前，从五味子科药用植物中分离得到的化合物主要为两大类: 木脂素(Lignans) 和三萜 (Triterpenes) 类化合物。三萜类化合物大多为羊毛甾烷型和环阿尔廷型, 由于其骨架易发生变化, 且由于氧化度不同使这类三萜化合物结构复杂独特。现代药理学研究表明木脂素和三萜是该科植物的主要活性成分，因此对该属植物的继续深入研究显得尤为重要。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种联苯类化合物；第二目的在于提供所述联苯类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述联苯类化合物在制备抗癌药物中的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的联苯类化合物是以干燥的五味子属乔木枝条、叶或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到的，该化合物分子式为C₂₂H₂₆O₈，命名为neglignan D，具有下述结构式：

。

本发明的第二目的是这样实现的，所述的联苯类化合物的制备方法，是以干燥的五味子属乔木枝条、叶和/或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离获得，具体为：

A、浸膏提取：将五味子属乔木枝条、叶或果实粗粉碎到20~40目，用有机溶剂超声提取2~4次，每次30~60min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩提取液至 1/4 ~ 1/2 体积时，静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏a；

B、有机溶剂萃取：浸膏a中加入重量比1~2倍量的水，用与水等体积的有机溶剂萃取3~5次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏b；

C、硅胶柱层析：将浸膏b用重量比1.5~3倍量的丙酮溶解，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为160~200目，用量为浸膏b重量6~8倍量；用体积比为1:0~0:1的混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；

D、反相柱层析：将以9:1配比的有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液上反相柱层析，反相柱是用反相材料C-18装柱；用体积含量为20~100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；

E、高效液相色谱分离：将以体积含量45~75%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液经高效液相色谱分离纯化，即得所述的联苯类化合物neglignan D。

本发明联苯类化合物是首次被分离出来的，通过核磁共振和其他波谱技术测定方法确定为联苯类化合物，并表征其具体结构为：

。

化合物neglignan D，为黄色胶状物；紫外光谱（溶剂为甲醇），λ _max（log ε）：210 (4.65), 276 (3.68), 320 (1.42) nm；红外光谱（溴化钾压片）ν_max 3408, 3082, 2935, 2853, 1730, 1625, 1551, 1476, 1428, 1380, 1164, 1135, 1058, 976, 887 cm^–1； HRESIMS显示本发明化合物准分子离子峰m/z 441.1529 [M+Na]⁺（计算值为441.1525），结合¹³C 和¹H NMR谱（图1和图2，碳谱氢谱数据归属见表1）给出其分子式为C₂₂H₂₆O₈。¹H NMR（C₅D₅N，500 MHz）和¹³C NMR（C₅D₅N，125 MHz）数据，见表1。

Neglignan D的¹H NMR和¹³C NMR谱(表1) 显示一个苯环(δ _C 148.0 s, 138.9 s, 152.0 s, 107.0 d, 128.5 s, 119.9 s)、一个芳香氢(δ _H 6.59 s)、一个亚甲基(δ _C 49.8 t), 一个酮羰基(δ _C 208.9 s), 一个甲基 (δ _C 30.3 q), 两个甲氧基 (δ _C61.0, 55.8 q) 信号。这些信号可归属为一个基本的苯环骨架和一个丙酮基。但化合物的分子式为C₂₂H₂₆O₈, 说明该化合物是一个存在对称结构的7,8位断裂的联苯环辛烯木脂素。HMBC谱中H-17,18 (δ _H2.24) 与C-6,9 (δ _C 49.8)和C-7,8 (δ _C 208.9)相关, H-6,9 (δ _H 4.02) 与C-7,8 (δ _C 208.9) 、C-17,18 (δ _C 30.3)、 C-4,11 (δ _C 107.0)、C-5,10 (δ _C 128.5)和C-15,16 (δ _C 119.9)相关，以及H-4,11 (δ _H 6.59) 与 C-6,9 (δ _C 49.8)相关，说明两个 (-CH₂C(O)CH₃)基团分别位于C-5和C-10位。HMBC谱中羟基氢(d _H10.85) 与C-1, 14 (d _C 148.0), C-2, 13 (d _C 138.9), 和C-15, 16 (d _C 119.9)相关, 两个甲氧基氢(d _H 3.88, 3.89)与C-2,13 (d _C 138.9)和C-3,12 (d _C 152.0)相关, 说明两个酚羟基分别位于C-1和C-14, 四个甲氧基分别位于C-2, C-3, C-12, 和C-13。因此，化合物的结构得到确定,命名为neglignan D。

本发明的第三目的是这样实现的，所述的联苯类化合物在制备抗癌药物中的应用。以neglignan D为原料，经对白血病急性早幼粒NB4细胞、肺腺癌A549细胞、人骨髓神经母细胞瘤SHSY5Y细胞、人前列腺癌PC3细胞、人乳腺癌MCF7细胞的细胞毒活性实验，neglignan D对NB4, A549，SHSY5Y，PC3和MCF7细胞株具有较好的细胞毒活性，IC₅₀值分别达2.9，8.6，3.3，5.1，7.8 μM；本发明化合物结构简单活性好，可作为抗癌药物的先导性化合物，有良好的应用前景。

附图说明

图1为化合物neglignan D的核磁共振碳谱（¹³C NMR）；

图2为化合物neglignan D的核磁共振氢谱（¹H NMR）；

图3为化合物neglignan D的主要HMBC（→）和¹H-¹H COSY（–）相关。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。

本发明所述的联苯类化合物是以干燥的五味子属乔木的枝条、叶或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到的，该化合物分子式为C₂₂H₂₆O₈，命名为neglignan D，具有下述结构式：

。

本发明所述的联苯类化合物的制备方法，其特征在于是以干燥的五味子属乔木枝条、叶和/或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离获得，具体为：

A步骤所述的有机溶剂为70~100%的丙酮、乙醇或甲醇中的一种。

B步骤所述的有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚或苯中的一种。

所述C步骤中浸膏在上硅胶柱层析前，用浸膏重0.8~1.2倍的80~100目硅胶拌样。

C步骤所述的混合有机溶剂为正己烷-丙酮、氯仿-丙酮、氯仿-甲醇、石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙酯中的一种。

C步骤所述的混合有机溶剂的体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1。

E步骤所述的高效液相色谱分离纯化是以50~70%的甲醇为流动相，流速10~14ml/min，21.2′ 250 mm，5mm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样45~60mL，收集15~35min的色谱峰，多次累加后蒸干。

本发明所述的联苯类化合物在制备抗癌药物中的应用。

本发明所述的五味子属植物不受地区和品种限制，均可以实现本发明。

实施例1

取干燥的五味子属乔木枝条、叶和/或果实4.5kg，粗粉碎至40目，用70%的丙酮超声提取4次，每次60min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/4；静置，滤除沉淀物，浓缩成446g浸膏a；在浸膏a中加入450g水，用与水等体积的氯仿萃取5次，合并萃取相，减压浓缩成223g浸膏b；用200目硅胶1657g装柱，在浸膏b中加入691g的丙酮溶解，然后加入100目硅胶200g拌样，拌样后上柱；用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的氯仿-甲醇混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到8个部分，体积比9:1的氯仿-甲醇混合有机溶剂的洗脱液c为72g；用反相材料C-18装柱，洗脱液c上反相柱，以体积含量为20~100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量50~70%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以55%的甲醇为流动相，流速10ml/min，21.2′250mm，5mm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样48mL，收集32min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的联苯类化合物neglignan D。

实施例2

取干燥的五味子属乔木枝条、叶和/或果实5kg，粗粉碎至20目，用100%的乙醇超声提取2次，每次50min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/3；静置，滤除沉淀物，浓缩成500g浸膏a；在浸膏a中加入500g的水，用与水等体积的氯仿萃取3次，合并萃取相，减压浓缩成258g浸膏b；用160目硅胶2064g装柱，在浸膏b中加入774g的丙酮溶解，然后加入80目硅胶213g拌样，拌样后上柱；用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的正己烷-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；体积比9:1的正己烷-丙酮混合有机溶剂的洗脱液c为69g；用反相材料C-18装柱，洗脱液c上反相柱，以体积含量为20~100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量50~70%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以60%的甲醇为流动相，流速14ml/min，21.2′250mm，5mm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样45mL，收集27min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的联苯类化合物neglignan D。

实施例3

取干燥的五味子属乔木枝条、叶和/或果实6kg，粗粉碎至30目，用80%的甲醇超声提取4次，每次30min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/2；静置，滤除沉淀物，浓缩成599g浸膏a；在浸膏a中加入1118g的水，用与水等体积的乙醚萃取4次，合并萃取相，减压浓缩成342g浸膏b；用180目硅胶2394g装柱，在浸膏b中加入680g的丙酮溶解，然后加入90目硅胶 410.4g拌样，拌样后上柱；用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的氯仿-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；体积比9:1的氯仿-丙酮混合有机溶剂的洗脱液c为65g；用反相材料C-18装柱，洗脱液c上反相柱，以体积含量为20~100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量50~70%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以65%的甲醇为流动相，流速12ml/min，21.2′250mm，5mm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样50mL，收集23min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的联苯类化合物neglignan D。

实施例4

取干燥的五味子属乔木枝条、叶和/或果实5.5kg，粗粉碎至40目，用90%的乙醇超声提取3次，每次45min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/4；静置，滤除沉淀物，浓缩成530g浸膏a；在浸膏a中加入795g的水，用与水等体积的石油醚萃取4次，合并萃取相，减压浓缩成265g浸膏b；用160目硅胶1445g装柱，在浸膏b中加入397.5g的丙酮溶解，然后加入80目硅胶265g拌样，拌样后上柱；用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的石油醚-丙酮混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；体积比9:1的石油醚-丙酮混合有机溶剂的洗脱液c为62g；用反相材料C-18装柱，洗脱液c上反相柱，以体积含量为20~100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量50~70%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以70%的甲醇为流动相，流速10ml/min，21.2′250mm，5mm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254nm，收集15min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的联苯类化合物neglignan D。

实施例5

取干燥的五味子属乔木枝条、叶和/或果实5kg，粗粉碎至20目，用70%的甲醇超声提取4次，每次35min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/2；静置，滤除沉淀物，浓缩成520g浸膏a；在浸膏a中加入1040g的水，用与水等体积的苯萃取5次，合并萃取相，减压浓缩成240g浸膏b；用200目硅胶1680g装柱，在浸膏b中加入720g的丙酮溶解，然后加入100目硅胶192g拌样，拌样后上柱；用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的石油醚-乙酸乙酯混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；体积比9:1的石油醚-乙酸乙酯混合有机溶剂的洗脱液c为60g；用反相材料C-18装柱，洗脱液c上反相柱，以体积含量为20~100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量50~70%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以50%的甲醇为流动相，流速12ml/min，21.2′250mm，5mm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254nm，收集35min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的联苯类化合物neglignan D。

实施例6

取实施例1制备的化合物neglignan D，为黄色胶状物；测定方法为：用核磁共振，结合其它波谱技术鉴定结构。

（1）紫外光谱（溶剂为甲醇），λ _max（log ε）：210 (4.65), 276 (3.68), 320 (1.42) nm；

（2）红外光谱（溴化钾压片）ν _max 3408, 3082, 2935, 2853, 1730, 1625, 1551, 1476, 1428, 1380, 1164, 1135, 1058, 976, 887 cm^–1；

（3）HRESIMS显示本发明化合物准分子离子峰m/z 441.1529 [M+Na]⁺（计算值为441.1525），结合¹³C 和¹H NMR谱（图1和图2，碳谱氢谱数据归属见表1）给出其分子式为C₂₂H₂₆O₈。¹H NMR（C₅D₅N，500 MHz）和¹³C NMR（C₅D₅N，125 MHz）数据，见表1。

Neglignan D的¹H NMR和¹³C NMR谱(图2) 显示一个苯环(δ _C 148.0 s, 138.9 s, 152.0 s, 107.0 d, 128.5 s, 119.9 s)、一个芳香氢(δ _H 6.59 s)、一个亚甲基(δ _C 49.8 t), 一个酮羰基(δ _C 208.9 s), 一个甲基 (δ _C 30.3 q), 两个甲氧基 (δ _C61.0, 55.8 q) 信号。这些信号可归属为一个基本的苯环骨架和一个丙酮基。但化合物的分子式为C₂₂H₂₆O₈, 说明该化合物是一个存在对称结构的7,8位断裂的联苯环辛烯木脂素。HMBC谱中H-17,18 (δ _H2.24) 与C-6,9 (δ _C 49.8)和C-7,8 (δ _C 208.9)相关, H-6,9 (δ _H 4.02) 与C-7,8 (δ _C 208.9) 、C-17,18 (δ _C 30.3)、 C-4,11 (δ _C 107.0)、C-5,10 (δ _C 128.5)和C-15,16 (δ _C 119.9)相关，以及H-4,11 (δ _H 6.59) 与 C-6,9 (δ _C 49.8)相关，说明两个 (-CH₂C(O)CH₃)基团分别位于C-5和C-10位。HMBC谱中羟基氢(d _H10.85) 与C-1, 14 (d _C 148.0), C-2, 13 (d _C 138.9), 和C-15, 16 (d _C 119.9)相关, 两个甲氧基氢(d _H 3.88, 3.89)与C-2,13 (d _C 138.9)和C-3,12 (d _C 152.0)相关, 说明两个酚羟基分别位于C-1和C-14, 四个甲氧基分别位于C-2, C-3, C-12, 和C-13。因此，化合物的结构得到确定,命名为neglignan D。

实施例7

取实施例2制备的化合物，为黄色胶状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为C₂₂H₂₆O₈。确认实施例2制备的化合物为所述的联苯类化合物neglignan D。

实施例8

取实施例3制备的化合物，为黄色胶状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为C₂₂H₂₆O₈。确认实施例3制备的化合物为所述的联苯类化合物neglignan D。

表1 化合物的¹H和¹³C NMR数据（溶剂为C₅D₅N）(125 and 500 MHz)

实施例9

取实施例4制备的化合物，为黄色胶状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为C₂₂H₂₆O₈。确认实施例4制备的化合物为所述的联苯类化合物neglignan D。

实施例10

取实施例5制备的化合物，为黄色胶状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为C₂₂H₂₆O₈。确认实施例5制备的化合物为所述的联苯类化合物neglignan D。

实施例11

取实施例1~5所制备的任一联苯类化合物进行细胞毒活性检测试验，试验情况如下：

细胞株: 白血病细胞(NB4)、肺癌细胞(A549)、人神经母细胞瘤细胞(SHSY5Y)、前列腺癌细胞(PC3)、乳腺癌细胞(MCF7) 均由中国科学院上海药物研究所提供。

实验设计: 以上细胞与不同浓度化合物温育72小时, 每株细胞的实验均重复一次, 用两次实验的结果进行数据处理, 采用改良MTT 法及SRB 法评价化合物对细胞增殖的抑制程度, 计算抑制率, 根据抑制率采用Logit方法计算IC₅₀, 比较化合物的体外抗肿瘤活性。

细胞的增殖抑制率 = (空白对照OD值-加药孔的OD值) /空白对照OD值×100%。

取处于对数生长期的悬浮细胞, 将细胞浓度调整为4×10⁴/ml, 加入96 孔培养板, 90 μL/孔。阳性对照为顺铂, 用生理盐水溶解。每孔分别加入10μl 不同浓度的样品(1号试液-5号试液)。加样组及对照组均设4 个复孔, 加样组、阳性对照组的高浓度组还设培养基的加药平行孔, 每块板均设有4 个空白对照孔 (仅加培养基)。样品的终浓度分别为10^-2、10^-1、1、10 及10² μg/mL, 相应DMSO的终浓度分别为0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%、0.00001%。样品在终浓度10² μg/mL时, 用0.1% DMSO作为溶剂对照, 其余浓度均用生理盐水作阴性对照。阳性对照药顺铂的终浓度为10^-1、1、10 μg/mL。细胞在37℃, 5% CO₂ 培养箱中分别孵育48h 后, 加入MTT (5 mg/ml, Sigma), 10 μL/孔。继续培养4 h后, 加入三联液 [10% SDS – 5%异丁醇 – 0.012mol/L HCL (w/v/v)], 100 μL/孔, 放置过夜后用酶标仪在570 nm、630 nm双波长下测定各孔的OD 值。

取处于对数生长期的贴壁细胞株, 用25%胰酶常规消化后, 再用15%小牛血清完全RPMI-1640培养基将细胞浓度调整为5×10⁴/mL, 加入96 孔培养板, 90 μL/孔。细胞在37℃, 5% CO₂培养箱中分别孵育24h 后加入阳性对照、阴性对照以及受试样品(各受试浓度同上MTT 法，10 μL/孔)，样品的终浓度分别为10^-2、10^-1、1、10、10² μg/mL, 相应DMSO 的终浓度分别为0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%、0.00001%。样品在终浓度10² μg/mL时用0.1%DMSO 作为溶剂对照, 其余浓度均用生理盐水作阴性对照。阳性对照药顺铂的终浓度为10^-1、1、10 μg/mL, 阴性对照为等体积的生理盐水。加样组及对照组均设4复孔, 加样组、阳性对照组的高浓度组还设培养基的加药平行孔, 每块板均设有4个空白对照孔 (仅加培养基)。将96 孔培养板置于37℃, 5% CO₂ 培养箱中孵育 (细胞与样品作用) 48h 后, 加入4℃、50%的TCA (三氯乙酸) 50 μL/孔。加完TCA后, 将96 孔培养板置于4℃孵育1小时, 取出培养板, 轻轻倾去板内液体。用自来水轻轻冲洗5遍 (将自来水由烧杯中轻轻倒入板中, 轻晃后再将水倒去), 置于空气中风干至不见水痕。然后加入配制好的0.4% SRB (用1%乙酸稀释), 50 μL/孔, 于室温下静置染色30分钟后倾去SRB 溶液, 用1%乙酸冲洗4遍, 以除去未与蛋白质结合的染料。置于空气中风干至无水痕后, 加入10 mM 未缓冲Tris (缓血氨酸) 溶液150 μL/孔 (PH10, 用三蒸水配制), 将染料溶解后, 于振荡器上振荡5分钟, 用酶标仪在570nm 波长下读取各孔OD 值。

实验结果表明：经对白血病急性早幼粒NB4细胞、肺腺癌A549细胞、人骨髓神经母细胞瘤SHSY5Y细胞、人前列腺癌PC3细胞、人乳腺癌MCF7细胞的细胞毒活性实验，neglignan D对NB4, A549，SHSY5Y, PC3 和MCF7细胞株具有较好的细胞毒活性，IC₅₀值分别达2.9、8.6、3.3、5.1、7.8 μM。

表2 化合物的细胞毒活性

Claims

1.一种联苯类化合物的制备方法，其特征在于所述的联苯类化合物是以干燥的五味子属乔木枝条、叶或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到的，该化合物分子式为C₂₂H₂₆O₈，命名为neglignan D，具有下述结构式：

；其制备方法具体为：

A、浸膏提取：将五味子属乔木枝条、叶或果实粗粉碎到20~40目，用有机溶剂超声提取2~4次，每次30~60min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩提取液至 1/4 ~ 1/2 体积时，静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏a；该步骤所述的有机溶剂为70~100%的丙酮、乙醇或甲醇中的一种；

B、有机溶剂萃取：浸膏a中加入重量比1~2倍量的水，用与水等体积的有机溶剂萃取3~5次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏b；该步骤所述的有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚或苯中的一种；

C、硅胶柱层析：将浸膏b用重量比1.5~3倍量的丙酮溶解，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为160~200目，用量为浸膏b重量6~8倍量；用体积比为1:0~0:1的混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；该步骤所述的混合有机溶剂为正己烷-丙酮、氯仿-丙酮、氯仿-甲醇、石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙酯；

E、高效液相色谱分离：将以体积含量45~75%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液经高效液相色谱分离纯化，所述的高效液相色谱分离纯化是以50~70%的甲醇为流动相，流速10~14ml/min，21.2mm×250 mm、5μm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样45~60mL，收集15~35min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的联苯类化合物neglignan D。

2.根据权利要求1所述的联苯类化合物的制备方法，其特征在于所述C步骤中浸膏在上硅胶柱层析前，用浸膏重0.8~1.2倍的80~100目硅胶拌样。

3.根据权利要求2所述的联苯类化合物的制备方法，其特征在于C步骤所述的混合有机溶剂的体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1。

4.一种权利要求1所述制备联苯类化合物在制备抗癌药物中的应用。