CN101555206A

CN101555206A - 一种狭叶木脂素及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101555206A
Application number: CNA2009100943550A
Authority: CN
Inventors: 李干鹏; 范鹏; 杨阳; 戴云; 杨海英; 杨丽娟
Original assignee: Yunnan Minzu University
Current assignee: Yunnan Minzu University
Priority date: 2009-04-15
Filing date: 2009-04-15
Publication date: 2009-10-14
Anticipated expiration: 2029-04-15
Also published as: CN101555206B

Abstract

本发明公开了一种狭叶木脂素化合物及其制备方法和应用。该化合物具有右述结构式。本发明将狭叶五味子藤茎晾干粉碎，粉碎后以丙酮分次用超声提取，合并提取液，过滤，减压浓缩提取液至小体积后，静置后滤除沉淀物，滤液用乙酸乙酯分3次萃取，获得乙酸乙酯部分萃取液。将萃取液浓缩成浸膏，浸膏用硅胶柱层析初分，然后采用高效液相半制备色谱进一步分离，即可获得所需化合物，对该化合物进行了抗HIV－1活性筛选，实验结果显示化合物显示出良好的抗HIV－1和抗氧化活性，其HIV－1治疗指数为22.5，抗氧化半数清除浓度IC50为8.22μg/L。

Description

一种狭叶木脂素及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种天然药物，更具体地说，本发明涉及一种从狭叶五味子提取分离得到新的木脂素。同时，本发明还涉及所述木脂素的制备方法和在制药领域中的应用。

背景技术

狭叶五味子[Schisandra lancifolia(Rehd.et Wils.)A.C.Smith]为落叶木质藤本植物，产于四川中南部、云南西部和西北部，生于海拔1000-3000米处。该植物全株可药用，味微苦、涩、性温，有止血接骨、去淤消肿之功效，用于跌打损伤、骨折、外伤出血等症。果实可用于治疗神经衰弱。该植物的研究结果表明其化学成分主要为木脂素、三萜、黄酮等。据文献报道，狭叶五味子藤茎、种子的乙醇提取物，对四氯化碳引起的小鼠肝损伤，有降低血清转氨酶的作用，尤以种子的作用明显。最近，孙汉董等对该植物的茎叶化学成分研究发现了一系列新奇的高氧化度的降三萜，并发现该植物具有抗HIV活性。

木脂素是五味子中的主要活性成分，五味子中木脂素成分具有对活性氧自由基损伤的拮抗作用、中枢神经的抑制作用，抗炎、抗胃溃疡、抗癌及抗HIV等活性。由于五味子科植物木脂素成分结构类型多，立体化学复杂，国内外对该领域的研究十分活跃。

发明内容

本发明通过对狭叶五味子的化学成分进行了深入研究，并对所获得的一种新化合物进行了抗HIV-1活性和抗氧化活性筛选。在此基础上，本发明的目的在于提供一种新的有药用价值的新化合物或先导化合物。

本发明的另一目的是提供一种所述新化合物的制备方法。

本发明进一步的目的是提供所述新化合物在制备抗爱滋病(HIV)和抗氧化的药物方面的用途。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

*除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

A.本发明从狭叶五味子中分离出了一种新化合物，该化合物用下述结构式表示：

该化合物被命名为狭叶木脂素S(Lancifolignans S)。

其中，MeO-表示甲氧基、AcO-表示乙酰基。

B.本发明提供了一种所述的狭叶木脂素的制备方法，该法采用下述步骤：

(1)以狭叶五味子为原料，将其藤茎晾干，粉碎到20～40目；

(2)以65％～75％的丙酮用超声提取3～5次，每次5天，期间每隔3～4小时超声提取一次，一次0.5～1.5小时；提取液合并、过滤，减压浓缩提取液至小体积，静置后滤除沉淀物；

(3)滤液用乙酸乙酯分2～4次萃取；合并乙酸乙酯萃取液并浓缩成浸膏，浸膏用氯仿溶解后用粗硅胶(80～100目)拌样；

(4)用200～300目的硅胶干法装柱进行硅胶柱层析粗分，将氯仿∶甲醇按20∶1～7∶3的配比，进行梯度洗脱，收集各个部分洗脱液；洗脱液的7∶3部分用高效液相色谱法分离纯化，流速为2.5～3.5mL/min，以甲醇/水为流动相，逐步调整二者比例逐级细分，即得到所需的狭叶木脂素。

C.对该化合物进行了抗HIV-1活性筛选，化合物显示出良好的抗HIV-1活性，其治疗指数为22.5。

D.对该化合物进行了抗氧化活性筛选，化合物显示出良好的抗氧化活性。其半数清除浓度IC50测定结果为8.22μg/L。

与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：(1)狭叶五味子在我国分布广泛，原料来源广；而且本发明化合物在狭叶五味子中含量较高，容易得到。(2)采用了常规柱层析和高效液相色谱结合的制备方法，化合物制备操作流程简单，所获得的本发明化合物纯度高，随后得工业化生产容易实现。(3)本发明化合物展现出良好的抗艾滋病和抗氧化活性，可为医药工业提供有药用价值的新化合物或先导化合物。

附图说明

图1是本发明化合物高分辨质谱(HRESIMS)；

图2是本发明化合物的核磁共振氢谱(¹H NMR)；

图3是本发明化合物的核磁共振炭谱(¹³C NMR)；

图4是本发明化合物的HSQC相关谱；

图5是本发明化合物的COSY相关谱；

图6是本发明化合物的HMBC相关谱；

图7是本发明化合物的ROESY相关谱。

具体实施方式

通过下面的实施例可以使本专业的技术人员更全面地理解本发明，但并不是对本发明保护范围的限定。

实施例1

以云南丽江老君山的狭叶五味子(Schisandra lancifolia(Rehd.etWils.)A.C.Smith)，为原料。将其藤茎晾干，粉碎到30目，粉碎后以70％的丙酮用超声提取4次，每次5天，期间每隔3.5小时超声提取一次，一次1小时；提取液合并、过滤，减压浓缩提取液至小体积，静置后滤除沉淀物，滤液用乙酸乙酯分3次萃取；合并乙酸乙酯萃取液并浓缩成浸膏，浸膏用氯仿溶解后用粗硅胶(90目)拌样，然后用250目的硅胶干法装柱进行硅胶柱层析粗分，用氯仿∶甲醇(20∶1→7∶3)进行梯度洗脱，收集各个部分洗脱液。洗脱液的7∶3部分用高效液相色谱法分离纯化，流速为3mL/min，以甲醇/水为流动相，逐步调整二者比例逐级细分，即得到所需狭叶木脂素化合物。

实施例2

重复实施例1的过程，但有以下不同：将原料粉碎到20目；用65％的丙酮用超声提取5次，每次5天，期间每隔4小时超声提取一次，一次1.5小时，滤液用乙酸乙酯分4次萃取；用200目的硅胶干法装柱进行硅胶柱层析粗分，洗脱液的7∶3部分用高效液相色谱法分离纯化，流速为2.5mL/min。

实施例3

重复实施例1的过程，但有以下不同：将原料粉碎到40目；用75％的丙酮用超声提取3次，每次5天，期间每隔3小时超声提取一次，一次0.5小时，滤液用乙酸乙酯分2次萃取；用300目的硅胶干法装柱进行硅胶柱层析粗分，洗脱液的7∶3部分用高效液相色谱法分离纯化，流速为3.5mL/min。

表-1化合物的¹H和¹³C NMR数据

实施例4

——对本发明化合物结构的鉴定

该化合物为白色无定形粉末，旋光，[α]2_D ^25.3+6.98(c 0.15，溶剂为甲醇)；紫外光谱(溶剂为甲醇)，λ_max(log ε)280(4.57)，205(5.62)nm；红外光谱(溴化钾压片)ν_max2951，2926，2815，1762，1638，1574，1558，1504，1446，，1411，1292，1208，1172，1144，1018，982，872cm^-1；HRESIMS(附图-1)显示其准分子离子峰m/z 469.1836[M+Na]⁺(calcd 469.1838)，结合NMR谱确定其分子式为C₂₄H₃₀O₈，不饱和度为10。¹H和¹³C NMR谱(附图-2和附图-3，数据归属见表-1)显示分子中有1个苯环，1个甲氧基(δ_C60.49)，1个乙酰基(δ_C169.88)，1个甲基(δ_H0.87，3H，d)，1个亚甲基(δ_C39.57)，1个次甲基(δ_C39.34)1两个羟基，结合质谱数据可推断该化合物为全对称结构。经HSQC相关谱(附图-4)可在每个碳信号上找到对应得氢信号。经COSY(附图-5)和HMBC(附图-6)相关谱可证实该化合物的平面结构，经ROESY相关谱(附图-7)可确定该化合物的立体构型，与SCIFINDER查询和文献检索证实该化合物为新化合物。

实施例5

——对本发明化合物的抗HIV活性检测

1.HIV-1感染性滴定

按Johnson & Byington所述方法改良进行滴定；按Reed & Muench方法计算病毒的TCID₅₀(50％ Tissue Culture Infection Dose)。

2.样品对C8166宿主细胞的细胞毒性检测

4×10⁵/ml C8166细胞悬液100ul与待测化合物溶液混合，设三个重复孔。同时设置不含化合物的对照孔，温度37℃，5％CO₂培养三天，采用MTT比色法检测细胞毒性。ELx800 ELISA仪测定OD值，测定波长为595nm，参考波长为630nm。计算得到CC₅₀值(50％ Cytotoxic Concentration)，即对50％的正常T淋巴细胞系C8166产生毒性时的化合物浓度。

3.样品对HIV-1_IIIB诱导C8166细胞病变(CPE)的抑制试验

将8×10⁵/mL C8166细胞50μL/孔接种到含有100μL/孔倍比稀释化合物的96孔细胞培养板上，然后加入50μL的HIV-1_IIIB稀释上清(M.O.I.0.0016)。设三个重复孔。同时设置不含化合物的正常细胞对照孔。37℃，5％CO₂培养三天，倒置显微镜下(100×)计数合胞体的形成。EC₅₀(50％Effective Concentration)为抑制合胞体形成50％时的化合物浓度。

4.样品对HIV感染细胞的保护作用试验

将8×10⁵/ml MT₄细胞50ul/孔接种到含有100μl/孔倍比稀释化合物的96孔细胞培养板上，培养板的一半孔加入50μl的HIV-1_IIIB稀释(M.O.I.0.006)，另一半孔加入50μl培养基。每个浓度梯度2个重复孔，同时设置不含化合物的对照孔和空白对照孔，37℃，5％CO₂培养，第三天每孔补加100μl新鲜培养基，第五天或第六天采用MTT比色法检测细胞存活率。ELx800ELISA仪测定OD值，测定波长为595nm，参考波长为630nm。用公式计算出化合物对正常细胞的毒性和对HIV-1_IIIB感染细胞的保护作用。

5.计算公式

根据实验结果绘制剂量反应曲线，按Reed & Muench法计算出化合物抑制病毒的50％有效浓度(EC₅₀)，50％抑制细胞生长浓度(CC₅₀)及抗HIV-1活性的治疗指数TI值(Therapeutic index)为：TI＝CC₅₀/EC₅₀。

细胞生长存活率(％)＝实验孔OD值/对照孔OD值×100

细胞生长抑制率(％)＝(1-实验孔OD值/对照孔OD值)×100

HIV-1致细胞病变的抑制率(％)＝(1-实验孔合胞体数/对照孔合胞体数)×100感染细胞的保护率(％)＝

(实验孔OD值-阳性对照孔OD值)/(阴性对照孔OD值-阳性对照孔OD值)×100

6.实验结果

实验结果清楚地表明，该化合物显示出一定的抗HIV-1活性，其治疗指数为22.5，揭示了本发明的化合物在制备抗爱滋病的药物中有良好的应用前景。

实施例6

——化合物抗氧化活性检测

抗氧化活性以清除DPPH自由基能力的大小表示；以50μg/mL为初筛浓度，测定其清除脂性自由基DPPH的活性。取一块costar 96孔板，加入新鲜配制的DPPH乙醇溶液(6.5×105mol/L)19μL/孔，加入待测样品10μL/孔，空白孔加10μL生理盐水，充分混匀，用封板膜封板后室温下避光静置30分钟，于UV2401分光光度计上测定仪上测定各孔吸光度值，测定波长为517nm；样品对脂性自由基DPPH清除率按下式计算：

DPPH清除率(％)＝(A空白-A样品)/A空白×100％

A空白：空白对照组吸光度值；A样品：加样品组吸光度值。

样品平行5次检测，计算半数清除浓度IC50，IC50测定结果为8.22μg/L，表明本发明的化合物具有良好的抗氧化活性。

Claims

1.具有下述结构式的狭叶木脂素化合物：

2.一种权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于：该方法采用以下步骤：

(1)以狭叶五味子为原料，将其藤茎晾干，粉碎到20～40目；

(3)滤液用乙酸乙酯分2～4次萃取；合并乙酸乙酯萃取液并浓缩成浸膏，浸膏用氯仿溶解后用粗硅胶拌样；

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤3所述的粗硅胶为80～100目。

4.权利要求1所述的狭叶木脂素化合物在制备治疗或预防爱滋病和抗氧化的药物中的应用。