CN103012117B - 一种降木脂素类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种降木脂素类化合物及其制备方法和应用，所述化合物的，结构式为：所述的R1为-OH，R2为-H，分子式为C13H18O7，该化合物命名为marphenolC；所述的R1为-OCH3、R2为-OH，分子式为C14H20O8，该化合物命名为marphenolD。所述的方法是以干燥的五味子枝条、叶和/或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到的。所述的降木脂素类化合物在制备抗艾滋病药物中的应用。经过对C8166宿主细胞的细胞毒性检测，以及对HIV-1IIIB诱导C8166细胞病变的抑制试验，marphenolE、marphenolF均表现出较好的anti-HIV-1活性，EC50值分别为3.14μg/mL，3.22μg/mL，治疗指数（TI）values分别为26.91、26.13。本发明化合物结构新颖、活性好，在制备抗艾滋药物中有良好的应用前景，可作为抗艾滋病药物的先导性化合物。
Description
技术领域
本发明属于植物有效成分提取技术领域，具体涉及一种降木脂素类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
五味子为五味子科 （Schisandraceae），双子叶植物，有南五味子属（Kadsura） 和五味子属（Schisandra） 两属，共50种，分布于东亚、东南亚及北美南部, 我国两属均产之，约30余种, 产于西南部至东北部, 但主产地为西南部和中南部。五味子属（Schisandra）约有25种，我国有19种，分布于西南至东南部。
目前，从五味子科植物中分离得到的化合物主要为两大类：三萜（Triterpenes）类化合物和木脂素（Lignans）。三萜类化合物大多为羊毛甾烷型和环阿尔廷型, 由于其骨架易发生变化, 且由于氧化度不同使这类三萜化合物结构复杂独特。木脂素多为联苯环辛烯类。现代药理学研究表明木脂素和三萜是该科植物的主要活性成分，近年来有报道从五味子属植物中分离到的木脂素在抗HIV方面具有一定的潜力。因此对该属植物的继续深入研究显得尤为重要。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种降木脂素类化合物；第二目的在于提供上述降木脂素类化合物的制备方法；第三目的在于提供上述降木脂素类化合物及其合成类似物的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述降木脂素类化合物是以干燥的五味子枝条、叶和/或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到的，其结构式为：
。
所述的R1 为-OH，R2 为-H，分子式为C13H18O7，该化合物命名为marphenol C。
所述的R1为-OCH3、R2为-OH，分子式为C14H20O8，该化合物命名为marphenol D。
本发明的第二目的是这样实现的，是以干燥的五味子枝条、叶和/或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到的，具体步骤为：
A、浸膏提取：将五味子枝条、叶和/或果实粗粉碎至20~40目，用有机溶剂超声提取2~5次，每次30~60min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/4 ~ 1/2；静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏a；
B、有机溶剂萃取：浸膏a中加入重量比1~2倍量的水，用与水等体积的有机溶剂萃取3~5次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏b；
C、硅胶柱层析：将浸膏b用重量比1.5~3倍量的丙酮溶解，然后用浸膏重0.8~1.2倍的80~100目硅胶硅胶拌样，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为160~200目，用量为浸膏b重量6~8倍量；用体积比为1:0~0:1的有机溶剂溶液梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
D、反相柱层析：将C步骤洗脱液的9:1部分上反相柱层析，反相柱是用反相材料C-18装柱；用体积含量为20~100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
E、高效液相色谱分离：将D步骤洗脱液的20%~30%的甲醇水溶液洗脱部分经高效液相色谱分离纯化，即得所述的降木脂素类化合物；
F、E步骤所述的高效液相色谱分离纯化是以25~45%的甲醇为流动相，流速10~14ml/min，21.2′ 250 mm，5mm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样50~60mL，收集10~25min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的降木脂素类化合物marphenol C。
G、E步骤所述的高效液相色谱分离纯化是以25~45%的甲醇为流动相，流速10~14ml/min，21.2′ 250 mm，5mm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样50~60mL，收集25~40min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的降木脂素类化合物marphenol D。
本发明的第三目的是这样实现的，所述的降木脂素类化合物在制备抗艾滋病药物中的应用。
本发明所述的降木脂素类化合物是首次被分离出来的，通过核磁共振和质谱测定方法确定了为降木脂素类化合物，并表征了其具体结构为：
其异构体化合物marphenol C、marphenol D能通过本发明的方法分离出来。以marphenol C、marphenol D为原料，经过对C8166 宿主细胞的细胞毒性检测，以及对HIV-1IIIB 诱导C8166 细胞病变（CPE）的抑制试验，marphenol E、marphenol F均表现出较好的anti-HIV-1活性，EC50 值分别为3.14 μg/mL、3.22μg/mL，治疗指数（TI）分别为26.91、26.13。本发明化合物结构新颖、活性好，在制备抗艾滋药物中有良好的应用前景，可作为抗艾滋病药物的先导性化合物。
附图说明
图1为化合物marlphenol C的核磁共振碳谱（13C NMR）；
图2为化合物marlphenol C的核磁共振氢谱（1H NMR）；
图3为化合物marlphenol D的核磁共振碳谱（13C NMR）；
图4为化合物marlphenol D的核磁共振氢谱（1H NMR）；
图5为化合物的marlphenol C主要HMBC（→）和1H-1H COSY （–）相关。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
本发明所述降木脂素类化合物是以干燥的五味子枝条、叶和/或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到的，其结构式为：
。
所述的R1 为-OH，R2 为-H，分子式为C13H18O7，该化合物命名为marphenol C。
所述的R1为-OCH3、R2为-OH，分子式为C14H20O8，该化合物命名为marphenol D。
本发明所述的降木脂素类化合物的方法是以干燥的五味子枝条、叶和/或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到的，具体步骤为：
A、浸膏提取：将五味子枝条、叶和/或果实粗粉碎至20~40目，用有机溶剂超声提取2~5次，每次30~60min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/4 ~ 1/2；静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏a；
B、有机溶剂萃取：浸膏a中加入重量比1~2倍量的水，用与水等体积的有机溶剂萃取3~5次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏b；
C、硅胶柱层析：将浸膏b用重量比1.5~3倍量的丙酮溶解，然后用浸膏重0.8~1.2倍的80~100目硅胶硅胶拌样，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为160~200目，用量为浸膏b重量6~8倍量；用体积比为1:0~0:1的有机溶剂溶液梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
D、反相柱层析：将C步骤洗脱液的9:1部分上反相柱层析，反相柱是用反相材料C-18装柱；用体积含量为20~100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
E、高效液相色谱分离：将D步骤洗脱液的20%~30%的甲醇水溶液洗脱部分经高效液相色谱分离纯化，即得所述的降木脂素类化合物；
F、E步骤所述的高效液相色谱分离纯化是以25~45%的甲醇为流动相，流速10~14ml/min，21.2′ 250 mm，5mm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样50~60mL，收集10~25min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的降木脂素类化合物marphenol C；
G、E步骤所述的高效液相色谱分离纯化是以25~45%的甲醇为流动相，流速10~14ml/min，21.2′ 250 mm，5mm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样50~60mL，收集25~40min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的降木脂素类化合物marphenol D。
所述的五味子为鹤庆五味子。本发明以五味子为原料，不受地区和种的限制，均可以实现本发明，优选鹤庆五味子。鹤庆五味子（Schisandra wilsoniana A. C. Smith），产于云南西北部、海拔1800~2600米的丛林中或溪沟边。
A步骤所述的有机溶剂为70~100%的丙酮、乙醇或甲醇中的一种。
B步骤所述的有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚或苯中的一种。
C步骤所述的有机溶剂溶液为正己烷-丙酮、氯仿-丙酮、氯仿-甲醇、石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙酯中的一种，有机溶剂溶液的体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1。
E步骤所述的高效液相色谱分离纯化是以25~45%的甲醇为流动相，流速10~14ml/min，21.2′ 250 mm，5mm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样50~60mL，收集10~40min的色谱峰，多次累加后蒸干。
本发明所述的降木脂素类化合物在制备抗艾滋病药物中的应用。以本发明所述的降木脂素类化合物为模板合成的化合物同样能够实现本发明的目的。
实施例1
取鹤庆五味子的枝条、叶和/或果实4.5kg，粗粉碎至40目，用70%的丙酮超声提取5次，每次60min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/4；静置，滤除沉淀物，浓缩成523g浸膏a；在浸膏a中加入784.5g水，用与水等体积的乙酸乙酯萃取5次，合并萃取相，减压浓缩成385g浸膏b；用200目硅胶2310g装柱，在浸膏b中加入577.5g的丙酮溶解，然后加入100目硅胶385g拌样，拌样后上柱；用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的氯仿-甲醇有机溶剂溶液梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到6个部分，体积比9:1的氯仿-甲醇有机溶剂溶液的洗脱液c为63g；用反相材料C-18装柱，洗脱液c上反相柱，以体积含量为20~100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量25~30%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，以28%的甲醇为流动相，流速10ml/min，21.2′250mm，5mm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样50mL，收集23min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的降木脂素类化合物marphenol C；收集37min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的降木脂素类化合物marphenol D。
实施例2
取鹤庆五味子的枝条、叶和/或果实5kg，粗粉碎至20目，用100%的乙醇超声提取2次，每次50min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/3；静置，滤除沉淀物，浓缩成600g浸膏a；在浸膏a中加入600g 的水，用与水等体积的氯仿萃取3次，合并萃取相，减压浓缩成428g浸膏b；用160目硅胶3.42Kg装柱，在浸膏b中加入1284g的丙酮溶解，然后加入80目硅胶342.4g拌样，拌样后上柱；用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的正己烷-丙酮有机溶剂溶液梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；用反相材料C-18装柱，洗脱液c上反相柱，以体积含量为20~100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量30~40%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，以25%的甲醇为流动相，流速14ml/min，21.2′250mm，5mm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每次进样50mL，收集25min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的降木脂素类化合物marphenol C；收集40min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的降木脂素类化合物marphenol D。
实施例3
取鹤庆五味子的枝条、叶和/或果实6kg，粗粉碎至30目，用80%的甲醇超声提取4次，每次30min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/2；静置，滤除沉淀物，浓缩成635g浸膏a；在浸膏a中加入1270g的水，用与水等体积的乙醚萃取4次，合并萃取相，减压浓缩成500g浸膏b；用180目硅胶3.5Kg装柱，在浸膏b中加入1000g的丙酮溶解，然后加入90目硅胶600g拌样，拌样后上柱；用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的氯仿-丙酮有机溶剂溶液梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；用反相材料C-18装柱，洗脱液c上反相柱，以体积含量为20~100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量25~30%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，以45%的甲醇为流动相，流速12ml/min，21.2′250mm，5mm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样60mL，收集10min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的降木脂素类化合物marphenol C；收集25min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的降木脂素类化合物marphenol D。
实施例4
取鹤庆五味子的枝条、叶和/或果实5.5kg，粗粉碎至40目，用90%的乙醇超声提取3次，每次45min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/4；静置，滤除沉淀物，浓缩成612g浸膏a；在浸膏a中加入918g的水，用与水等体积的石油醚萃取4次，合并萃取相，减压浓缩成496g浸膏b；用160目硅胶2976g装柱，在浸膏b中加入744g的丙酮溶解，然后加入80目硅胶496g拌样，拌样后上柱；用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的石油醚-丙酮有机溶剂溶液梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；用反相材料C-18装柱，洗脱液c上反相柱，以体积含量为20~100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量25~30%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，以35%的甲醇为流动相，流速10ml/min，21.2′250mm，5mm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样55mL，收集20min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的降木脂素类化合物marphenol C；收集35min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的降木脂素类化合物marphenol D。
实施例5
取鹤庆五味子的枝条、叶和/或果实5kg，粗粉碎至20目，用70%的甲醇超声提取5次，每次35min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/2；静置，滤除沉淀物，浓缩成590g浸膏a；在浸膏a中加入1180g的水，用与水等体积的苯萃取5次，合并萃取相，减压浓缩成475g浸膏b；用200目硅胶3325g装柱，在浸膏b中加入1425g的丙酮溶解，然后加入100目硅胶380g拌样，拌样后上柱；用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的石油醚-乙酸乙酯有机溶剂溶液梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；用反相材料C-18装柱，洗脱液c上反相柱，以体积含量为20~100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；取以体积含量25~30%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，以40%的甲醇为流动相，流速12ml/min，21.2′250mm，5mm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样50mL，收集15min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的降木脂素类化合物marphenol C；收集30min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的降木脂素类化合物marphenol D。
实施例6
取实施例1制备的化合物marphenol C，为白色无定形粉末；旋光值[a]25.8 D + 18.6 （溶剂为甲醇c 0.20）；测定方法为：用核磁共振，结合其它波谱技术鉴定结构。
1）紫外光谱（溶剂为甲醇），λ max （log e）: 205 （4.87）, 278 （4.12）, 326 （2.26） nm；
2）红外光谱（溴化钾压片），n max 3450, 2962, 2941, 2872, 2830, 1618, 1590, 1462, 1378, 1345, 1272, 1225, 1165, 1140, 970, 820 cm-1；
3）HRESIMS显示本发明化合物准分子离子峰m/z 309.0954 [M+Na]+ （计算值为309.0950），结合13C 和1H NMR谱（图-1和图-2，碳谱数据归属见表-1） 给出其分子式C13H18O7，不饱和度为5。1H NMR（C5D5N, 500 MHz） δ7.25（1H, s, H-2）, 7.01（1H, d, J = 8.1 Hz, H-5）, 7.14（1H, d, J = 8.1 Hz, H-6）, 4.80 （1H, d J = 8.1 Hz, H-7）, 3.30（1H, m, H-8）, 4.29-4.45（2 H, overlap, H-7￠）, 3.61 （1H, m, H-8￠）, 4.29-4.45（2 H, overlap, H-9￠）, 11.3（1H, brs, -COOH）, 10.43 （1H, brs, Ar-OH）, 3.75（3H s, -OMe）, 13C NMR 数据见表1。
化合物marphenol C的1H 和13C NMR谱图分别显示18个氢和13个碳信号, 对应于1个苯环的3个芳香氢（δ H 7.01, 7.18, and 7.23），2个被氧化的亚甲基（δ C 70.4 and 70.4），2个次甲基（δ C 46.7 and 48.6），1个被氧化的次甲基（δ C 86.7），1个羧基（δ C 178.9）和1个甲氧基（δ C 55.9）。HMBC谱中 H-7 与苯环的碳相关 （C-2, 和C-6）, 以及2个苯环氢H-2 （δ H 7.25）, H-6 （δ H 7.23）与C-7 （δ C 86.7）相关，说明苯环与（C-7）相连。H-7/H-8/H-8'/H-9'和H-8'/H-7'的1H-1H COSY相关信号,以及HMBC谱中H-7（δ H 4.81）与C-8（δ C 48.6）,C-9（δ C 178.9），和C-8'（δ C 46.7）相关, H-7'（δ H 4.32）与C-8'（δ C 46.7）, C-9'（δ C 70.42）,和C-8（δ C 48.6）相关,羧基氢（δ H 11.3）与C-8 （δ C 48.6）相关说明在该化合物中存在OH-CH2-CH（OH-CH2）-CH（COOH）-CHOH结构单元。苯环氢信号耦合常数说明苯环为1,2,4取代。在苯环上甲氧基（δ H 3.75, s）与C-3（δ C 149.0）的HMBC相关，说明甲氧基的位置在 C-3位。羟基（δ H 10.4）与C-3 （δ C 149.0）, C-4 （δ C 148.3） 和 C-5 （δ C 116.5）的HMBC相关，表明羟基在C-4位。至此该化合物的结构得到确定。
实施例7
取实施例1制备的化合物marphenol D，为白色无定形粉末；旋光值[a]25.4 D + 22.5 （溶剂为甲醇c 0.21）；测定方法为：用核磁共振，结合其它波谱技术鉴定结构。
1）紫外光谱（溶剂为甲醇），λ max （log e）: 210 （4.82）, 276 （4.15）, 325 （2.30） nm；
2）红外光谱 （溴化钾压片） n max 3452, 2958, 2939, 2875, 2824, 1622, 1592, 1472, 1375, 1343, 1267, 1229, 1166, 1138, 976, 819 cm-1；
3） HRESIMS显示本发明化合物准分子离子峰m/z 339.1051 [M+Na]+ （计算值为339.1056），结合13C 和1H NMR谱（图-3和图-4，碳谱数据归属见表-1） 给出其分子式C14H20O8，不饱和度为5。1H NMR （C5D5N, 500 MHz） δ7.06（1H, s, H-2）, 7.35 （1H, s, H-6）, 4.82（1H, d J = 8.1 Hz, H-7）, 3.23（1H, m, H-8）, 4.34 - 4.38 （2 H, overlap, H-7￠）, 3.59（1H, m, H-8￠）, 4.34 -4.38（2 H, overlap, H-9￠）, 3.89, 3.92（3H s, 2 × -OMe）, 13C NMR 数据见表1。
化合物marphenol D 的1H 和13C NMR spectra 显示20个氢信号和14个碳信号，分别对应于1个苯环上的2个芳香氢，2个被氧化的亚甲基，2个次甲基，1个被氧化的次甲基，1个羧基和两个甲氧基。化合物marphenol D 的1H和13C NMR与marphenol C的非常相似。 通过对比发现，这两个化合物的区别在于marphenol D中多了1个甲氧基。HMBC相关信号说明2个甲氧基分别在C-3 和C-4位，1个羟基取代位置在 C-5位。 至此该化合物的结构得到确定。
表1 化合物的13C NMR数据（溶剂为C5D5N）
| 原子 | marlphenol C | marlphenol D | 原子 | marlphenol C | marlphenol D |
| 1 | 131.2 s | 132.5 s | 8 | 48.6 d | 47.9 d |
| 2 | 110.8 d | 105.1 d | 9 | 178.9 s | 178.8 d |
| 3 | 149.0 s | 151.2 s | 7￠ | 70.4 t | 69.8 t |
| 4 | 148.3 s | 136.7 s | 8￠ | 46.7 d | 46.8 d |
| 5 | 116.5 d | 148.0 s | 9￠ | 70.4 t | 69.8 t |
| 6 | 119.8 d | 110.2 d | OMe-3 | 55.9 s | 55.6 s |
| 7 | 86.7 d | 85.1 s | OMe-4 | 55.7 s |
实施例8
取实施例2制备的化合物marphenol C、marphenol D分别按实施例6、7中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6、7，分子式分别为C13H18O7和C14H20O8。
实施例9
取实施例3制备的化合物marphenol C、marphenol D分别按实施例6、7中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6、7，分子式分别为C13H18O7和C14H20O8。
实施例10
取实施例4制备的化合物marphenol C、marphenol D分别按实施例6、7中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6、7，分子式分别为C13H18O7和C14H20O8。
实施例11
取实施例5制备的化合物marphenol C、marphenol D分别按实施例6、7中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6、7，分子式分别为C13H18O7和C14H20O8。
实施例12
取实施例1制备的降木脂素类化合物（marphenol C）进行anti-HIV-1活性试验，如下：
测定药物和化合物：待测样品用DMSO 溶解,阳性对照化合物叠氮胸苷（AZT, 3′-Azido-3′-deoxythymidine）购自Sigma 公司，溶解于RPMI-1640 完全培养基中, 0.22 μm 滤膜过滤除菌, 分装后-20℃保存。
试剂：HEPES（N-2 （2-Hydroxyothyl） piperazine-N'-（2-ethanesufonic acid）、MTT （3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyl tetrazolium bromide）、DMF（N, N′-Dimethyl formamine）、青霉素（Penicillin）、硫酸链霉素（Streptomycin sulfate）、谷氨酰胺（Glutamine）均购自Sigma公司；DMSO、2-巯基乙醇（2-Me,2-Mercaptoethanol）为Bio-Rad 公司产品；RPMI-1640和新生小牛血清为Gibco公司产品。
培养基：RPMI-1640 完全培养基, 含有10 %新生小牛血清, 2 mM L-谷氨酰胺, 10 mM HEPES, 50μM 2-巯基乙醇, 100,000 IU 青霉素, 100 μg/mL 链霉素。
细胞和病毒：人T淋巴细胞系C8166, MT4 以及HIV-1 实验株HIV-1IIIB 均来自于英国Medical Research Council, AIDS Reagent Project。所有细胞和病毒均以含10%小牛血清的RPMI-1640完全培养基进行培养。按常规方法制备HIV-1IIIB, 滴定并计算出病毒的TCID50。病毒贮存液分装后, 置-70℃保存。细胞和病毒按常规方法冻存和复苏。
HIV-1 感染性滴定：按Johnson＆Byington 所述方法改良进行滴定,如下: 将HIV-1IIIB 贮存液在96孔板上作4倍稀释, 10个梯度, 每梯度6个重复孔, 同时设置对照孔6孔。每孔加入C8166细胞50μL（4×105/mL）, 每孔终体积为200 μL，37℃, 5% CO2培养。第三天补加新鲜RPMI-1640完全培养基100 μL, 第七天在倒置显微镜下观察每孔中HIV-1诱导的细胞病变效应（Cytopathic Effect, CPE）, 以每孔是否有合胞体（Syncytium）的形成确定; 按Reed＆Muench方法计算病毒的TCID50（50% Tissue Culture Infection Dose）。
样品对C8166 宿主细胞的细胞毒性检测：4×105/mL C8166细胞悬液100 μL与不同的待测化合物溶液混合, 设三个重复孔。同时设置不含化合物的对照孔, 37℃, 5% CO2培养三天, 采用MTT比色法检测细胞毒性。ELx800 ELISA仪测定OD值, 测定波长为595 nm, 参考波长为630 nm。计算得到CC50 值 （50% Cytotoxic Concentration）, 即对50%的正常T淋巴细胞系C8166产生毒性时的化合物浓度。
样品对HIV-1IIIB 诱导C8166 细胞病变（CPE）的抑制试验：将8×105/mL C8166 细胞50 μL/孔接种到含有100 μL/孔倍比稀释化合物的96 孔细胞培养板上, 然后加入50 μL 的HIV-1IIIB 稀释上清 （M.O.I.0.0016）。设三个重复孔。同时设置不含化合物的正常细胞对照孔, 37℃, 5% CO2 培养三天, 倒置显微镜下（100×）计数合胞体的形成。EC50（50% Effective Concentration）为抑制合胞体形成50%时的化合物浓度。
计算公式：根据实验结果绘制剂量反应曲线, 按Reed＆Muench 法计算出化合物抑制病毒的50％有效浓度 （EC50）, 50％抑制细胞生长浓度 （CC50） 及抗HIV-1 活性的治疗指数TI 值 （Therapeutic index） 为: TI = CC50/EC50。
试验结果：经对C8166 宿主细胞的细胞毒性检测，以及对HIV-1IIIB 诱导C8166 细胞病变（CPE）的抑制试验，marphenol C具有较好的anti-HIV-1活性，EC50 值为3.14 μg/mL，治疗指数 （TI）values为26.91（见表2）。以上结果揭示了marphenol C结构新颖活性好，在制备抗艾滋药物中有良好的应用前景，可作为抗艾滋病药物的先导性化合物。
表2 化合物的Anti-HIV活性
实施例13
取实施例1制备的降木脂素类化合物（marphenol D）按实施例12的方法进行anti-HIV-1活性试验，结果如下：经对C8166 宿主细胞的细胞毒性检测，以及对HIV-1IIIB诱导C8166细胞病变（CPE）的抑制试验，marphenol D具有较好的anti-HIV-1活性，EC50 值为3.22μg/mL，治疗指数（TI）values为26.13（见表2）。以上结果揭示了marphenol D结构新颖活性好，在制备抗艾滋药物中有良好的应用前景，可作为抗艾滋病药物的先导性化合物。
Claims (4)
1. 一种降木脂素类化合物，其特征是：所述降木脂素类化合物是以干燥的五味子枝条、叶和/或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到的，其结构式为：
；R1 为-OH，R2 为-H，分子式为C13H18O7，该化合物命名为marphenol C；R1为-OCH3、R2为-OH，分子式为C14H20O8，该化合物命名为marphenol D。
2. 一种制备权利要求1所述的降木脂素类化合物的方法，其特征在于是以干燥的五味子枝条、叶和/或果实为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到的，具体步骤为：
A、浸膏提取：将五味子枝条、叶和/或果实粗粉碎至20~40目，用有机溶剂超声提取2~5次，每次30~60min，提取液合并；提取液过滤，减压浓缩至体积的1/4 ~ 1/2；静置，滤除沉淀物，浓缩成浸膏a；该步骤所述的有机溶剂为70~100%的丙酮、乙醇或甲醇中的一种；
B、有机溶剂萃取：浸膏a中加入重量比1~2倍量的水，用与水等体积的有机溶剂萃取3~5次，合并有机溶剂萃取相，减压浓缩成浸膏b；该步骤所述的有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚或苯中的一种；
C、硅胶柱层析：将浸膏b用重量比1.5~3倍量的丙酮溶解，然后用浸膏重0.8~1.2倍的80~100目硅胶拌样，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为160~200目，用量为浸膏b重量6~8倍量；用体积比为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的有机溶剂溶液梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；该步骤所述的有机溶剂溶液为正己烷-丙酮、氯仿-丙酮、氯仿-甲醇、石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙酯中的一种；
D、反相柱层析：将C步骤洗脱液的9:1部分上反相柱层析，反相柱是用反相材料C-18装柱；用体积含量为20~100%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
E、高效液相色谱分离：将D步骤洗脱液的20%~30%的甲醇水溶液洗脱部分经高效液相色谱分离纯化，以25~45%的甲醇为流动相，流速10~14ml/min，21.2×250mm、5μm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样50~60mL，收集10~40min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的降木脂素类化合物marphenol C和marphenol D；
F、E步骤所述的高效液相色谱分离纯化是以25~45%的甲醇为流动相，流速10~14ml/min，21.2×250mm、5μm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样50~60mL，收集10~25min、不包括25min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的降木脂素类化合物marphenol C；
G、E步骤所述的高效液相色谱分离纯化是以25~45%的甲醇为流动相，流速10~14ml/min，21.2×250 mm、5μm 的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254nm，每次进样50~60mL，收集25~40min、不包括25min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的降木脂素类化合物marphenol D。
3. 根据权利要求2所述的降木脂素类化合物的制备方法，其特征是：所述的五味子为鹤庆五味子。
4. 一种权利要求1所述的降木脂素类化合物在制备抗艾滋病药物中的应用。
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