CN103275988A

CN103275988A - 一种高纯度重组人baff的制备方法

Info

Publication number: CN103275988A
Application number: CN2013101988517A
Authority: CN
Inventors: 崔县伟; 季晨博; 付子毅; 郭锡熔
Original assignee: Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital
Current assignee: Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital
Priority date: 2013-05-24
Filing date: 2013-05-24
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2033-05-24
Also published as: CN103275988B

Abstract

发明公开了一种高纯度重组人BAFF的制备方法，该方法通过对人BAFF基因进行密码子优化后转入原核细胞，经诱导表达可获得大量人BAFF蛋白，并经过不同浓度梯度的尿素逐步变性、复性，获得高纯度的终产品。本发明设计巧妙，舍弃了传统的亲和层析纯化的方法，得到高表达、高纯度、具有生物学活性的重组人BAFF，进而可以作为抗原用于BAFF抗体的制备，同时又可作为免疫时的佐剂，以增强人的免疫反应，提高抗体的滴度，适于大规模推广应用。

Description

一种高纯度重组人BAFF的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及一种高纯度重组人BAFF的制备方法，以及对应的优化后人BAFF核苷酸序列，及用于扩增该序列的引物。

背景技术

B淋巴细胞刺激因子（Bcell activating factor belonging to the TNF family,BAFF）是肿瘤坏死因子（TNF）的成员，能与B淋巴细胞特异性结合并诱导其增殖、成熟、分化并分泌IgG、IgA和IgM等免疫球蛋白。人BAFF（hBAFF）属II型跨膜蛋白，全长285个氨基酸。

有研究表明系统性红斑狼疮（SLE）和类风湿性关节炎（RA）等自身免疫性疾病与BAFF的过量表达有关，目前也有相关技术通过研究BAFF拮抗剂药物或抗BAFF血清治疗相关疾病。其中涉及到通过获得大量可溶性BAFF用于研究BAFF与人类自身免疫的机理，以及用作免疫治疗的必要组分。

由于BAFF主要以不可溶的包涵体形式存在，在提取过程中存在困难，利用传统亲和层系纯化的方法获得的BAFF量非常小。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种利用尿素逐步变性除杂法获得高纯度重组人BAFF的方法，本发明的另一个目的是提供一种功能区经原核细胞适应性密码子优化的人BAFF核苷酸序列，本发明还有一个目的是提供用于扩增上述功能区核苷酸序列的引物。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明的一种经原核细胞适应性密码子优化的人BAFF基因，其用于表达134-285氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.01所示。

所述SEQ ID NO.01对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.02所示。

一种高纯度重组人BAFF的制备方法，该方法将优化后的人BAFF功能区的核苷酸序列载入原核表达载体，转入原核细胞进行培养后诱导表达，离心破碎后，对沉淀包涵体采用尿素逐步变性法除杂，获得高纯度的重组人BAFF蛋白；

其中，所述优化后的人BAFF核苷酸序列的功能区如SEQ ID NO.01所示。

人BAFF134-285氨基酸为短可溶功能区（sBAFF），通过相关引物和酶将该片段载入原核表达载体中。具体地说，用于载入SEQ ID NO.01的原核表达载体为pET28a质粒，用于表达载体的原核细胞为DH5a受感态细胞。所用引物BAFF-F和BAFF-R如SEQID NO.03和SEQ ID NO.04所示，即：

BAFF-F:CGCCATATGGCTGTTCAGGGTCCGGAAGAAAC，

BAFF-R:CCCAAGCTTTTACAGCAGTTTCAGAGCACCG，

其中，划线部分分别为NdeI和HindIII的酶切位点。切断后利用连接酶连接，即构建了pET28a-sBAFF载体，然后接种到DH5a受感态细胞中。

将上述含有pET28a-sBAFF的DH5a接种到LB液体培养基中预培养，然后接种到自动诱导培养基中，加入卡那霉素后振摇培养。

其中，所述自动诱导培养基包括：

Buffer III(50X每1000ml+Buffer-III:20ml)

K₂HPO₄ 15g

KH₂PO₄ 10g

(NH₄)₂HPO₄ 25g

H₂O到100ml；

Buffer II(20X Inducer每1000ml+Buffer-II:50ml)

Lactose 136g

Glycerol 100g(84ml)

MgSO₄ 1g

H₂O到1000ml；

Buffer I(1000X每1000ml+Buffer-I：1-10ml)

Glucose 100g

MgSO₄ 5%

H₂O到1000ml。

由于原核细胞诱导表达载体是非分泌表达载体，其表达的BAFF蛋白主要以不可溶的包涵体形式存在。诱导表达后，裂解离心除去上清液后分离得到包含BAFF蛋白的包涵体。现有技术一般都是采用传统的亲和层析纯化方法进行纯化，本发明舍弃传统方法，采用尿素逐步变性除杂的方法，得到高表达、高纯度、具有生物学活性的重组人BAFF蛋白。

所述尿素逐步变性法依次分别用尿素浓度分别为4M、6M、8M的变性缓冲液重悬离心洗脱1～2次，取上清液再依次用尿素浓度为4M、2M、1M、0.5M的复性缓冲液透析处理。

所述变性缓冲液包括尿素溶液、100mM NaH₂PO₄、100mM Tris溶液。

所述复性缓冲液包括尿素溶液、100mM NaH₂PO₄、100mM Tris、0.6mM Arg、1mMGSH、0.2mM GSSG。

优选地，利用所述变性缓冲液洗脱时，4M、6M的尿素变性缓冲液各重复1次，所述变性缓冲液重悬离心后，加入蛋白质去垢剂连续吹打并高速离心。优选利用1%Trition-100连续吹打15min，12000rpm离心30min。利用8M尿素变性缓冲液重悬后，4℃溶解过夜，12000rpm离心30min，弃沉淀，用于进行复性处理。

复性时将上清液装入透析袋，分别依次用上述不同尿素浓度的复性缓冲液进行透析，所述复性缓冲液透析12小时后，再12000rpm离心30分钟。

利用复性缓冲液透析完，再利用PBS透析12小时，即获得本发明高纯度的重组人BAFF蛋白。

有益效果：本发明获得的重组人BAFF蛋白基于优化后的BAFF功能区密码子，通过转入原核细胞中表达，离心破碎后采用尿素逐步变性除杂。现有的纯化蛋白质的方法一般为层析法或电泳法，但由于本发明经优化和原核诱导培养后获得的人BAFF蛋白较多，采用层析法如亲和层析或电泳法的成本过高。而本发明采用尿素逐步性除杂的方法，可实现将大量人BAFF蛋白进行纯化，且纯化效果显著。本发明获得的和重组人BAFF蛋白生物活性表达正常，可显著提高淋巴细胞的存活。

附图说明

图1是本发明具体实施方式中对密码子优化前和优化后的BAFF诱导表达破碎沉淀后SDS-PAGE，其中，条带1表示密码子优化前BAFF破碎获得的沉淀，条带2表示密码子优化前BAFF破碎获得的上清液，条带3表示密码子优化后BAFF破碎获得的沉淀，条带4表示密码子优化后BAFF破碎获得的上清液；

图2表示本发明具体实施方式中对尿素逐步变形法逐步洗脱纯化蛋白的SDS-PAGE，其中，条带1表示最终复性得到的BAFF蛋白，条带2为利用8M尿素溶解过夜离心后得到的BAFF蛋白变性液，条带3为利用6M尿素洗脱2次后得到的BAFF蛋白变性液，条带4为4M尿素洗脱后得到的BAFF蛋白变性液，条带7为诱导表达后经破碎获得的沉淀，其中的BAFF蛋白以包涵体的形式存在；

图3为本发明试验例的结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步说明。

本发明的一种经原核细胞适应性密码子优化的人BAFF基因，其用于表达134-285氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.01所示，其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.02所示。

一种高纯度重组人BAFF的制备方法，该方法将优化后的人BAFF功能区的核苷酸序列（如SEQ ID NO.01所示）转入原核细胞进行培养后表达实现高纯度人BAFF蛋白的制备。

利用PCR扩增含有NdeI和Hind III酶切位点的BAFF功能区基因片段。所用引物BAFF-F和BAFF-R分别如SEQ ID NO.03和SEQ ID NO.04所示，即：

BAFF-F:CGCCATATG GCTGTTCAGGGTCCGGAAGAAAC，

BAFF-R:CCCAAGCTT TTACAGCAGTTTCAGAGCACCG，

其中，下划线部分分别为Nde I和Hind III的酶切位点。

PCR体系如下：

PCR反应条件：

抽取pET28a质粒，切断后利用T4连接酶连接，即构建了pET28a-sBAFF载体，然后接种到DH5a受感态细胞中。

利用自动诱导培养基诱导表达，取30μl上述含有pET28a-sBAFF的DH5a接种到3ml含有50μg/ml卡纳霉素的LB液体培养基中预培养，然后接种试管于37℃振摇培养过夜，取一部分作为试验组。其中，将含未作密码子优化的功能区BAFF序列的pET28a-BAFF载体同样接种到DH5a受感态细胞中，进行诱导表达，作为对照组。

将上述过夜菌以1:100的比例接种到600ml的自动诱导培养基中，再加入600μl的卡那霉素，37℃/200rpm振摇培养16小时。

本发明的自动诱导培养基包括：

Buffer III(50X每1000ml+Buffer-III:20ml)

K₂HPO₄ 15g

KH₂PO₄ 10g

(NH₄)₂HPO₄ 25g

H₂O到100ml；

Buffer II(20XInducer每1000ml+Buffer-II:50ml)

Lactose 136g

Glycerol 100g(84ml)

MgSO₄ 1g

H₂O到1000ml；

BufferI(1000X每1000ml+Buffer-I：1-10ml)

Glucose100g

MgSO₄5%

H₂O到1000ml。

诱导表达后，8000rpm离心10min收集菌液，于-70℃保存过夜，第二天用20mlPBS重悬，在超声破碎仪上破碎，4s工作，8s停歇，200W功率下冰上破碎200次。

将试验组和对照组破碎后的上清液和沉淀分别做SDS-PAGE，对比电泳结果，如图1所示。从图1可以看出，本发明通过密码子优化，人BAFF的表达量明显多于未经密码子优化的对照组。

裂解离心除去上清液后分离得到包含BAFF蛋白的包涵体。现有技术一般都是采用传统的亲和层析纯化方法进行纯化，本发明舍弃传统方法，采用尿素逐步变性除杂的方法，得到高表达、高纯度、具有生物学活性的重组人BAFF蛋白，具体如下：

（1）用变性缓冲液1（4M尿素、100mMNaH₂PO₄、100mMTris）重悬离心后得到的含BAFF蛋白的包涵体，加入1%Trition-100连续吹打15min，12000rpm离心30min。再重复一次；

（2）用变性缓冲液2（6M尿素、100mM NaH₂PO4、100mM Tris）重悬离心后得到的含BAFF蛋白的包涵体，加入1%Trition-100连续吹打15min，12000rpm离心30min。再重复一次；

（3）用变性缓冲液3（8M尿素、100mM NaH₂PO4、100mM Tris）重悬，4℃溶解过夜，12000rpm离心30min，弃沉淀，上清进行复性处理；

复性过程也是利用不同尿素浓度进行透析，具体如下：

（1）将上述上清液装入透析袋，用复性缓冲液1复性（4M尿素、100mM NaH₂PO₄、100mM Tris、0.6mM Arg、1mM GSH、0.2mM GSSG），透析12h，12000rpm离心30min，弃沉淀；

（2）将上步骤上清液装入透析袋，用复性缓冲液2复性（2M尿素、100mM NaH₂PO₄、100mM Tris、0.6mM Arg、1mM GSH、0.2mM GSSG），透析12h，12000rpm离心30min，弃沉淀；

（3）将上步骤上清液装入透析袋，用复性缓冲液3复性（1M尿素、100mM NaH₂PO₄、100mM Tris、0.6mM Arg、1mM GSH、0.2mM GSSG），透析12h，12000rpm离心30min，弃沉淀；

（4）将上步骤上清液装入透析袋，用复性缓冲液4复性（0.5M尿素、100mMNaH₂PO₄、100mM Tris、0.6mM Arg、1mM GSH、0.2mM GSSG），透析12h，12000rpm离心30min，弃沉淀。

上述经过4次透析复性即获得的上清液，包含大量的人BAFF蛋白，进一步利用PBS透析冲洗12h。

其中，在尿素变性过程中，利用尿素变性缓冲溶液溶解过夜、离心后，将其含有人BAFF包涵体的蛋白溶液利用SDS-PAGE进行观察，对比诱导表达后破碎获得的沉淀，以及最终复性后得到的BAFF蛋白，结果如图2所示。可以看出，破碎后在100KDa，30KDa，25KDa，20KDa，15KDa都有相应的条带，随着4M，6M，8M的尿素变性缓冲液的处理，杂质带逐渐减少，待复性后，获得了非常清晰的唯一条带。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

试验例1

利用人淋巴细胞分离液（Invitrogen,USA）从血液中分离人淋巴细胞，加入不同浓度的上述实施例获得的重组人BAFF蛋白，48小时后MTT实验检测淋巴细胞存活情况。其结果如图3所示，该实验可以看出，本发明获得的重组人BAFF蛋白具有高生物活性，可显著提高淋巴细胞的存活。

试验例2

本发明利用尿素逐步变性法进行洗脱，与传统Ni亲和纯化法相比，本发明的方法可获得大量的重组人BAFF蛋白。实验评估发现：采用常规的Ni亲和纯化方法，每1L菌液可以得到60mg。重组人BAFF蛋白；而本发明方法可以获得约110mg的重组人BAFF蛋白。

Claims

1.一种经原核细胞适应性密码子优化的人BAFF基因，其用于表达134-285氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.01所示。

2.一种高纯度重组人BAFF的制备方法，该方法将优化后的人BAFF功能区的核苷酸序列载入原核表达载体，转入原核细胞进行培养后诱导表达，离心破碎后，对沉淀包涵体采用尿素逐步变性法除杂，获得高纯度的重组人BAFF蛋白；

3.根据权利要求2所述的一种高纯度重组人BAFF的制备方法，其特征在于：用于载入SEQ ID NO.01的原核表达载体为pET28a质粒，用于表达载体的原核细胞为DH5a受感态细胞。

4.根据权利要求3所述的一种高纯度重组人BAFF的制备方法，其特征在于：将含有pET28a-sBAFF的DH5a接种到LB液体培养基中预培养，然后接种到自动诱导培养基中，加入卡那霉素后振摇培养。

5.根据权利要求2所述的一种高纯度重组人BAFF的制备方法，其特征在于：所述尿素逐步变性法依次分别用尿素浓度分别为4M、6M、8M的变性缓冲液重悬离心洗脱1～2次，取上清液再依次用尿素浓度为4M、2M、1M、0.5M的复性缓冲液透析处理。

6.根据权利要求5所述的一种高纯度重组人BAFF的制备方法，其特征在于：所述变性缓冲液重悬离心后，加入蛋白质去垢剂连续吹打并高速离心。

7.根据权利要求5所述的一种高纯度重组人BAFF的制备方法，其特征在于：所述复性缓冲液还包括100mM NaH₂PO₄、100mM Tris、0.6mM Arg、1mM GSH、0.2mM GSSG。

8.根据权利要求5所述的一种高纯度重组人BAFF的制备方法，其特征在于：所述复性缓冲液透析12小时后，再12000rpm离心30分钟。

9.用于扩增SEQ ID NO.01的引物，如SEQ ID NO.03和SEQ ID NO.04所示。