CN103275914A - 展示保护性抗原的细菌菌蜕及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种展示保护性抗原的细菌菌蜕及其应用。本发明保护展示保护性抗原或展示含有所述保护性抗原的融合蛋白的细菌菌蜕。所述保护性抗原可为引起手足口病的病毒的保护性抗原。所述引起手足口病的病毒可为肠道病毒或柯萨奇病毒组，具体可为肠道病毒EV71或柯萨奇B组3型病毒。本发明设计一种新型疫苗，菌蜕结构为载体，将重要手足口病病毒的保护性抗原（VP1）进行展示或递送，使细菌和病毒的多组分抗原共提呈给宿主，形成联合疫苗，为机体提供更为有效和全面的免疫保护，以防控传染病带来的健康危害。

Description

展示保护性抗原的细菌菌蜕及其应用

技术领域

本发明涉及一种展示保护性抗原的细菌菌蜕及其应用。

背景技术

细菌菌蜕(bacterial ghost,BG)是一种最新发展起来的生物传递系统。细菌菌蜕是革兰阴性细菌被噬菌体phiX174的裂解基因E裂解后形成的完整细菌空壳，其形成是通过对裂解基因E的严格表达调控实现的。BG的形成主要依赖于裂解蛋白E在细胞膜上

的跨膜孔道作用，胞内的细胞质和核酸成分在渗透压的作用下经跨膜孔道被排出，形成一个只含有细胞膜结构的空细菌体。BG兼顾了组合抗原免疫原性、佐剂效应、靶向性载体的作用，既能携带外源抗原,又能同时递送核酸和其他药物，特别适合于粘膜免疫、口服免疫及滴鼻免疫，并适宜大规模生产。同时，由于菌蜕缺乏遗传物质，消除了耐药基因或毒力岛基因的水平转移等引起的潜在危害。因此，细菌菌蜕正在应用于新型疫苗的研究与开发。

手足口病（Hand-food-and-mouth disease）是由肠道类病毒（主要为肠道病毒71型和柯萨奇病毒组）引起的全球性传染病，在世界各地均有不同规模的爆发流行，我国自1981年在上海始见本病，以后北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、安徽、湖北、广东等十几个省市均有报道。手足口病多发生于5岁以下儿童，报告的病例以婴幼儿为主，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜炎等并发症，个别重症患儿甚至死亡，已成为世界性的公共卫生问题，引起了广泛重视。为加强手足口病防治工作，我国卫生部将手足口病列入传染病防治法规定的丙类传染病进行管理。目前，在全世界范围内还缺乏有效地抗病毒药物，研制有效的疫苗是控制手足口病感染流行的最有效策略。

肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC)是一种重要的病原菌，主要包括O157:H7、O26:H11和O111等数种血清型。E.coli O157:H7感染能引起人的出血性结肠炎(Hemorrhagic colitis，HC)、阑尾炎、食管狭窄和结肠穿孔等严重的胃肠道并发症。10%E.coli O157:H7感染病例，特别是儿童和老年人，还可引起致死性的溶血性尿毒综合征(Haemolytic uraemic syndrome，HUS)等全身性并发症。近年来，E.coli O157:H7的暴发流行在世界各地时有发生，尤其在日本、美国、英国等地。我国江苏、安徽等地1999、2001年也相继发生了E.coli O157:H7感染的暴发流行，患者超过两万人。目前临床对于EHEC感染仍缺乏有效的防治办法，只能给予对症治疗和适当的抗菌治疗。

发明内容

本发明的目的是提供一种展示保护性抗原的细菌菌蜕及其应用。

本发明保护展示保护性抗原或展示含有所述保护性抗原的融合蛋白的细菌菌蜕。

所述保护性抗原可为引起手足口病的病毒的保护性抗原。所述引起手足口病的病毒可为肠道病毒或柯萨奇病毒组，具体可为肠道病毒EV71或柯萨奇B组3型病毒。

所述保护性抗原可为如下（a）或（b）或（c）

（a）由序列表中序列4自N末端第139至435位氨基酸残基组成的蛋白质；

（b）由序列表中序列7自N末端第139至422位氨基酸残基组成的蛋白质；

（c）将（a）或（b）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与（a）或（b）具有相同功能的由其衍生的蛋白质。

所述“含有所述保护性抗原的融合蛋白”可为如下（e）或（f）或（g）

（e）由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（f）由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（g）将（e）或（f）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与（e）或（f）具有相同功能的由其衍生的蛋白质。

所述细菌可为革兰氏阴性菌，如大肠杆菌。所述大肠杆菌可为肠出血性大肠杆菌O157:H7，具体可为肠出血性大肠杆菌（EHEC）88321。

所述细菌菌蜕具体可为本发明内容中任一后续方法制备得到的细菌菌蜕。

本发明还保护一种融合蛋白，自N端至C端依次包括如下片段：序列表的序列4自N末端第1至136位氨基酸残基组成的片段甲、保护性抗原、序列表的序列4自N末端第438至560位氨基酸残基组成的片段乙和序列表的序列4第561至652位氨基酸残基组成的片段丙；

所述保护性抗原为如下（a）或（b）或（c）

（a）由序列表中序列4自N末端第139至435位氨基酸残基组成的蛋白质；

（b）由序列表中序列7自N末端第139至422位氨基酸残基组成的蛋白质；

（c）将（a）或（b）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与（a）或（b）具有相同功能的由其衍生的蛋白质。

所述融合蛋白具体可为如下（e）或（f）或（g）

（e）由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（f）由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（g）将（e）或（f）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与（e）或（f）具有相同功能的由其衍生的蛋白质。

编码所述融合蛋白的基因也属于本发明的保护范围，其特征在于：所述片段甲的编码基因如序列表的序列3自5’末端第1至408位核苷酸所示；所述片段乙的编码序列如序列表的序列3自5’末端第1312至1680位核苷酸所示；所述片段丙的编码序列如序列表的序列3自5’末端第1681至1956位核苷酸所示。

所述保护性抗原的编码基因可为如下1）或2）或3）或4）的DNA分子：

1）序列表中序列2所示的DNA分子；

2）序列表中序列5所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码相同蛋白质的DNA分子；

4）与1）或2）限定的DNA序列具有90%以上的同源性且编码相同蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。

编码所述融合蛋白的基因可为如下5）或6）或7）或8）的DNA分子：

5）序列表中序列3所示的DNA分子；

6）序列表中序列6所示的DNA分子；

7）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码相同蛋白质的DNA分子；

8）与1）或2）限定的DNA序列具有90%以上的同源性且编码相同蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。

含有“编码所述融合蛋白的基因”的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体具体可为在pGEX载体（如pGEX-KG载体）的多克隆位点插入以上任一所述“编码所述融合蛋白的基因”得到的重组质粒。所述重组表达载体优选为将序列表的序列3所示DNA或序列表的序列6所示DNA插入pGEX-KG载体的多克隆位点得到的重组质粒。

所述重组菌具体可为如下（Ⅰ）或（Ⅱ）：

（Ⅰ）含有所述重组表达载体的细菌；

（Ⅱ）含有所述重组表达载体并表达裂解酶的细菌；所述裂解酶的氨基酸序列如序列表的序列8所示。

所述重组菌具体可为将所述重组表达载体和温控裂解质粒P-LysisE导入细菌得到的重组菌。

所述细菌可为革兰氏阴性菌，如大肠杆菌。所述大肠杆菌可为肠出血性大肠杆菌O157:H7，具体可为肠出血性大肠杆菌（EHEC）88321。

以上任一所述的重组菌的菌蜕也属于本发明的保护范围。

所述菌蜕具体可通过如下方法制备得到：将所述重组菌28℃培养至OD₆₀₀为0.3，然后加入IPTG（在菌液中的初始浓度为1mM）200rpm培养至OD₆₀₀约为0.6；升温至42℃，收集42℃培养2小时的菌液，5000×g离心20min收集沉淀，即为菌蜕。

本发明还保护一种疫苗，其活性成分为以上任一所述的细菌菌蜕、重组菌或融合蛋白。所述疫苗的用途为如下（A）和/或（B）：（A）预防和/或治疗手足口病；（B）预防和/或治疗细菌感染。所述手足口病具体可为肠道病毒或柯萨奇病毒组引起的手足口病，具体可为肠道病毒EV71或柯萨奇B组3型病毒引起的手足口病。所述细菌可为革兰氏阴性菌，如大肠杆菌。所述大肠杆菌可为肠出血性大肠杆菌O157:H7，具体可为肠出血性大肠杆菌（EHEC）88321。

本发明还保护以上任一所述的细菌菌蜕、重组菌或融合蛋白在制备疫苗中的应用。所述疫苗的用途为如下（A）和/或（B）：（A）预防和/或治疗手足口病；（B）预防和/或治疗细菌感染。所述手足口病具体可为肠道病毒或柯萨奇病毒组引起的手足口病，具体可为肠道病毒EV71或柯萨奇B组3型病毒引起的手足口病。所述细菌可为革兰氏阴性菌，如大肠杆菌。所述大肠杆菌可为肠出血性大肠杆菌O157:H7，具体可为肠出血性大肠杆菌（EHEC）88321。

本发明设计了一种新型疫苗，菌蜕结构为载体，将重要手足口病病毒的保护性抗原（VP1）进行展示或递送，使细菌和病毒的多组分抗原共提呈给宿主，形成联合疫苗，为机体提供更为有效和全面的免疫保护，以防控传染病带来的健康危害。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。MLD即最小致死剂量(minimum lethal dose)。LD50即半数致死量（median lethal dose）。TCID50即半数组织培养感染剂量。

肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157:H7EDL933（简称大肠杆菌O157:H7EDL933）、肠出血性大肠杆菌（EHEC）88321（国际标准株，Stx1和Stx2双产毒型；简称大肠杆菌O157:H788321，均购自ATCC。痢疾志贺菌51054：中国药品生物制品检定所。BALB/c小鼠：购自军事医学科学院实验动物中心。大肠杆菌（E.coli）DH5α购自全式金公司。

肠道病毒EV71：参考文献：Zheng ZM,He PJ,Caueffield D,et al.Enterovirus71isolated from China is serologically similar to the prototype E71BrCr strainbut differs in the5‘-noncoding region.J Med Virol,1995,47(2):161-167.。

柯萨奇B组3型病毒（CB3病毒）：参考文献：Pei-Yu Chu,Guan-Ming Ke,Yao-ShenChen,et al,Molecular epidemiology of Coxsackievirus B3.Infection,Geneticsand Evolution,2010,10:777–784.。

温控裂解质粒P-LysisE：公众可以从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得；该专利为现有质粒，提及该质粒的文献如下：Cai K,Gao X,Li T,etal.Intragastric immunization of mice with enterohemorrhagic Escherichia coliO157:H7bacterial ghosts reduces mortality and shedding and induces a Th2-typedominated mixed immune response.Can J Microbiol.2010,56(5):389-98.。

pGEX-KG载体：公众可以从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得；该专利为现有质粒，提及该质粒的文献如下：Li Jun,

Dou Lin andDou Zhong-ying，Construction of Prokaryotic Expression Vector of Mouse NanogGene and Its Expression，Agricultural Sciences in China.2007,6(4):487-492）。

表1嵌合菌蜕构建所用引物（下划线序列为限制性酶切位点）

引物	5’→3’
		SOup	CCCGGGATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTACA
SOdown	ACCCAGAACAACTACGGAACCGTCTTTCGG
		EOup	CCGAAAGACGGTTCCGTAGTTGTTCTGGGT
EOdown	CCATGGTTAAGCTTGCGGCTGAGTTACAAC
		Enzup	CACAACAATGTGACAGGTGAAGAATTCATCGATACTTGATCTAAGATATCATCATTA
Enzdown	TCGTGGTTTTTCTCAGAGAGCTCACTAGTTAATGATGATATCTTAGATCAAGT

实施例1、嵌合菌蜕的制备

一、夹心OmpA载体特异DNA片段的制备

1、以痢疾志贺菌51054为模板，用SOup和SOdown组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物（约740bp）。

2、以大肠杆菌O157:H7EDL933为模板，用EOup和EOdown组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物（约290bp）。

3、同时以步骤1和步骤2的PCR扩增产物作为模板，用SOdown、EOup、SOup和EOdown组成的引物组合进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

4、以步骤3的PCR扩增产物为模板，用Enzup、Enzdown、SOup和EOdown组成的引物组合进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物（约1100bp）即为夹心OmpA载体特异DNA片段。

5、将夹心OmpA载体特异DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳并回收，与pMD18-T载体（Takara公司）连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取菌落并依次进行PCR鉴定和测序鉴定。

测序结果表明，夹心OmpA载体特异DNA片段的5’末端为Xma I识别位点，3’端为Nco I识别位点，两个识别位点之间的核苷酸如序列表的序列1所示。序列表的序列1中，自5’末端第1至408位、第457至825位核苷酸为痢疾志贺菌OmpA N端的编码基因、第409至456位核苷酸为限制性酶切位点区域(含EcoRI、ClaI、SacI等酶切识别序列和终止子)、第826至1104位核苷酸为大肠杆菌OmpA C端的编码基因（含终止子）。

二、重组质粒的构建

1、重组质粒pOEVP1的构建

（1）人工合成肠道病毒EV71的保护性抗原的编码基因（EVP1基因，约891bp），即序列表的序列2所示的双链DNA分子。

（2）以步骤（1）合成的双链DNA分子为模板，用EVP1-F和EVP1-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

EVP1-F：5’-GAATTCGGAGATAGGGTGGC-3’；

EVP1-R：5’-GAGCTCAAGAGTGGTGATCG-3’。

（3）用限制性内切酶EcoR I和Sac I双酶切步骤（2）的PCR扩增产物，回收酶切产物。

（4）用限制性内切酶EcoR I和Sac I双酶切步骤一得到的夹心OmpA载体特异DNA片段，回收酶切产物。

（5）将步骤（3）回收的酶切产物和步骤（4）回收的酶切产物采用T4DNA连接酶进行连接，得到连接产物。

所述连接产物的5’末端为Xma I识别位点，3’端为Nco I识别位点，两个识别位点之间的核苷酸序列如序列表的序列3所示。序列表的序列3中，自5’末端第1至408位核苷酸、第1312至1680位核苷酸为痢疾志贺菌OmpA N端的编码基因，第415至1305位核苷酸为EVP1基因，第1681至1956位核苷酸为大肠杆菌OmpA C端的编码基因（含终止子），第409至414位核苷酸为EcoR I酶切识别序列，第1306至1311位核苷酸为Sac I酶切识别序列。

序列表的序列3所示DNA编码序列表的序列4所示的融合蛋白。序列表的序列4中，自N末端第1至136位氨基酸残基和第438至560位氨基酸残基为痢疾志贺菌OmpA N端，第139至435位氨基酸残基为EVP1蛋白（由297个氨基酸残基组成），第561至652位氨基酸残基为大肠杆菌OmpA C端，第137至138位氨基酸残基和第436至437位氨基酸残基为引入的酶切识别序列编码的氨基酸残基。

（6）用限制性内切酶Xma I和Nco I双酶切步骤（5）的连接产物，回收酶切产物。

（7）用限制性内切酶Xma I和Nco I双酶切pGEX-KG载体，回收载体骨架（约5000bp）。

（8）将步骤（6）的酶切产物和步骤（7）的载体骨架连接，得到重组质粒pOEVP1。

2、重组质粒pOCVP1的构建

（1）人工合成CB3病毒的保护性抗原的编码基因（CVP1基因，约852bp），即序列表的序列5所示的双链DNA分子。

（2）以步骤（1）合成的双链DNA分子为模板，用CVP1-F和CVP1-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

CVP1-F：5’-GAATTCGGCCCAGTGGAAGAC-3’；

CVP1-R：5’-GAGCTCAAATGCGCCCGTAT-3’。

（3）同步骤1的（3）。

（4）同步骤1的（4）。

（5）将步骤（3）回收的酶切产物和步骤（4）回收的酶切产物采用T4DNA连接酶进行连接，得到连接产物。

所述连接产物的5’末端为Xma I识别位点，3’端为Nco I识别位点，两个识别位点之间的核苷酸序列如序列表的序列6所示。序列表的序列6中，自5’末端第1至408位核苷酸、第1273至1641位核苷酸为痢疾志贺菌OmpA N端的编码基因，第415至1266位核苷酸为CVP1基因，第1642至1917位核苷酸为大肠杆菌OmpA C端的编码基因（含终止子），第409至414位核苷酸为EcoR I酶切识别序列，第1267至1272位核苷酸为Sac I酶切识别序列。

序列表的序列6所示DNA编码序列表的序列7所示的融合蛋白。序列表的序列7中，自N末端第1至136位氨基酸残基和第425至547位氨基酸残基为痢疾志贺菌OmpA N端，第139至422位氨基酸残基为CVP1蛋白（由284个氨基酸残基组成），第548至639位氨基酸残基为大肠杆菌OmpA C端，第137至138位氨基酸残基和第423至424位氨基酸残基为引入的酶切识别序列编码的氨基酸残基。

（6）同步骤1的（6）。

（7）同步骤1的（7）。

（8）将步骤（6）的酶切产物和步骤（7）的载体骨架连接，得到重组质粒pOCVP1。

三、重组菌的构建

1、重组菌甲的构建

将重组质粒pOEVP1和温控裂解质粒P-LysisE共转化大肠杆菌O157:H788321感受态细胞，得到重组菌甲。

分别用温控裂解质粒特异引物对（phiXE-F和phiXE-R，靶序列约294bp）和重组质粒pOEVP1特异引物对（EVP1-F和EVP1-R，靶序列约891bp）对反复冻融10次的重组菌甲进行PCR鉴定。

phiXE-F：5’-CCGGAATTCATGGTACGCTGGACTTTGTGGGAT-3’；

phiXE-R：5’-TGCGACGTCTCACTCCTTCCGCACGTA-3’。

结果表明，重组质粒pOEVP1和温控裂解质粒P-LysisE能较长时间共存于大肠杆菌O157:H788321。

2、重组菌乙的构建

将重组质粒pOCVP1和温控裂解质粒P-LysisE共转化大肠杆菌O157:H788321感受态细胞，得到重组菌乙。

分别用温控裂解质粒特异引物对（phiXE-F和phiXE-R，靶序列约294bp）和重组质粒pOCVP1特异引物对（CVP1-F和CVP1-R，靶序列约850bp）对反复冻融10次的重组菌乙进行PCR鉴定。

结果表明，重组质粒pOCVP1和温控裂解质粒P-LysisE能较长时间共存于大肠杆菌O157:H788321。

四、嵌合菌蜕的制备与鉴定

1、嵌合菌蜕EBGs的制备

将步骤二制备的重组菌甲接种至新鲜LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素与100μg/ml卡那霉素)中，28℃培养至OD₆₀₀约为0.3，然后加入IPTG（在菌液中的初始浓度为1mM），200rpm培养至OD₆₀₀约为0.6；迅速升温至42℃，收集42℃培养2小时的菌液。升温前的菌液样本作为诱导前样本，42℃培养2小时的菌液样品作为诱导后样本。

将等体积的诱导前样本和诱导后样本分别4℃、5000×g离心20min收集沉淀。

用PBS缓冲液洗涤沉淀，然后进行梯度稀释后分别涂布于LB固体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素与100μg/ml卡那霉素)上，28℃培养48h。记数固体培养基上的菌落数(CFU)，根据公式[1-诱导后样本的CFU/诱导前样本的CFU]计算裂解效率。

菌落LB平板计数结果显示，重组菌甲的诱导后样本收集的沉淀的裂解效率>99.99%,即收集的沉淀中基本不含有菌体，均为菌蜕，将该沉淀命名为嵌合菌蜕EBGs。

2、嵌合菌蜕CBGs的制备

将步骤二制备的重组菌乙接种至新鲜LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素与100μg/ml卡那霉素)中，28℃培养至OD₆₀₀约为0.3，然后加入IPTG（在菌液中的初始浓度为1mM），200rpm培养至OD₆₀₀约为0.6；迅速升温至42℃，收集42℃培养2小时的菌液。升温前的菌液样本作为诱导前样本，42℃培养2小时的菌液样品作为诱导后样本。

将等体积的诱导前样本和诱导后样本分别4℃、5000×g离心20min收集沉淀。

用PBS缓冲液洗涤沉淀，然后进行梯度稀释后分别涂布于LB固体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素与100μg/ml卡那霉素)上，28℃培养48h。记数固体培养基上的菌落数(CFU)，根据公式[1-诱导后样本的CFU/诱导前样本的CFU]计算裂解效率。

菌落LB平板计数结果显示，重组菌乙的诱导后样本收集的沉淀的裂解效率>99.99%,即收集的沉淀中基本不含有菌体，均为菌蜕，将该沉淀命名为嵌合菌蜕CBGs。

实施例2、嵌合菌蜕对大肠杆菌O157:H788321的免疫保护作用

一、分组处理

3周龄雄性BALB/c小鼠随机分为3组，每组40只，分别进行如下操作（实验首日为第0天，以后依次为第1天、第2天，……）：

第一组（EBGs组）：经灌胃途径于第0d天进行首次免疫，第14d进行加强免疫；每只小鼠每次的免疫剂量为0.1mg实施例1制备的嵌合菌蜕EBGs(1mg相当于10⁹菌蜕)；用0.1毫升PBS缓冲液悬浮0.1mg菌蜕后进行免疫；

第二组（CBGs组）：经灌胃途径于第0d天进行首次免疫，第14d进行加强免疫；每只小鼠每次的免疫剂量为0.1mg实施例1制备的嵌合菌蜕CBGs(1mg相当于10⁹菌蜕)；用0.1毫升PBS缓冲液悬浮0.1mg菌蜕后进行免疫；

第三组（PBS组）：经灌胃途径于第0d天进行首次免疫，第14d进行加强免疫；每只小鼠每次的免疫0.1毫升PBS缓冲液。

第28天，每组小鼠等分为两个亚组，每组20只，分别用2×10⁹CFU大肠杆菌O157:H788321(相当于20MLD)或5×10⁹CFU大肠杆菌O157:H788321(相当于50MLD)灌胃途径攻毒一次；小鼠攻毒前3d喂食含5g/L硫酸链霉素的水，攻毒前24h停食。攻毒21天后，统计各组的存活率（进行三次重复实验，结果取平均值）。

采用2×10⁹CFU大肠杆菌O157:H788321攻毒后，EBGs组小鼠的存活率为70%（14/20），CBGs组小鼠的存活率75%(15/20)，PBS组小鼠的存活率为5%。采用5×10⁹CFU大肠杆菌O157:H788321攻毒后，三组小鼠均全部死亡。

实施例3、嵌合菌蜕对肠道病毒EV71和CB3病毒的免疫保护作用

一、分组处理

3周龄雄性BALB/c小鼠随机分为3组，每组20只，雌雄各半，分别进行如下操作（实验首日为第0天，以后依次为第1天、第2天，……）：

第一组（EBGs组）：经灌胃途径于第0d天进行首次免疫，第14d进行加强免疫，第28天雌雄小鼠交配，之后获得子代小鼠；每只小鼠每次的免疫剂量为0.1mg实施例1制备的嵌合菌蜕EBGs(1mg相当于10⁹菌蜕)；用0.1毫升PBS缓冲液悬浮0.1mg菌蜕后进行免疫；

第二组（CBGs组）：经灌胃途径于第0d天进行首次免疫，第14d进行加强免疫，第28天雌雄小鼠交配，之后获得子代小鼠；每只小鼠每次的免疫剂量为0.1mg实施例1制备的嵌合菌蜕CBGs(1mg相当于10⁹菌蜕)；用0.1毫升PBS缓冲液悬浮0.1mg菌蜕后进行免疫；

第三组（PBS组）：经灌胃途径于第0d天进行首次免疫，第14d进行加强免疫，第28天雌雄小鼠交配，之后获得子代小鼠；每只小鼠每次的免疫0.1毫升PBS缓冲液。

每组子代小鼠，分为4个亚组，每个亚组8只，分别用4×10⁶TCID50肠道病毒EV71(相当于2LD50)每只小鼠、10⁷TCID50肠道病毒EV71(相当于5LD50)每只小鼠、10⁸TCID50CB3病毒(相当于2LD50)每只小鼠或2.5×10⁸TCID50CB3病毒(相当于5LD50)每只小鼠的剂量腹腔注射途径攻毒一次。攻毒21天后，统计各组的存活率（进行三次重复实验，结果取平均值）。

EBGs组对2LD50或5LD50的肠道病毒EV71的攻击保护率分别为100%(8/8)或50%(4/8)，CBGs组对2LD50或5LD50的CB3病毒的攻击保护率分别为100%(8/8)或37.5%(3/8)。另外，EBGs组对2LD50的CB3病毒攻击提供了一定程度的免疫交叉保护作用，保护率为12.5%(1/8)。PBS组子代鼠对两种不同病毒的两种攻毒剂量均无保护作用，所有小鼠均死亡。

实施例4、嵌合菌蜕免疫小鼠的抗体效价

一、分组处理

3周龄雄性BALB/c小鼠随机分为3组，每组20只，分别进行如下操作（实验首日为第0天，以后依次为第1天、第2天，……）：

第一组（EBGs组）：经灌胃途径于第0d天进行首次免疫，第14d进行加强免疫；每只小鼠每次的免疫剂量为0.1mg实施例1制备的嵌合菌蜕EBGs(1mg相当于10⁹菌蜕)；用0.1毫升PBS缓冲液悬浮0.1mg菌蜕后进行免疫；

第二组（CBGs组）：经灌胃途径于第0d天进行首次免疫，第14d进行加强免疫；每只小鼠每次的免疫剂量为0.1mg实施例1制备的嵌合菌蜕CBGs(1mg相当于10⁹菌蜕)；用0.1毫升PBS缓冲液悬浮0.1mg菌蜕后进行免疫；

第三组（PBS组）：经灌胃途径于第0d天进行首次免疫，第14d进行加强免疫；每只小鼠每次的免疫0.1毫升PBS缓冲液。

二、诱导产生抗菌蜕特异抗体

分别于第0天和第28天，每个组取3只小鼠；眼眶摘离采血，离心分离获得血清；以PBS缓冲液冲洗肠道，离心分离肠灌洗液上清。

分别采用ELISA方法检测血清和肠灌洗液上清的抗体效价。用每孔0.2μg EVP1蛋白或CVP1蛋白包被96孔板，100μl HRP标记的羊抗小鼠IgA或HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体(1:5000)作为检测抗体，OD₄₅₀读数。

采用EVP1蛋白进行包被时：

PBS组第0天和第28天的血清IgA或IgG效价均为1:10，肠灌洗液IgA或IgG效价均为1:10；CBGs组第0天和第28天的血清IgA或IgG效价均为1:10，肠灌洗液IgA或IgG效价均为1:10；表明PBS组、CBGs组各个小鼠中均没有检测到抗EVP1的IgA特异抗体和抗EVP1的IgG特异抗体；

EBGs组第0天和第28天的血清IgG效价分别为1:10和1:133，血清IgA效价分别为1:10和1:66，肠灌洗液IgG效价分别为1:10和1:10，肠灌洗液IgA效价分别为1:10和1:66；表明EBGs组诱导产生血清抗EVP1的IgA特异抗体（P<0.01）和血清抗EVP1的IgG特异抗体（P<0.01），同时在肠灌洗液上清中产生抗EVP1的IgA特异抗体（P<0.01）。

采用CVP1蛋白进行包被时：

PBS组第0天和第28天的血清IgA或IgG效价均为1:10，肠灌洗液IgA或IgG效价均为1:10；EBGs组0天和第28天的血清IgA或IgG效价均为1:10，肠灌洗液IgA或IgG效价均为1:10；表明PBS组、EBGs组小鼠中均没有检测到抗CVP1的IgA特异抗体和抗CVP1的IgG特异抗体；

CBGs组第0天和第28天的血清IgG效价分别为1:10和1:213，血清IgA效价分别为1:10和1:66，肠灌洗液IgG效价分别为1:10和1:10，肠灌洗液IgA效价分别为1:10和1:133；表明CBGs组诱导产生血清抗CVP1的IgA特异抗体（P<0.01）和血清抗CVP1的IgG特异抗体（P<0.01），同时在肠灌洗液上清中产生抗CVP1的IgA特异抗体（P<0.01）。

三、诱导产生更强抗黏附因子intimin特异抗体

分别采用ELISA方法检测血清和肠灌洗液上清的抗体效价。用每孔0.2μg重组蛋白Int281包被96孔板，100μl HRP标记羊抗小鼠IgA或HRP标记羊抗小鼠IgG抗体(1:5000)作为检测抗体，OD₄₅₀读数。

PBS组第0天和第28天的血清中和肠灌洗液中的IgG或IgA效价均为1:10，表明PBS组小鼠中均没有检测到抗intimin的特异抗体。EBGs组第0天和第28天的血清IgG效价分别为1:10和1:853，血清IgA效价分别为1:10和1:106，肠灌洗液IgG效价分别为1:10和1:133，肠灌洗液IgA效价分别为1:10和1:133。CBGs组第0天和第28天的血清IgG效价分别为1:10和1:1066，血清IgA效价分别为1:10和1:133，肠灌洗液IgG效价分别为1:10和1:186，肠灌洗液IgA效价分别为1:10和1:213。结果表明嵌合菌蜕EBGs和嵌合菌蜕CBGs均能诱导小鼠血清和肠灌洗液上清中产生抗intimin的IgA和IgG特异抗体(P<0.01)。

Claims (10)

1.展示保护性抗原或展示含有所述保护性抗原的融合蛋白的细菌菌蜕。 

2.如权利要求1所述的细菌菌蜕，其特征在于：所述保护性抗原为引起手足口病的病毒的保护性抗原，所述引起手足口病的病毒具体可为肠道病毒或柯萨奇病毒组。 

3.如权利要求1所述的细菌菌蜕，其特征在于：所述细菌菌蜕为权利要求8所述菌蜕。 

4.一种融合蛋白，自N端至C端依次包括如下片段：序列表的序列4自N末端第1至136位氨基酸残基组成的片段甲、保护性抗原、序列表的序列4自N末端第438至560位氨基酸残基组成的片段乙和序列表的序列4第561至652位氨基酸残基组成的片段丙； 

所述保护性抗原为如下（a）或（b）或（c） 

（a）由序列表中序列4自N末端第139至435位氨基酸残基组成的蛋白质； 

（b）由序列表中序列7自N末端第139至422位氨基酸残基组成的蛋白质； 

（c）将（a）或（b）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与（a）或（b）具有相同功能的由其衍生的蛋白质。 

5.编码权利要求4所述融合蛋白的基因，其特征在于：所述片段甲的编码基因如序列表的序列3自5’末端第1至408位核苷酸所示；所述片段乙的编码序列如序列表的序列3自5’末端第1312至1680位核苷酸所示；所述片段丙的编码序列如序列表的序列3自5’末端第1681至1956位核苷酸所示。 

6.含有权利要求5所述基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。 

7.如权利要求6所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为如下（Ⅰ）或（Ⅱ）： 

（Ⅰ）含有所述重组表达载体的细菌； 

（Ⅱ）含有所述重组表达载体并表达裂解酶的细菌；所述裂解酶的氨基酸序列如序列表的序列8所示。 

8.权利要求6或7所述的重组菌的菌蜕。 

9.一种疫苗，其活性成分为权利要求1至3中任一所述的细菌菌蜕或其活性成分为权利要求6或7所述的重组菌或其活性成分为权利要求4所述的融合蛋白。 

10.权利要求1至3中任一所述的细菌菌蜕，或权利要求6或7所述的重组菌，或权利要求4所述的融合蛋白，在制备疫苗中的应用。