CN103270159B - 免疫刺激性寡脱氧核苷酸 - Google Patents

免疫刺激性寡脱氧核苷酸 Download PDF

Info

Publication number
CN103270159B
CN103270159B CN201180063723.0A CN201180063723A CN103270159B CN 103270159 B CN103270159 B CN 103270159B CN 201180063723 A CN201180063723 A CN 201180063723A CN 103270159 B CN103270159 B CN 103270159B
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
odn
oligodeoxynucleotide
virus
synthesized
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201180063723.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103270159A (zh
Inventor
C.C.施里尔
T.S.伊尔格
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Intervet International BV
Original Assignee
Intervet International BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Intervet International BV filed Critical Intervet International BV
Publication of CN103270159A publication Critical patent/CN103270159A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103270159B publication Critical patent/CN103270159B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A61K39/17—Newcastle disease virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/345—Spatial arrangement of the modifications having at least two different backbone modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18311—Metapneumovirus, e.g. avian pneumovirus
    • C12N2760/18334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及免疫刺激性寡脱氧核苷酸、包含这些寡脱氧核苷酸的载体和疫苗、它们作为药物的用途、它们在预防或抗击感染性疾病中的用途、检测这些寡脱氧核苷酸的方法和在这些方法中要使用的细胞。

Description

免疫刺激性寡脱氧核苷酸
本发明涉及免疫刺激性寡脱氧核苷酸、包含这些寡脱氧核苷酸的载体和疫苗、它们作为药物的用途、它们在预防或抗击感染性疾病中的用途、检测这些寡脱氧核苷酸的方法和在这些方法中要使用的细胞。
在过去的二十年间，在免疫科学中已经出现了脊椎动物免疫系统具有通过受体介导的对病原体独有特性的识别来检测微生物感染和引发快速免疫活化的机制，所谓的与同源的宿主病原体识别受体（PRRs）相互作用的病原体相关的分子模式（PAMPs）(Iwasaki A,Medzhitov R. 2001. Science 327, 291-295. Medzhitov R., 2009. Immunity 30,766-775)。
现在清楚的是病原体脱氧核糖核酸（DNA）的某些形式在这些PAMPs中。在1995年，有报道细菌DNA中非甲基化的CpG基序引发鼠B细胞活化（Krieg 等 1995）。此研究第一次在细菌的免疫刺激性含非甲基化CpG的DNA的特异性识别和先前承认的CpG抑制以及哺乳动物DNA中普遍的CpG甲基化之间产生了联系。最有效的B细胞刺激性非甲基化的CpG寡脱氧核苷酸（CpG ODN）显示拥有序列元件GACGTT。
本领域中下一个里程碑式的论文由在大阪/日本的Shizuo Akira实验室发表（Hemmi 等 2000）。通过小鼠中基因克隆和定向基因敲除方法，可以明确显示，小鼠中对CpG-ODN的细胞应答是通过toll样受体9（TLR9)介导。后来，显示CpG-ODN是主要通过NFκ-B途径的TLR9信号传导的激动剂（Medzhitov 2001）。在后来的十年间，关于基础研究主题和通常的潜在免疫治疗应用已经发表了非常多的研究(例如，Krieg 2002, 2003, 2006；Klinman 2004, Vollmer 2005, Wilson 等 2006, Kindrachuk 等 2008, Dorn 和Kippenberger 2008, Vollmer 和 Krieg 2009, Wilson 等 2009中综述的)。一些综述论文关注CpG-ODN的抗感染应用(Krieg 2007)、TLR9激动剂在癌症治疗中的用途(Krieg2007, Weiner 2009)、用于哮喘和过敏治疗的TLR9活化(Kline 2007, Kline 和 Krieg2008, Fonseca 和 Kline 2009)和作为疫苗佐剂( Klinman 等 2004, Klinman 2006,Daubenberger 2007, Wagner 2009, Mutwiri 等 2009, Klinman 等 2009)。
CpG ODN还已在兽医应用中，具体在牛、猪、羊、狗、鸡和鱼中作为免疫刺激性试剂和疫苗佐剂被描述和讨论(Babiuk 等 2003, Carrington 和 Secombes 2006, Griebel等 2005, Mutwiri 等 2003, Singh 和 O’Hagan 2003, Werling 和 Jungi 2003)。
在鸡中的兽医用途领域，已经描述了CpG寡脱氧核苷酸在例如疫苗中保护鸡抵抗新城疫的用途（Linghua 2007）。
最近显示，在鸡中TLR21作为哺乳动物TLR9的功能性同源物在CpG寡脱氧核苷酸识别中发挥作用（Brownlie 等, 2009）。
具体的CpG ODN作为免疫调节剂的设计至今仍然一直是随机的。对于非哺乳动物CpG ODN尤其是这样。对此原因是多方面的，首先，不知道关于对人TLR's和非人中的（更不用说非哺乳动物物种）TLR's的免疫调节CpG基序之间的关联。第二，没有可利用的具有足够低噪声水平背景的细胞系统来选择性检测非常低浓度的CpG ODN的作用。此外，没有可利用的高通量筛选方法并且即使有，在非哺乳动物物种中CpG ODN作为免疫调节剂的体内相对体外的效能之间也没有明确的关联。
因此，明显存在对于具有高免疫调节作用并且从而在低剂量下有效的新的CpGODN的需要。并且存在显示CpG活性的体外和体内活性之间关联的用于兽医目的的选择性的和敏感的CpG ODN选择系统的需要。
本发明的目标之一是提供此类新的CpG ODN。
在这方面，本发明的一个实施方案涉及免疫刺激性非甲基化的寡脱氧核苷酸，具有通式 5'[N1]x [N7]r {N3 [N4]p C G [N5]q N6 }n [N8]s [N2]z 3'，其中
每个 N1 独立地为C或G；每个N2 独立地为C 或 G； N3 是 T、C 或 G，条件是排除其中N3和N4均为C的组合；每个N4 和 N5 独立地为 C或 T； N6 = A、T、G 或 C； N7 = A、T、C或 G； N8 = A、T、C 或 G； x = 3-10； z= 0-10； n = 2-100；如果N4=T则p = 1-6、或 1-25；如果 N5=T则q = 1-6、或 1-25；如果 N7=T则r =0-8、或 1-25和如果 N8=T则s = 0-8、或 1-25，或所述寡脱氧核苷酸的药学上可接受的盐。
“免疫刺激性非甲基化的寡脱氧核苷酸”指这样的寡脱氧核苷酸，其包含非甲基化的胞苷-磷酸-鸟苷二核苷酸序列，所述序列刺激信号传导级联的启动，导致转录因子例如NF-κB或干扰素调节因子3（IRF3）的活化。此活化又导致炎症细胞因子的表达和其它细胞活化事件。NF-κB结合部位和NF-κB影响的基因表达尤其（i.a.）被Schindler 和 Baichwal(1994)描述。
术语寡脱氧核苷酸表示脱氧核苷酸的短的核酸聚合物；即包含连接磷酸基团和可交换的有机碱的许多脱氧核糖的分子。这种有机碱是取代的嘧啶或取代的嘌呤。实例分别为胞嘧啶和胸腺嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤。
本发明的寡核苷酸可以包含修饰。这些修饰的实例是例如位于核苷3'和/或5'末端的磷酸二酯核苷间键桥中的修饰。这些修饰尤其涉及磷酸二酯被例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯的替代。
其它修饰是例如磷酸二酯键桥被脱磷酸键桥的替代。脱磷酸键桥的实例是甲基羟胺，formacetal和二亚甲基砜（dimethylenesulfone）基团。
还其它的修饰是涉及天然核苷碱基被非天然核苷碱基例如5-氟胞嘧啶、7-脱氮-7-取代-鸟嘌呤、7-脱氮-8-取代-鸟嘌呤、2-硫脲嘧啶、二氢脲嘧啶、5-溴-胞嘧啶、6-取代胞嘧啶、N4-取代胞嘧啶取代的修饰。
再其它的修饰是涉及糖单元，核糖或核糖单元被修饰的糖单元例如如L-2’-脱氧核糖或2’-L-阿拉伯糖取代的修饰。
对寡核苷酸进一步探讨的教科书是例如“PCR Primer: A Laboratory Manual”,Second Edition, 2003, Edited By Carl W. Dieffenbach,National Institute ofAllergy and Infectious Diseases；Gabriela S. Dreksler, Uniformed ServicesUniversity of the Health Sciences, Cold Spring Harbor Laboratory Press ISBN978-087969654-2。
携带CpG基序的结构 {N3 [N4]p C G [N5]q N6 }n 表示本发明的ODN的活性免疫刺激部分。因此，本发明提供包含所谓“骨架”的免疫刺激性寡脱氧核苷酸。
发现本发明的寡脱氧核苷酸的骨架即结构{N3 [N4]p C G [N5]q N6 }n必须存在至少2次，优选3次。因此，n应当至少是2。还发现当n增加时，寡脱氧核苷酸的活性增加。当n增加时，此效应拉平（levelling）。基本上，骨架结构的数字n从而应当至少是2。优选地，n的范围是3 ≤ n ≤ 100，仅因为合成序列越长，其越难制造的事实。在实践中，优选地，n的范围是2≤ n ≤ 18。更优选地，n的范围是3≤ n ≤ 18，甚至更优选地，n的范围是4≤ n ≤ 18，再甚至更优选地，n的范围是5≤ n ≤ 18。
尤其通过使用比目前用于NF-κB活化检测的系统更高选择性的检测系统使本发明的CpG ODN的鉴定成为可能。Brownlie等(2009)描述了基于NF-κB荧光素酶的报告系统。其它系统是，例如基于IL-8转录测量或细胞因子分泌或NO分泌检测。
与此相反，本发明中使用了基于分泌的碱性磷酸酶的检测系统（SEAP）。SEAP是哺乳动物系统中的报告酶（Yang等，1997）。此系统被证明是出人意料地灵敏并且此外出人意料地在所检测的CpG ODN的体外和体内活性之间提供密切的关联。SEAP系统使用对硝基苯磷酸盐（pNPP）作为底物。
另一个对现有系统的改进是携带SEAP基因的质粒在细胞中的引入和稳定的保持。迄今为止，所有的检测系统用报告基因对细胞使用瞬时转染。由于报告基因在细胞中的引入和稳定保持，所以现在第一次可以做出剂量/应答曲线。如果要在多种CpG ODN活性之间做出可靠的比较，该曲线是必不可少的。
因此，本发明的实施例部分中详细描述的方法和细胞系首次允许在多种CpG ODN之间做出可靠的并行比较。
在实施例部分给出了所用系统的进一步的细节。
由于本方法和细胞系现在允许在多种CpG ODN之间做出这种可靠的并行比较，可以确定本发明的寡脱氧核苷酸其中N6 = A、T 或 C时比当 N6 = G时具有更高的活性水平。因此，在此实施方案的优选形式中，N6=A、T或C。
基于同样的原因，在另一个优选形式中，N3 是T 或 G ； 并且 N6
= Y (Y = C 或 T)。
在此实施方案更优选的形式中 N3、N4、N5 和 N6 = T。
此实施方案另一个优选的形式涉及本发明的寡脱氧核苷酸，其中 N3、N4 和 N5 =T 并且 N6 = C。
此实施方案又一个优选的形式涉及本发明的寡脱氧核苷酸，其中 N3是G 并且 N6= T。
此实施方案再一个优选的形式涉及本发明的寡脱氧核苷酸，其中 N5=T并且 N6 =C。
并且，此实施方案一个优选的形式涉及本发明的寡脱氧核苷酸，其中 N5=C、N6 = C并且q=1。
此实施方案另一个优选的形式涉及本发明的寡脱氧核苷酸，其中 N4=Y 并且 N5 =Y。
此最后的实施方案一个更优选的形式涉及本发明的寡脱氧核苷酸，其中 N4=T 并且 N5 = Y。
此最后的实施方案一个进一步更优选的形式涉及本发明的寡脱氧核苷酸，其中N4=T 并且 N5 = T。
此实施方案另一个形式涉及本发明的寡脱氧核苷酸，其中 x 是4-7 并且 r=0 或N7 是 A 或 T。
在此实施方案的一个优选形式中，涉及本发明的寡脱氧核苷酸，其中 x 是6 并且r=0 或 N7 是 A 或 T。
此实施方案另一个形式涉及本发明的寡脱氧核苷酸，其中 z 是0-6 并且 s=0 或N8 是 A 或 T。
在此实施方案的一个优选形式中，涉及本发明的寡脱氧核苷酸，其中 z 是0-3 并且 s=0 或 N8 是 A 或 T。
在此实施方案再一个形式中，N1是G。
在此实施方案的一个优选的形式中，N2是G。
虽然3’-和5’-末端核苷酸数目存在广泛的范围，发现对这两个值存在最佳范围。发现如果 s=0 或 N8 是 A 或 T，形成本发明的寡脱氧核苷酸骨架的3’-侧翼区的[N2]核苷酸的数目优选范围在0－5个核苷酸，更优选地在0－3个核苷酸。
还发现如果 r=0 或 N7 是 A 或 T，形成本发明的寡脱氧核苷酸骨架的5’-侧翼区的[N1]核苷酸的数目在4－7个核苷酸的区域中具有最佳值。
在此实施方案最优选的形式中，r = 0 或 N7 是 A 或 T, 并且 s = 0 或 N8 是A 或 T，并且 n = 5-18 和 x = 4-7 和 z = 0-3。
如上文所述，位于核苷的3'和/或5'末端的磷酸二酯核苷间键桥中的几种修饰是可行的。但是基本上，取决于合成方法，两个核苷酸之间通常普通类型的键是：磷酸二酯（PDE）键和硫代磷酸酯（PTO）键。为了改善CpG ODN的稳定性和免疫刺激性作用，为合成的寡脱氧核苷酸的构件提供硫代磷酸酯，使得它们形成PTO键。
但是，出人意料地发现，当仅[N1]核苷酸和[N2]核苷酸通过PTO键结合并且其它核苷酸通过PDE键结合时，本发明的寡脱氧核苷酸的效能急剧增加。(在这些情况下，N1与N7键(GT)是PTO，而 N8与N2 (TG)键是 PDE。)
当[N1] 和[N2]核苷酸是 G时，尤其是这样的。
因此，此实施方案的另一个优选的形式涉及本发明的寡脱氧核苷酸，其中 N1's和/或N2's 具有硫代磷酸酯结合，并且其它核苷酸具有磷酸二酯结合。
发现对于本发明的寡脱氧核苷酸，当N7 = T 且 N8 = T时可以获得远远更有效的寡脱氧核苷酸。
因此，此实施方案再一个优选的形式涉及本发明的寡脱氧核苷酸，其中 N7=T 并且 N8 = T。在此情况下，r和s独立地在1-25之间。
没有必要本发明的寡脱氧核苷酸的骨架即结构 {N3 [N4]p C G [N5]q N6 }n对于每个n都相同。这意味着本发明的寡脱氧核苷酸可以看起来尤其像这样：{T T C G T T}{C TC G T G}{G T C G T A}。这样一系列的三个不同的连续的不同骨架将被指示为杂聚物。一段三个相同的拷贝将称为均聚物。
优选地，本发明的寡脱氧核苷酸包含{N3 [N4]p C G [N5]q N6 } 均聚物。
本发明的CpG寡脱氧核苷酸在大多数情况下在纳摩尔量下是有活性的，在体外检测系统中和在体内均如此。但是，一些本发明的CpG寡脱氧核苷酸甚至在皮摩尔（亚纳摩尔）量下也有活性，它们的EC50低于1nM。
寡脱氧核苷酸的半最大效应浓度（EC50）是在报告细胞中（HEK293-pNifty2-鸡TLR21 或 HD11-pNifTy2Hyg）诱导给出一半最大吸收的报告酶SEAP（其产生在405nm处的有色产物吸收）的量所必需的寡脱氧核苷酸的量。如果在这些细胞中寡脱氧核苷酸的EC50低于1nM，认为它在皮摩尔（亚纳摩尔）量下是有活性。
适合下列4个通式之一的大部分CpG ODN显示在纳摩尔量下引发体外效应：
对于所有这四个公式，由于成本效益的原因，n优选在5-18的范围。X 优选在4-9、5-8、6 或 7的范围，这是优先的顺序，并且 z优选是 8、7、6、5、4、3、2、1 或 0 ，这是优先的顺序。在适用的情况下，p优选是1-5并且q是优选1-5。
非常可能通过反应性化学基团将本发明的寡脱氧核苷酸连接到载体或半抗原上。这些键合增强联合分子的免疫刺激性作用。
这些成分的仅仅实例是，例如洋地黄毒苷，氨基己基-，得克萨斯红和生物素。
优选的载体或半抗原是3’- 和 5’-标记的德克萨斯红和5’-标记的洋地黄毒苷。寡脱氧核苷酸与半抗原/载体的键合是本领域熟知的。
本发明的另一个实施方案涉及包含本发明的免疫刺激性非甲基化的寡脱氧核苷酸的载体。该载体可以是核酸分子例如质粒、病毒、噬菌体或任何其它分子生物学中使用的载体。仅作为实例：包含免疫刺激性非甲基化的寡脱氧核苷酸的载体可以例如是DNA分子，如可以在细菌中增殖的质粒，本发明的免疫刺激性非甲基化的寡脱氧核苷酸已被克隆入其中。该质粒优选具有活跃的复制起始点，导致大量的质粒存在于宿主中。该细菌大规模生长随后分离质粒提供本发明的免疫刺激性非甲基化的寡脱氧核苷酸的合成生产的选择。
本发明的目的之一是提供在疫苗中可用作成功的免疫刺激成分的新的CpG ODN，其与抗原组分或编码抗原组分的遗传信息以及药学上可接受的载体一起预防或抗击感染性疾病。
通常，术语抗原组分指包含至少一个表位的物质组合物，其在施用于人或动物时能够诱导、刺激或增强免疫应答。
抗原组分可以是任何种类的抗原组分，但是优选源自在其野生型形式下对人或动物是致病的微生物或病毒。
抗原组分可以是全病原体（优选以灭活或减毒形式）、病原体提取物或病原体的免疫原性蛋白。
如果抗原组分是病原体的免疫原性蛋白，则该免疫原性蛋白优选在体外培养的细胞中表达并从中回收。
因此，另一个实施方案涉及预防或抗击感染性疾病的疫苗，其特征在于所述疫苗包含免疫刺激量的本发明的寡脱氧核苷酸和/或本发明的载体、免疫原性量的抗原组分或编码抗原组分的遗传信息和药学上可接受的载体。
当然，免疫刺激量的寡脱氧核苷酸和免疫原性量的抗原组分是强烈相关的。本发明的优点之一是本发明的寡脱氧核苷酸的存在可以降低预防或抗击感染性疾病所必需的抗原组分的量。
将预防或抗击感染性疾病所必需的抗原组分的量指作抗原组分的免疫原性量。
寡脱氧核苷酸的免疫刺激量是能够降低抗原组分的免疫原性量的量，即预防或抗击感染性疾病所必需的抗原组分的量。
因此基本上，措辞“寡脱氧核苷酸的免疫刺激量”和“免疫原性量”必须被看作彼此相关。
不用说，如果疫苗包含编码抗原组分的遗传信息，则由此遗传信息表达的抗原组分的量应该足以预防或抗击感染性疾病，即，它必须是免疫原性量。
本发明的非甲基化的寡脱氧核苷酸是免疫刺激性的这个事实意味着它们增强疫苗中抗原组分的免疫效能。基于该原因，本发明的疫苗将在很多情况下包含相比于将是如果不存在本发明的寡脱氧核苷酸的情况下更少的抗原组分或编码抗原组分的遗传信息。
在一些情况下，不添加免疫刺激性寡核苷酸的这样的抗原组分，可以具有如此低的免疫原性性质，从而无论如何必须大量施用，虽然达不到所希望的免疫原性水平。在这样的情况下，抗原组分可以以通常的高浓度给予，但是现在与本发明的寡脱氧核苷酸一起，以便如此获得所希望水平的免疫原性。
因此，与本发明的寡脱氧核苷酸一起施用的抗原组分或编码抗原组分的遗传信息的量作为经验将等于或低于在不存在所述寡核苷酸的情况下所给予的量。参与具体疫苗的制造的技术人员将知道用于该具体疫苗的量。并且，实施例给出了例如所使用的抗原组分量的充分的指导，例如在三个不同的灭活病毒疫苗中：新城疫病毒疫苗、传染性支气管炎病毒疫苗和火鸡鼻气管炎疫苗。
需要与抗原组分或编码抗原组分的遗传信息一起施用的本发明的寡脱氧核苷酸的量取决于所选的寡脱氧核苷酸和抗原组分两者。
本发明的寡脱氧核苷酸的非常合适的量将通常在1-100纳摩尔间变化。用1-10µg的平均长度为30个脱氧核苷酸的本发明的寡脱氧核苷酸已经获得了非常好的体内结果，其在体外检测中显示在纳摩尔范围具有活性。
如果寡脱氧核苷酸选自在皮摩尔范围具有活性的寡脱氧核苷酸组，技术人员将认识到低于，可能远低于1纳摩尔的量，即皮摩尔量，将值得在检测纳摩尔量之前检测。
本发明的疫苗包含药学上可接受的载体。该载体的性质尤其取决于施用途径。如果施用途径是通过口腔或鼻内途径，载体可以是简单如无菌水、生理盐水或缓冲液。如果注射是优选的途径，载体应当优选是等渗的，并且具有使其适于注射的pH限制。但是这些载体是本领域广泛知晓的。
本发明的疫苗除了抗原组分或编码抗原组分的遗传信息和本发明的寡脱氧核苷酸之外，还可以包含佐剂。佐剂通常是以非特异性方式增强宿主的免疫应答的物质。
已知本领域中很多佐剂是合适的，例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、维生素E、非离子嵌段聚合物和聚胺如硫酸葡聚糖、卡波普(Carbopol)和吡喃、氢氧化铝。还经常使用的是磷酸铝、皂角苷、植物油例如生育酚和矿物油。非常高效的佐剂是水包油型乳状液和尤其是油包水乳状液，进一步也被称为水包油佐剂和油包水佐剂。这些乳状液是本领域熟知的。因此，优选地，疫苗包含油包水佐剂。
优选地，抗原组分是病毒或微生物，或者源自病毒或微生物，所述病毒或微生物在其野生型形式下对家禽是致病的。
更优选地，所述病毒或微生物选自传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病（甘布罗病）（Infectious Bursal Disease (Gumboro)）、鸡贫血剂（Chicken Anaemiaagent）、禽呼肠孤病毒、鸡败血支原体（Mycoplasma gallisepticum）、火鸡鼻气管炎病毒（Turkey Rhinotracheitis virus）、副鸡嗜血菌（鼻炎）（Haemophilus paragallinarum(Coryza)）、鸡痘病毒（Chicken Poxvirus）、禽脑脊髓炎病毒（Avian Encephalomyelitisvirus）、减蛋综合征病毒（Egg Drop syndrome virus）、传染性喉气管炎病毒（InfectiousLaryngotracheitis virus）、火鸡疱疹病毒（Herpes Virus of Turkeys）、艾美耳球虫种（Eimeria species）、鼻腔鸟杆菌（Ornithobacterium rhinotracheale）、多杀性巴斯德氏菌（Pasteurella multocida）、关节液支原体（Mycoplasma synoviae）、沙门氏菌属物种（Salmonella species）和大肠杆菌。
本发明的再一个实施方案涉及本发明的免疫刺激性非甲基化的寡脱氧核苷酸，其用作药物。
本发明的再一个实施方案涉及本发明的免疫刺激性非甲基化的寡脱氧核苷酸，其用于预防或抗击家禽中的感染性疾病。
迄今为止，所有的检测系统用报告基因对细胞使用瞬时转染。这些瞬时系统不允许对CpG ODN的效能进行可靠的并行比较。如上文所述，对现有系统的一个重大改进是携带报告基因的质粒在细胞中的引入和稳定的保持。稳定意味着质粒在几个细胞分裂周期后在细胞中保持存在。
经常地，质粒的稳定保持是通过使细胞在一种或多种选择性试剂例如抗生素（对其的抗性基因存在于质粒上）的压力下生长来获得。质粒的丢失将随后导致丢失质粒的细胞死亡。剩余的有活力的细胞将仍然携带质粒。
因此，本发明的又一个实施方案涉及包含TLR21受体和编码NF-κB报告基因的质粒的细胞，所述质粒稳定地保持在细胞内。这些细胞非常适合用于筛选CpG分子，更具体地，适合用于筛选本发明的CpG分子。
关于如何获得这种包含可以稳定保持在细胞内的编码报告基因的质粒的细胞，实施例给出了充分的指导。
还如上文所述，基于分泌的碱性磷酸酶（SEAP）的检测系统显示非常适于所用的检测系统。
因此，优选地，报告基因是编码分泌的碱性磷酸酶的基因。
基本上，任何携带TLR21的细胞或细胞系适合于检测TLR21特异性的CpG ODN，所述细胞或细胞系允许携带NF-κB报告基因优选如上文所述的SEAP基因的质粒的引入和优选稳定的保持。
用于检测TLR21特异性的CpG ODN的这样的合适的细胞系的一个优选的实例是鸡细胞系HD11。
因此，优选地，用于检测系统的细胞系是包含编码报告基因的稳定的质粒的HD11细胞系。
鸡细胞系例如HD11细胞系显示整个系列（panel）的鸡TLR's。这可以在某些条件下产生某些背景活性。
因此，非家禽细胞系例如哺乳动物细胞系是更优选的细胞系。这样的哺乳动物细胞系的一个实例是其中已克隆入了TLR21的HEK293细胞。这样的细胞系是对TLR21活化信号有更特异地选择性的。
因此，更优选地，用于检测系统的细胞系是哺乳动物细胞系HEK293，其包含稳定保持的报告基因，并且TLR21已经被克隆进所述HEK293细胞中。
本发明的又一个实施方案涉及检测本发明的免疫刺激性寡脱氧核苷酸的方法，其中所述方法包括步骤a）将寡脱氧核苷酸与本发明的细胞接触，b）检测报告基因产物的水平。
在此方法的一个优选形式中，报告基因产物是SEAP。
此实施方案的更优选的形式涉及检测本发明的免疫刺激性寡脱氧核苷酸的方法，其中所述细胞是已经克隆入鸡TLR21的鸡细胞系HD11或HEK293细胞系的细胞。
实施例
实施例1
鸡TLR21的基因克隆和异源表达
鸡TLR研究中最近的进展暗示TLR21是哺乳动物TLR9在禽类物种中的功能性同源物（Keestra 2008, Brownlie 等 2009）。
TLR21基因克隆的概述
基于Genbank数据库序列NM_001030558，合成引物对用于鸡TLR21基因的聚合酶链式反应(PCR)扩增:
Ga-TLR21-正向引物1
Ga-TLR21-反向引物1
。
引物设计为对起始和终止密码子（黑体）提供侧翼限制性克隆位点（下划线的）和Kozak序列（斜体的）。使用这些引物并以鸡脾脏总RNA作为模板进行RT-PCR。将预期大小（~3000 bp）的PCR产物克隆入pCR2.1-Topo，并且对5个独立的质粒克隆（P1、P2、P12、P13、P14）进行测序。
所使用的鸡TLR21的DNA序列
用pcDNA3.1(+)-Neo-chiTLR21对HEK293-pNifTy2-Zeo (克隆细胞系)的转染
人胚肾（HEK）细胞293已经在20世纪70年代通过病毒转化产生（Graham 等,1977），并且现在对于研究团体可从细胞系保藏库例如ATCC获得。
pNifty2是允许检测NFκB转录因子活化的质粒，NFκB转录因子活化是很多免疫刺激性行为的标志，toll样受体活化在它们中。pNifTy2中其转录/翻译取决于NFκB活化的报告基因是分泌的碱性磷酸酶（SEAP）。细节在销售此质粒的公司：Invivogen的数据手册中描述。通过向生长培养基中添加博莱霉素（zeocin）在细菌和哺乳动物细胞中选择pNifTy2的转化/转染事件。
HEK293细胞通过标准方法（脂质转染法）转染pNifTy2，选择稳定的细胞系，通过用人肿瘤坏死因子α（Sigma公司）的刺激来建立NF-kB/SEAP轴的功能性。被刺激的细胞培养上清液中分泌的SEAP通过微量滴定板比色分析法使用碱性缓冲液(50 mM NaHCO3, pH9.6, 2mM MgCl2)中的生色底物对硝基苯基磷酸酯（pNPP，5mM）来测定。通过微量滴定板读数器监测发色（λ = 405 nm）。此读出还用于选择具有高信噪比的克隆系（通过有限稀释法）。这些选择的克隆之一（称为克隆11）然后用于鸡TLR21的进一步研究。
pcDNA3.1(+)-neo是购自Invitrogen的标准的哺乳动物表达载体。鸡TLR21基因向此载体中的亚克隆经由通过PCR引入的侧翼HindIII（起始密码子）和NotI（终止密码子）位点完成。（参见图1）。
此质粒然后转染（脂质转染法）到克隆HEK293-pNifty2-zeo系,并且通过向生长培养基中添加博莱霉素和G418二者来选择重组细胞。所获得的多克隆重组细胞系的功能性通过用ODN-X4和ODN-HEK1-PTO刺激培养物和检测SEAP来评价。高级的克隆系然后通过有限稀释法、随后刺激和SEAP检测来鉴定。
SEAP是哺乳动物系统中的报告酶（Yang等，1997）。SEAP是人胚胎碱性磷酸酶的分泌形式。它主要的优点是高稳定性和极高的比活性，其保证检测的灵敏度和耐用性（robustness）。几种底物已被描述用于SEAP检测，但是经济和耐用的pNPP被选择，因为其反应产物对硝基苯酚盐以高灵敏度被检测（ε405 = 18500 M-1 cm-1）。在我们的检测设置中，我们进行动力学测定，因为它们提供定量更宽的动力学范围。
HEK293-pNifTy2-Zeo细胞用pcDNA3.1(+)-Neo-chiTLR21 (用Pvu I线性化)转染，并且通过向培养基中补充350 µg/ml 博莱霉素和600 µg/ml G418来选择多克隆细胞系。通过用ODN-X4 (PDE)和用ODN-HEK1 (PTO)刺激细胞来进行功能性检测。分泌的碱性磷酸酶（SEAP）由被选择的细胞而不是由亲本HEK293-pNifTy2-Zeo细胞系产生。进行单细胞克隆并分析单个克隆其对ODN-X4 (PDE) (GGGGGGTTCGTTTTCGTTTTCGTTGGGGG)和 ODN-HEK1 (PTO)(TCGTCGTTTTGTCGTTTGTCGTT)的响应性。
46个zeo/G418双抗性克隆细胞系中仅3个对ODN刺激是明显响应的，而3-4个进一步的细胞系显示较弱的信号。因此，85%的选择的克隆不是功能性的。
对于所有的进一步研究，使用克隆细胞系38，其产生了对ODN-X4 (PDE)和ODN-HEK1 (PTO)刺激响应到目前最高的SEAP读出信号。
图2-5给出了多种zeo/G418双抗性克隆细胞系的SEAP活性的概览。
实施例2
N3-N6 的性质对活性影响的分析
检测了下列PDE CpG-ODN：
并且，作为对照，ODN-2006 (CpG7909)的PDE版本（其PTO副本是人肿瘤治疗中的药物/疫苗候选物）用作阳性对照，而其GpC副本用作阴性对照（ODN2006-对照）。
使用HD11-pNifTyhyg克隆细胞系，在从2000nM开始的滴定实验中所获得的结果显示在图6中。
基于此检测的活性排序：
较低活性：
。
使用HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21克隆细胞系，在从100nM开始的滴定实验中所获得的结果显示在图7中。
基于此检测的活性排序：
较低活性：
。
总之，根据这些检测，PDE CpG ODN-X4，而不是典型的小鼠（ODN-X1）和人（ODN-X2）在鸡细胞系HD11中和异源鸡TLR21检测系统中证明是最有效的试剂。
实施例3
紧邻CpG基序的核苷酸的作用
为了鉴定变体六核苷酸序列基序对鸡HD11细胞和异源表达的鸡TLR21的活性，制造了CpG元件直接相邻的位置被置换的衍生物：
基于[TNCGNT]3基序
在此应当指出，序列的置换在一种情况下导致回到ODN-X4基序（→ODN-Y11）。
使用HD11-pNifTyhyg克隆细胞系，在从2000nM开始的滴定实验中所获得的结果显示在图8中。
基于在HD11-pNiftyhyg中此检测的活性排序：ODN-Y11 (= ODN-X4) >ODN-Y15 >ODN-Y12 > ODN-Y9 > ODN-Y3 >ODN-Y16 > ODN-Y7 ~ ODN-Y6 ~ ODN-Y10 ~ ODN-Y14 >ODN-Y8~ ODN-Y5
较低活性： ODN-Y1、ODN-Y2、ODN-Y4、ODN-Y13
使用HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21克隆细胞系，在从100nM开始的滴定实验中所获得的结果显示在图9中。
基于在HEK293-pNifty2-pcDNA3.1-chiTLR21中此检测的活性排序： ODN-Y11 (=ODN-X4) > > ODN-Y15 > ODN-Y9 > ODN-Y12 > ODN-Y14 ~ ODN-Y6 > ODN-Y7 ~ ODN-Y8 ~ODN-Y10 ~ ODN-Y16 >ODN-Y3~ ODN-Y5
较低活性： ODN-Y1、ODN-Y2、ODN-Y4、ODN-Y13
总之，从两个检测系统中可以得出类似的结论：
ODN-Y11，与ODN-X4相同，被证实作为HD11巨噬细胞和异源表达鸡TLR21的HEK293细胞最强的刺激物。看起来HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21克隆细胞系的辨别力高于HD11-pNiftyhyg的辨别力。
实施例4
ODN-X4中TpCpGpT元件的3’-相邻位置的作用
为了进一步鉴定对鸡HD11细胞和异源表达的鸡TLR21优选的六核苷酸序列基序，ODN-X4中TpCpGpT元件的3’-相邻位置被置换：
基于(TTCGTN)3基序
使用HD11-pNifTyhyg克隆细胞系，在从2000nM开始的滴定实验中所获得的结果显示在图10中。
基于在HD11-pNiftyhyg中此检测的活性排序：ODN-X4 ~ ODN-X43 >ODN-X42 ~ODN-X41
使用HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21克隆细胞系，在从100nM开始的滴定实验中所获得的结果显示在图11中。
基于在HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21中此检测的活性排序： ODN-X43 >>ODN-X4 ~ ODN-X42 > ODN-X41。
实施例5
ODN-X4中TpCpGpT元件的5’-相邻位置的作用
为了更进一步鉴定对鸡HD11细胞的进一步六核苷酸序列基序，ODN-X4中TpCpGpT元件的5’-相邻位置被置换：
基于 (NTCGTT)3基序
使用HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21克隆细胞系，在从100nM开始的滴定实验中所获得的结果显示在图12中。
基于在HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21中此检测的活性排序： ODN-X4 >>ODN-X25 > ODN-X2 > ODN-X24。
实施例6
5’-dG6截短或缺失的作用
为了进一步表征PDE-ODN X4在鸡HD11细胞和异源表达的鸡TLR21中的结构-活性关系（SAR），研究了5’-dG6截短或缺失的作用。
使用HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21克隆细胞系，在从100nM开始的滴定实验中所获得的结果显示在图13中。
基于在HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21中此检测的活性排序：
ODN-X4 > ODN-X4-5’-1 > ODN-X4-5’-2 >ODN-X4-5’-3>> ODN-X4-5’-4 > ODN-X4-5’-6 ≈ ODN-X4-5’-5
ODN X4-5’-4-6在此浓度范围内活性较低。
实施例7
3’-dG5截短或缺失的作用
为了进一步表征PDE-ODN X4在鸡HD11细胞和异源表达的鸡TLR21中的结构-活性关系（SAR），研究了3’-dG5截短或缺失的作用。
使用HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21克隆细胞系，在从100nM开始的滴定实验中所获得的结果显示在图14中。
基于在HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21中此检测的活性排序：
ODN-X4-5’-5 ≈ ODN-X4-5’-4 ≈ ODN-X4-5’-3 ≈ ODN-X4-5’-2 > ODN-X4-5’-1 > ODN-X4
缺失3’dG6 和 3’dG5 二者的ODN X4-minusG 在此浓度范围内活性较低。
并且，研究5’-dG6 和 3’-dG5 中额外的Gs是否具有作用：
使用HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21克隆细胞系，在从100nM开始的滴定实验中所获得的结果显示在图15中。
虽然在ODN-X4两侧加上一个G对于HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21中的刺激活性既没有有益也没有有害作用，但加上两个G似乎导致分子具有更低的效价。
实施例8
磷酸二酯（PDE）键被硫代磷酸酯（PTO）类似物的取代
为了改善CpG-ODN的稳定性和免疫刺激能力，研究了磷酸二酯（PDE）键被硫代磷酸酯（PTO）类似物的取代。为了进一步表征PDE-ODN X4在HD11-pNifTyhyg鸡巨噬细胞和异源表达的鸡TLR21中的结构活性关系（SAR）这一方面，研究了用PTO（ODN-X4-PTO）对所有PDE键和用PTO仅在5’-dG6 和 3’dG5延伸(ODN-X4-PTO-Gonly) 中对PDE键取代的作用。
使用HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21克隆细胞系，在从50nM开始的滴定实验中所获得的结果显示在图16中。
在此读出系统中，发现X4-PTO相比X4-PDE效价更低。X4-PTO-Gonly在HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21中证明比亲本X4-PDE效价更高。
体外效价排序：
。
实施例9
ODN-X4 (PDE)的物种特异性的研究
为了研究ODN-X4 (PDE)的物种特异性，购买HEK293-XL-pUNO-人TLR9细胞，随后用pNifTy2转染，其对文献PTO-CpGs的响应性已经建立，产生克隆功能性细胞系，并且将它们之一用于与HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21的比较研究。
在这些比较研究中，除了ODN-X4 (PDE)之外，还使用了已被广泛确立用于人TLR9的高效价PTO-ODN2006（= CpG7909）和2007和其GpC对照副本。
使用HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21克隆细胞系，在从50nM开始的滴定实验中所获得的结果显示在图17中。
获得了下列活性排序顺序：
在这里考虑的浓度范围内GpC对照PTO-ODN 2006 和2007是无活性的。
使用HEK293XL- pUNO-huTLR9-pNifTy2 克隆细胞系，在从50nM开始的滴定实验中所获得的结果显示在图18中。
获得了下列活性排序顺序：
在所考虑的浓度范围内GpC对照PTO-ODN 2006 和2007和ODN-X4 (PDE) 是无活性的。
此结果证实了ODN-X4 (PDE)的鸡物种特异性。
实施例10
TTCGTT重复的最佳数目的研究
为了研究TTCGTT重复的最佳数目，制造了下列构建体：
使用HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21克隆细胞系，在从20nM开始的滴定实验中所获得的结果显示在图19中。
对HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21鉴定了刺激效价的下列排序：
X4-hex ~ X4-pent > X4-quad > X4-trip (= ‘经典’ X4)
X4-doub和X4-sing在本文应用的检测浓度下是无活性的。
实施例11
分隔T的数目的作用
为了研究分隔CpG基序的T的数目的作用，制造了下列构建体：
使用HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21克隆细胞系，在从25nM开始的滴定实验中所获得的下列结果显示在图20中。
对HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21鉴定了刺激效价的下列排序：
X4-Li6 ~ X4-Li5 ~ X4-Li4 (= ‘经典’ X4) > X4-Li3 > X4-Li2 ~ X4-Li1。
实施例12
dG延伸的边界处T残基的最佳数目的研究
为了研究dG延伸的边界处T残基的最佳数目，制造了下列构建体：
使用HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21克隆细胞系，在从20nM开始的滴定实验中所获得的结果显示在图21中。
对HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21鉴定了刺激效价的下列排序：
X4-Bo4 ~ X4-Bo3 > X4-Bo2 (= ‘经典’ X4) > X4-Bo1
为了进一步研究dG延伸的边界处T残基的最佳数目，制造和（再次）检测了下列（相同和更长的）构建体：
使用HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21克隆细胞系，在从20nM开始的滴定实验中所获得的结果显示在图22中。
对HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21鉴定了刺激效价的下列排序：
X4-Bo6 > X4-Bo5 > X4-Bo4 > X4-Bo3 > X4-Bo2 (= ‘经典’ X4) > X4-Bo1。
实施例13
邻接骨架三聚体的T的数目的作用的进一步研究
为了研究邻接骨架三聚体的T的最佳数目，制造了下列构建体：
看起来关于最大刺激和关于“有效浓度50%”（=EC50）二者，通过从X4-Bo5加入进一步的T导致的增加是微小的或不存在。然而，X4-Bo10仍然是高度有活性的。从而可以有把握地假设增加更多T的作用趋于平稳。可以容易地想象，一直到X4-Bo20、X4-Bo25 或甚至X4-Bo30的构建体仍然非常合适。参见图23。
实施例14
分隔CG元件的T的数目的作用的进一步研究
为了研究分隔CG元件的T的最佳数目，制造了下列构建体：
如上所示，在所考虑的浓度范围内(< 20 nM)X4-Li1和X4-Li2是无活性的。看起来，虽然EC50从X4-Li3到X4-Li7改变不多，但能获得的最大刺激的确以该顺序增加。一个意外是EC50从X4-Li7到X4-Li8的跳跃，其还伴随最大刺激的增加。X4-Li8、X4-Li9 和X4-Li10关于EC50和最大刺激方面大致同等有效。然而，X4-Li10仍然是高度有活性的。从而可以有把握地假设增加更多个T的作用趋于平稳。可以容易地想象，一直到X4-Li20、X4-Li25 或甚至X4-Li30 的构建体仍然非常合适。参见图24。
实施例15
TTCGTT重复的数目的作用的进一步研究
为了研究TTCGTT重复的最佳数目，制造了下列构建体：
如上所示，在所考虑的浓度范围内(< 20 nM)X4-sing 和X4-doub是无活性的。看起来能获得的最大刺激从X4-trip到X4-hept的确急剧增加，并且以该顺序，EC50也急剧降低。特别是从X4-quad到X4-pent的跳跃非常显著。从X4-hept到 X4-dec，最大刺激增加并且EC50温和但连续地降低。从而可以有把握地假设增加更多三聚体的作用趋于平稳。可以容易地想象，一直到X4-X、X4-XV 或甚至X4-XVIII 的构建体仍然非常合适。然而这些构建体将愈加难以合成。参见图25和图26。
实施例16
对重复三聚体的类型的作用的进一步研究
为了研究重复三聚体的最佳类型，制造了下列构建体：
从X4-trip到X4-I到X4-II/X4-III，刺激水平的确急剧增加。并且，从X4到X4-I，EC50急剧降低，并且然后到X4-III逐渐变小。
X4-III仍然是高度有活性的。参见图27。
实施例17
对TTTCGTTT重复的作用的进一步研究
为了研究TTCGTT重复的边界处T残基的最佳数目，制造了下列构建体：
与X4系列中类似，在所考虑的浓度范围内(< 20 nM)X4-I-sing 和 X4-I-doub是无活性的。第一个有效力的ODN是X4-I，并且可获得的最大刺激对X4-quad和X4-I-pent/X4-I-hex进一步增加。对于X4-I-trip – X4-I-hex，EC50在同样的数量级（低nM）。
X4-I-hex仍然是高度有活性的。参见图28。
实施例18
三聚六聚体CG基序的进一步研究——3’边界位置
为了研究最佳的三聚六聚体CG基序——3’边界位置，制造了下列构建体：
EC50 计算： X4: 61.6 nM
X41: 未测定, >> 100 nM
X42: 62.1 nM
X43: 3.3 nM
基于这些（和更早的）结果，在最大刺激和EC50值两方面ODN-X43均优于ODN-X4。ODN-X42在最大信号方面略低，但是EC50与ODN-X4的类似。
实施例19
三聚六聚体CG基序的进一步研究——GTCGTC的鉴定
在探索基于ODN-X2的PDE-ODN的潜力中，合成了下列ODN作为六聚体5’-和3’末端的修饰。X2、X24、X25和X26/X4的结果在上文中报告。
与X21 和 X22类似，X2、X24、X25相比于X26/X4仅有很低活性或无活性。然而，X23显示优于X26/X4的预料不到的高活性。
EC50 计算： X23: 3.1 nM
X4: 61.6 nM
基于这些（和更早的）结果，在最大刺激和EC50值两方面ODN-X23均优于ODN-X4。
实施例20
ODN-X42基序数目的作用
ODN-X42基于TTCGTA基序的三聚体。为了检测基序数目的作用，研究从1到6的基序数目。
如在先前的实验中所示，X4-trip和X42-trip的效价相当。在X42系列中降低六核苷酸重复的数目导致活性丧失（X42-sing, X42-doub），而增加数目到4、5和6导致最大信号和EC50以该顺序增加，在X42-pent达到皮摩尔效价。还显著的事实是，从X42-quad向前的ODN优于ODN-X4-trip-PTO-Gonly。
可以容易地想象，一直到n=10、n=15或甚至n=18的构建体仍然非常合适。然而这些构建体将愈加难以合成。参见图29。
实施例21
ODN-X43基序数目的作用
ODN-X43基于TTCGTC基序的三聚体。为了检测基序数目的作用，研究从1到6的基序数目。
并且，合成并检测了X43-trip – X43-hex的PTOG-only变体。
在先前的实验中可以看到，X43-trip的效价优于X4-trip的效价。在X43系列中降低六核苷酸重复的数目导致活性丧失（X43-sing, X43-doub），而增加数目到4、5和6导致最大信号和EC50以该顺序增加，在X43-quad已达到皮摩尔效价。还显著的事实是，从X43-trip向前的所有X43-ODN均优于ODN-X4-trip-PTO-Gonly。
X43-trip-X43-hex的PTOG-only版本至少与纯磷酸二酯连接的ODN版本一样有活性。
X43-hex 和 X43-hex-PTOG-only 仍然高度有活性，即尚未达到限制和/或最佳。
再一次，可以容易地想象，一直到n=10、n=15 或甚至 n=18的构建体仍然非常合适。然而这些构建体将愈加难以合成。参见图30和图31。
实施例22
ODN-X4进一步的变体
为了进一步探索基于ODN-X4的PDE-ODN的潜力，合成了 CpG元件5’-和3’-的TT二核苷酸分别被GG、AA 和 CC置换的ODN。
在HEK293-pNifty2-chiTLR21刺激检测中, X4-GG、X4-AA、X4-CC、GG-X 和 AA-X证明在所考虑的浓度范围内是无活性的。但是，CC-X ( EC50 = 6.94 nM) 显示EC50 活性比X4(EC50 = 52.3 nM)的活性高7倍，并且还显示更高的最大刺激信号。参见图32。
实施例23
本发明的CpG基序的动物检测：
1 介绍
1.1 目标
为了评价联合最低量灭活的NDV克隆30抗原以及W/O 乳状液的TLR（Toll样受体）配体是否可以提供抵抗活的NDV Herts 33/56攻击的保护。
1.2
2 材料和方法
2.1 实验的简短概述
将放置在隔离装置中的18组3周龄SPF白来航（Leghorn）鸡在右胸肌肌内（i.m.）只接种一次表1 “分组和给药” 中指示的制剂之一。仅将每组12只动物中的10只鸡接种，将另两只作为对照。在接种（T=0）前一天从18只随机挑选的动物（每组1只）中取血样，以及在接种后T=3周从所有组的所有动物中取血样。接种后T=3周取血样后，所有鸡在右腿肌肉通过肌内（i.m.）途径用每只鸡0.2 ml (106.0 EID50)强毒NDV株Herts 33/56攻击。攻击后14天期间，每天对鸡的NDV感染或死亡临床证据的发生率评分。攻击后两周从所有剩余动物中取血样，然后将动物处死。对局部反应进行目视调查和评分。当反应或损伤可见时，取样用于常规组织学。
2.2 检测材料
2.2.1
2.2.1.1 疫苗:W/O 乳状液中0.25% w/w 灭活的 NDV 克隆 30
2.2.1.2 TLR配体：X4-PDE (Y11) – 由Biolegio生产 – 荷兰
X4-PTO (Y11) – 由TibMolBiol生产 – 柏林 - 德国
X4-PTO-G-only (Y11) – 由TibMolBiol生产
2007-PTO (已知来自文献) – 由TibMolBiol生产
2.2.1.3 CpG 序列:
X4-PDE (Y11):GGGGGGTTCGTTTTCGTTTTCGTTGGGGG (完整PDE骨架)
X4-PTO (Y11): gsgsgsgsgsgsTsTsCsgsTsTsTsTsCsgsTsTsTsTsCsgsTsTsgsgsgsgsgs(完整PDE骨架)
X4-PTO-G-only (Y11): gsgsgsgsgsgsTTCGTTTTCGTTTTCGTTgsgsgsgsgs (PTO g-延伸)
2007-PTO:TsCsgsTsCsgsTsTsgsTsCsgsTsTsTsTsgsTsCsgsTsTs (完整PTO骨架)
PTO = 硫代磷酸酯(用“s”标明) (= 核酸酶抗性)； PDE = 磷酸二酯 (标准寡核苷酸合成)。
表1 分组和给药
2.2.2 疫苗制备
对于每个TLR配体，新鲜制备特定稀释液，将其加入[W/O乳状液中的0.25% w/wNDV]-疫苗至最高达2.5% v/v的终浓度，得到1 µg或10 µg/每0.5ml的剂量。（本文使用的实验疫苗的全疫苗剂量包含8.06%w/v NDV感染的卵的尿囊液/W/O乳状液）。向疫苗中加入TLR配体后，使用微涡旋仪彻底混合。
（“¼剂量的灭活的新城疫病毒”的意思是，已知在不存在寡脱氧核苷酸的情况下提供能保护家禽抵抗NDV感染的抗体滴度的灭活NDV的最小量的¼）。
2.3 接种
每组10只动物在3周龄时用0.5ml疫苗在右胸肌肌内注射接种。每组剩余2只动物未接种，并作为对照。
2.4 攻击
接种后3周，所有18组的所有12只动物用0.2ml活的NDV Herts 33/56 (每只鸡106.0 EID50 )在右腿肌肉通过肌内途径攻击。
2.5 血样
在接种（T=0）前一天从18只随机挑选的动物（每组1只）中取血样用于血清学，以及在首次接种后T=3周从所有动物中取血样用于血清学。攻击后两周从在NDV攻击中存活的所有剩余动物中取血液。
2.6 HI-测定
通过血凝抑制（HI）测定来测定NDV特异性抗体的血清水平。在微量滴定板中制备连续两倍稀释的血清，并与含8个血凝单位/50µl NDV抗原的等体积混合。滴度表示为给出完全的鸡红血细胞的血凝抑制（缓冲盐水中1％ (v/v)）的最高稀释度的倒数。将在稀释度≥1：2处血凝抑制的样品认为是阳性。
3 结果
NDV HI 滴度：
从结果中，还清楚的是NDV HI滴度与保护关联良好。对每一诱导保护的TLR配体，发现最高的HI滴度与最高的保护，即在每剂量10 µg相关联。相反，在TLR配体的最高剂量下，HI滴度是最低的。
组织学和病理学：
在注射部位的目视调查中，在不同组鸡的注射部位之间未发现主要的目视差异。这些观察表明所使用的TLR配体是安全的，并且它们没有诱导额外副作用，例如，局部反应。
保护/存活：
从结果中，清楚的是仅使用W/O乳状液中NDV没有获得保护（组1），而在一些其它组中由于向W/O乳状液中0.25% (w/w) NDV 克隆 30加入TLR配体，20%到90%的鸡被保护。
在未接种的对照鸡中没有观察到保护（n=36）。
实施例24
本发明的CpG基序的进一步的动物检测：
1 介绍
1.1 目标
为了评价X4-Pent-PDE联合W/O乳状液（基于矿物油的油包水乳状液）在鸡中对抗NDV、抗IBV和抗TRT抗体滴度的影响。
1.2 激发
在此试验中，我们研究了向联合W/O乳状液的灭活NDV、IBV或TRT抗原全剂量的四分之一中加入X4-Pent-PDE是否可以诱发这样的抗体滴度，所述抗体滴度与NDV和TRT全剂量或IBV半剂量相比时相等或更高。
2 材料和方法
2.1 实验的简短概述
4周龄SPF白来航鸡（每组n=10）的组在右腿肌肉中肌内（i.m.）接种一次表2中指示的制剂之一。在接种（T=0）前从20只随机挑选的动物中取血样，以及在接种后T=4和T=6周从所有组的所有动物中取血样。将血清用于确定抗NDV、抗IBV和抗TRT抗体滴度。
2.2 检测材料
2.2.1 检测品
2.2.1.1 抗原(失活的): NDV 克隆 30:包含8.06% w/v 的NDV感染的卵的尿囊液/W/O乳状液的全疫苗剂量。
IBV-249G:包含30 % w/v的
IB感染的卵的尿囊液/W/O乳状液的全疫苗剂量。
TRT:标准生产批次。全疫苗剂量包含
100 E.U./剂量。
2.2.1.2 疫苗：参见表2
2.2.1.3 免疫刺激剂：
X4-Pent-PDE:5’- GGGGGGTTCGTTTTCGTTTTCGTTTTCGTTTTCGTTGGGGG -3’
(Eurofins MWG Operon (德国))
2.2.2 疫苗制备
新鲜制备X4-Pent-PDE TLR配体预稀释液，并且加入疫苗中最高达2.5% v/v的终浓度，得到每0.5ml疫苗1 µg或10 µg的剂量。加入TLR配体后，疫苗使用微涡旋仪彻底混合。
2.3 接种
每组动物在4周龄时用0.5ml疫苗在右腿肌肉内肌内接种。
2.4 血样
在接种（T=0）前从20只随机挑选的动物中取血样用于血清学，以及在首次接种后T=4周从所有动物中取血样用于血清学。
2.5 抗体滴度
2.5.1 NDV HI-测定
通过血凝抑制（HI）测定来测定NDV特异性抗体的血清水平。在微量滴定板中制备连续两倍稀释的血清，并与含8个血凝单位/50µl NDV抗原的等体积混合。滴度表示为给出完全的鸡红血细胞的血凝抑制（缓冲盐水中1％ (v/v)）的最高稀释度的倒数。将在稀释度≥1：4处血凝抑制的样品认为是阳性，并以2log表示。
2.5.2 IBV HI-测定
通过血凝抑制（HI）测定来测定IB特异性抗体的血清水平。在微量滴定板中制备连续两倍稀释的血清，并与含8-16个血凝单位/50µl IBV-D274抗原的等体积混合。滴度表示为给出完全的鸡红血细胞的血凝抑制（缓冲盐水中1％ (v/v)）的最高稀释度的倒数。将在稀释度≥1：16处血凝抑制的样品认为是阳性，并以2log表示。
2.5.3 TRT ELISA
通过标准ELISA测定TRT特异性抗体的血清水平。简而言之，在微量滴定板中包被100 µl 1：200稀释的TRT抗原材料。将血清1：100和1：800预先稀释并加入微量滴定板中。将在滴度≥5的样品滴度认为是阳性，并以2log表示。
2.5.4 结论
从表2的结果可以立即得到下列结论：
1）¼ 剂量的NDV疫苗当与10µg X4-Pent 一起施用时，得到与不加入X4-Pent的NDV全剂量的滴度相当的滴度。
2）¼ 剂量的联合的NDV/IBV疫苗当与10µg X4-Pent 一起施用时，得到与不加入X4-Pent的联合的NDV/IBV疫苗全剂量相当的NDV和IBV滴度。
3）¼ 剂量的TRT疫苗当与10µg X4-Pent 一起施用时，得到与不加入X4-Pent的TRT疫苗全剂量相当的滴度。
3 结果
表2。
附图说明：
图1：pcDNA3.1(+)-chiTLR21的质粒图谱
图2-5：多种zeo/G418双抗性克隆细胞系的SEAP活性的概述。
图6：使用HD11-pNifTyhyg克隆细胞系从2000nM开始的滴定实验。
图7：从100nM开始的滴定实验中获得的HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21克隆细胞系的结果
图8：从2000nM开始的滴定实验中获得的 HD11-pNifTyhyg克隆细胞系的结果
图9：从100nM开始的滴定实验中获得的HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21克隆细胞系的结果
图10：从2000nM开始的滴定实验中获得的 HD11-pNifTyhyg克隆细胞系的结果
图11-15：从100nM开始的滴定实验中获得的HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21克隆细胞系的结果
图16-17：从50nM开始的滴定实验中获得的HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21克隆细胞系的结果
图18：从50nM开始的滴定实验中获得的 HEK293XL- pUNO-huTLR9-pNifTy2克隆细胞系的结果
图19：从20nM开始的滴定实验中获得的HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21克隆细胞系的结果
图20：从25nM开始的滴定实验中获得的HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21克隆细胞系的结果
图21：从20nM开始的滴定实验中获得的HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21克隆细胞系的结果
图22：从20nM开始的滴定实验中获得的HEK293-pNifTy2-pcDNA3.1-chiTLR21克隆细胞系的结果
图23：邻接骨架三聚体的T的数目的作用
图24：分隔CG元件的T的数目的作用
图25：TTCGTT重复的数目的作用
图26：TTCGTT重复的数目的作用
图27：重复三聚体的类型的作用
图28：TTCGTT重复边界处T残基数目的作用
图29：ODN-X42基序数目的作用
图30-31：ODN-X43基序数目的作用
图32：ODN-X4进一步的变异。
序列表
<110> Intervet International BV
<120> 免疫刺激性寡脱氧核苷酸
<130> 2010.031
<160> 136
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 1
gaagcttacc atgatggaga cagcggagaa ggc 33
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 2
ggcggccgct acatctgttt gtctccttcc ctg 33
<210> 3
<211> 2935
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 3
aagcttacca tgatggagac agcggagaag gcatggccca gcaccaggat gtgcccctcc 60
cactgctgtc cactctggct gctgctgctg gtgacagtga cactgatgcc gatggtgcac 120
ccgtatggct ttcgcaactg cattgaggat gtcaaggcac ctttgtactt ccgctgcatc 180
cagcgcttcc tgcagtcgcc ggccctggca gtgtctgacc tgccaccaca tgccatcgcg 240
ctcaatctgt catacaacaa aatgcgctgc ctgcagccct ctgcctttgc ccacctgaca 300
cagctgcata ccctggacct gacctacaac ctcctggaga ccctctcccc tggtgccttc 360
aatgggctgg gtgtgctggt ggtgctggac ctgtctcaca acaagctgac cacacttgct 420
gaaggggtgt tcaacagctt gggcaacctg tcctcgctgc aggtacaaca taaccccctc 480
agcacggtgt caccaagtgc tctgctaccc ctggtcaacc tgcgccgcct gtctctacgg 540
ggcgggcggc tgaatgggtt gggggcagtg gcagtggcag tgcagggctt ggcacagctg 600
gagctgttgg acctatgtga aaacaacctg acaacgctgg ggccaggccc accgctaccc 660
gcctcgctgc tcaccctgca gctgtgcaac aactcgctga gggagttagc ggggggcagc 720
ccggagatgc tatggcacgt gaagatactc gacctctcct acaacagtat ctcacaggcg 780
gaggtcttca cccagctcca cctgcgcaac atcagcctgc tccacctgat cggcaacccc 840
ttggatgtct tccacctgtt ggacatctct gacatccaac ctcgcagcct ggatttctct 900
gggttggtgc tgggggctca ggggctggat aaggtgtgcc tgaggctgca gggtccccag 960
gccttgcggc ggctgcagct acaacgcaac gggctgaagg tgctgcattg taatgcactg 1020
cagttgtgtc ctgtgctgag agagctggac ctgtcctgga accggctaca gcacgtgggc 1080
tgtgccggcc ggctgctggg caagaagcag cgggagaagc tggaagtgct gacagtggaa 1140
cacaacctgc tgaagaaact gccgtcttgc ctgggggccc aggtgctgcc tcggctgtac 1200
aacatttcct tccgctttaa ccgcatcctg actgttgggc cccaagcctt tgcctacgcc 1260
ccggccctgc aggtgttgtg gctcaatatt aacagcctgg tgtggctgga caggcaggca 1320
ctgtggaggc tgcacaacct gacagagctg cgcctggaca acaacctgct gaccgacctc 1380
tatcacaact ccttcattga cctccacaga ctgcgcaccc tcaacctgcg caacaaccgt 1440
gtctccgtcc tcttctctgg tgtcttccag gggctggctg agctgcagac gctggattta 1500
gggggcaaca acttgcgcca cctgactgca cagtcactgc aggggctgcc caaactgcgc 1560
aggctgtacc tggaccgcaa cagattgctg gaggtgagca gcactgtgtt cgccccagtg 1620
caggctaccc tgggggtgct ggacctgcgg gccaacaacc tgcagtacat ctcacagtgg 1680
ctgcgcaagc cgccaccctt ccgcaacctg agcagcctgt acgacctgaa gctgcaggcg 1740
cagcagccct atggactgaa gatgctgcct cactacttct tccagggctt ggtgaggctg 1800
cagcagctgt cgctgtcaca gaacatgctg cggtccatcc caccggatgt cttcgaggac 1860
ttgggccagc tgcgctccct ggcattggct gacagcagca atgggctgca tgacctgcct 1920
gacggcatct tcagaaacct gggcaacctg cggttcctgg acctggagaa tgcagggctg 1980
cactcgctca ctctggaagt cttcggcaat ctcagccggc tgcaggtgct gcacttggcc 2040
agaaacgagc tgaagacctt caatgacagc gttgccagcc ggctgtcctc cttgcgctac 2100
ctggacctgc gcaagtgtcc gctcagctgc acctgtgaca acatgtggct gcagggctgg 2160
ctgaacaaca gccgtgtgca ggttgtctac ccctacaact acacctgtgg ctcacagcac 2220
aatgcctaca tccacagctt tgacacacac gtctgcttcc tggacctggg gctctatctc 2280
tttgctggga ctgcaccggc agtgctgctg ctgctggtgg tgccggtggt gtaccaccgc 2340
gcctactgga ggctgaagta ccactggtac cttctgcggt gctgggtcaa ccagcggtgg 2400
cggcgggagg aaaagtgcta cctctatgac agctttgtgt cctacaattc agctgatgaa 2460
agttgggtgt tgcagaagct ggtgcctgag ctggagcacg gtgccttccg cctctgcttg 2520
caccaccgcg acttccagcc gggccgcagc atcattgaca acattgtgga tgctgtctac 2580
aacagccgga agacggtgtg cgtggtgagc cgcagctacc tgcgcagcga gtggtgctct 2640
ctagaggtgc agttggccag ctaccggctg ttggatgagc ggcgtgacat cctggtactg 2700
gtgctgctgg aggacgtggg tgatgctgag ctgtctgcct accaccgcat gcggcgggtg 2760
ctgctgcggc gcacctacct gcgctggcct cttgaccccg cagctcagcc gctcttttgg 2820
gcacggctga agagggcact gaggtgggga gagggaggag aggaggagga agaagaaggt 2880
ttgggtggag ggacgggaag gcccagggaa ggagacaaac agatgtagcg gccgc 2935
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 4
gggggggacg tcgacgtcga cgtcggggg 29
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 5
gggggggtcg ttgtcgttgt cgttggggg 29
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 6
ggggggaacg ttaacgttaa cgttggggg 29
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 7
ggggggttcg ttttcgtttt cgttggggg 29
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 8
ggggggaacg aaaacgaaaa cgaaggggg 29
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 9
ggggggcgcg cgcgcgcgcg cgcgggggg 29
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 10
ggggggttcg aattcgaatt cgaaggggg 29
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 11
ggggggtgcg gttgcggttg cggtggggg 29
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 12
ggggggtacg gttacggtta cggtggggg 29
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 13
ggggggttcg gtttcggttt cggtggggg 29
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 14
ggggggtccg gttccggttc cggtggggg 29
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 15
ggggggtgcg attgcgattg cgatggggg 29
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 16
ggggggtacg attacgatta cgatggggg 29
<210> 17
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 17
ggggggttcg atttcgattt cgatggggg 29
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 18
ggggggtccg attccgattc cgatggggg 29
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 19
ggggggtgcg tttgcgtttg cgttggggg 29
<210> 20
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 20
ggggggtacg tttacgttta cgttggggg 29
<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 21
ggggggttcg ttttcgtttt cgttggggg 29
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 22
ggggggtccg tttccgtttc cgttggggg 29
<210> 23
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 23
ggggggtgcg cttgcgcttg cgctggggg 29
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 24
ggggggtacg cttacgctta cgctggggg 29
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 25
ggggggttcg ctttcgcttt cgctggggg 29
<210> 26
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 26
ggggggtccg cttccgcttc cgctggggg 29
<210> 27
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 27
ggggggttcg ttttcgtttt cgttggggg 29
<210> 28
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 28
ggggggttcg tgttcgtgtt cgtgggggg 29
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 29
ggggggttcg tattcgtatt cgtaggggg 29
<210> 30
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 30
ggggggttcg tcttcgtctt cgtcggggg 29
<210> 31
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 31
gggggggtcg ttgtcgttgt cgttggggg 29
<210> 32
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 32
ggggggatcg ttatcgttat cgttggggg 29
<210> 33
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 33
ggggggctcg ttctcgttct cgttggggg 29
<210> 34
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 34
ggggggttcg ttttcgtttt cgttggggg 29
<210> 35
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 35
ggggggttcg ttttcgtttt cgttggggg 29
<210> 36
<211> 28
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 36
gggggttcgt tttcgttttc gttggggg 28
<210> 37
<211> 27
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 37
ggggttcgtt ttcgttttcg ttggggg 27
<210> 38
<211> 26
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 38
gggttcgttt tcgttttcgt tggggg 26
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 39
ggttcgtttt cgttttcgtt ggggg 25
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 40
gttcgttttc gttttcgttg gggg 24
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 41
ttcgttttcg ttttcgttgg ggg 23
<210> 42
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 42
ggggggttcg ttttcgtttt cgttggggg 29
<210> 43
<211> 28
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 43
ggggggttcg ttttcgtttt cgttgggg 28
<210> 44
<211> 27
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 44
ggggggttcg ttttcgtttt cgttggg 27
<210> 45
<211> 26
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 45
ggggggttcg ttttcgtttt cgttgg 26
<210> 46
<211> 25
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 46
ggggggttcg ttttcgtttt cgttg 25
<210> 47
<211> 24
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 47
ggggggttcg ttttcgtttt cgtt 24
<210> 48
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 48
ggggggttcg ttttcgtttt cgttggggg 29
<210> 49
<211> 31
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 49
gggggggttc gttttcgttt tcgttggggg g 31
<210> 50
<211> 33
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 50
ggggggggtt cgttttcgtt ttcgttgggg ggg 33
<210> 51
<211> 17
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 51
ggggggttcg ttggggg 17
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 52
ggggggttcg ttttcgttgg ggg 23
<210> 53
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 53
ggggggttcg ttttcgtttt cgttggggg 29
<210> 54
<211> 35
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 54
ggggggttcg ttttcgtttt cgttttcgtt ggggg 35
<210> 55
<211> 41
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 55
ggggggttcg ttttcgtttt cgttttcgtt ttcgttgggg g 41
<210> 56
<211> 47
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 56
ggggggttcg ttttcgtttt cgttttcgtt ttcgttttcg ttggggg 47
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 57
ggggggttcg tcgtcgttgg ggg 23
<210> 58
<211> 25
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 58
ggggggttcg ttcgttcgtt ggggg 25
<210> 59
<211> 27
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 59
ggggggttcg tttcgtttcg ttggggg 27
<210> 60
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 60
ggggggttcg ttttcgtttt cgttggggg 29
<210> 61
<211> 31
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 61
ggggggttcg tttttcgttt ttcgttgggg g 31
<210> 62
<211> 33
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 62
ggggggttcg ttttttcgtt ttttcgttgg ggg 33
<210> 63
<211> 27
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 63
ggggggtcgt tttcgttttc gtggggg 27
<210> 64
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 64
ggggggttcg ttttcgtttt cgttggggg 29
<210> 65
<211> 31
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 65
ggggggtttc gttttcgttt tcgtttgggg g 31
<210> 66
<211> 33
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 66
ggggggtttt cgttttcgtt ttcgttttgg ggg 33
<210> 67
<211> 27
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 67
ggggggtcgt tttcgttttc gtggggg 27
<210> 68
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 68
ggggggttcg ttttcgtttt cgttggggg 29
<210> 69
<211> 31
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 69
ggggggtttc gttttcgttt tcgtttgggg g 31
<210> 70
<211> 33
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 70
ggggggtttt cgttttcgtt ttcgttttgg ggg 33
<210> 71
<211> 35
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 71
ggggggtttt tcgttttcgt tttcgttttt ggggg 35
<210> 72
<211> 37
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 72
ggggggtttt ttcgttttcg ttttcgtttt ttggggg 37
<210> 73
<211> 39
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 73
ggggggtttt tttcgttttc gttttcgttt ttttggggg 39
<210> 74
<211> 41
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 74
ggggggtttt ttttcgtttt cgttttcgtt ttttttgggg g 41
<210> 75
<211> 43
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 75
ggggggtttt tttttcgttt tcgttttcgt ttttttttgg ggg 43
<210> 76
<211> 45
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 76
ggggggtttt ttttttcgtt ttcgttttcg tttttttttt ggggg 45
<210> 77
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 77
ggggggttcg tcgtcgttgg ggg 23
<210> 78
<211> 25
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 78
ggggggttcg ttcgttcgtt ggggg 25
<210> 79
<211> 27
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 79
ggggggttcg tttcgtttcg ttggggg 27
<210> 80
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 80
ggggggttcg ttttcgtttt cgttggggg 29
<210> 81
<211> 31
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 81
ggggggttcg tttttcgttt ttcgttgggg g 31
<210> 82
<211> 33
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 82
ggggggttcg ttttttcgtt ttttcgttgg ggg 33
<210> 83
<211> 35
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 83
ggggggttcg tttttttcgt ttttttcgtt ggggg 35
<210> 84
<211> 37
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 84
ggggggttcg ttttttttcg ttttttttcg ttggggg 37
<210> 85
<211> 39
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 85
ggggggttcg tttttttttc gttttttttt cgttggggg 39
<210> 86
<211> 41
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 86
ggggggttcg tttttttttt cgtttttttt ttcgttgggg g 41
<210> 87
<211> 17
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 87
ggggggttcg ttggggg 17
<210> 88
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 88
ggggggttcg ttttcgttgg ggg 23
<210> 89
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 89
ggggggttcg ttttcgtttt cgttggggg 29
<210> 90
<211> 35
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 90
ggggggttcg ttttcgtttt cgttttcgtt ggggg 35
<210> 91
<211> 41
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 91
ggggggttcg ttttcgtttt cgttttcgtt ttcgttgggg g 41
<210> 92
<211> 47
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 92
ggggggttcg ttttcgtttt cgttttcgtt ttcgttttcg ttggggg 47
<210> 93
<211> 53
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 93
ggggggttcg ttttcgtttt cgttttcgtt ttcgttttcg ttttcgttgg ggg 53
<210> 94
<211> 59
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 94
ggggggttcg ttttcgtttt cgttttcgtt ttcgttttcg ttttcgtttt cgttggggg 59
<210> 95
<211> 65
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 95
ggggggttcg ttttcgtttt cgttttcgtt ttcgttttcg ttttcgtttt cgttttcgtt 60
ggggg 65
<210> 96
<211> 71
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 96
ggggggttcg ttttcgtttt cgttttcgtt ttcgttttcg ttttcgtttt cgttttcgtt 60
ttcgttgggg g 71
<210> 97
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 97
ggggggttcg ttttcgtttt cgttggggg 29
<210> 98
<211> 35
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 98
ggggggtttc gttttttcgt tttttcgttt ggggg 35
<210> 99
<211> 41
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 99
ggggggtttt cgtttttttt cgtttttttt cgttttgggg g 41
<210> 100
<211> 47
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 100
ggggggtttt tcgttttttt tttcgttttt tttttcgttt ttggggg 47
<210> 101
<211> 19
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 101
ggggggtttc gtttggggg 19
<210> 102
<211> 27
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 102
ggggggtttc gttttttcgt ttggggg 27
<210> 103
<211> 35
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 103
ggggggtttc gttttttcgt tttttcgttt ggggg 35
<210> 104
<211> 43
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 104
ggggggtttc gttttttcgt tttttcgttt tttcgtttgg ggg 43
<210> 105
<211> 51
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 105
ggggggtttc gttttttcgt tttttcgttt tttcgttttt tcgtttgggg g 51
<210> 106
<211> 59
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 106
ggggggtttc gttttttcgt tttttcgttt tttcgttttt tcgttttttc gtttggggg 59
<210> 107
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 107
ggggggttcg ttttgctttt gcttggggg 29
<210> 108
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 108
ggggggttcg tgttgctgtt gctgggggg 29
<210> 109
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 109
ggggggttcg tattgctatt gctaggggg 29
<210> 110
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 110
ggggggttcg tcttgctctt gctcggggg 29
<210> 111
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 111
gggggggtcg ttgtcgttgt cgttggggg 29
<210> 112
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 112
gggggggtcg tggtcgtggt cgtgggggg 29
<210> 113
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 113
gggggggtcg tagtcgtagt cgtaggggg 29
<210> 114
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 114
gggggggtcg tcgtcgtcgt cgtcggggg 29
<210> 115
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 115
ggggggatcg ttatcgttat cgttggggg 29
<210> 116
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 116
ggggggctcg ttctcgttct cgttggggg 29
<210> 117
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 117
ggggggttcg ttttcgtttt cgttggggg 29
<210> 118
<211> 17
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 118
ggggggttcg taggggg 17
<210> 119
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 119
ggggggttcg tattcgtagg ggg 23
<210> 120
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 120
ggggggttcg tattcgtatt cgtaggggg 29
<210> 121
<211> 35
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 121
ggggggttcg tattcgtatt cgtattcgta ggggg 35
<210> 122
<211> 41
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 122
ggggggttcg tattcgtatt cgtattcgta ttcgtagggg g 41
<210> 123
<211> 47
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 123
ggggggttcg tattcgtatt cgtattcgta ttcgtattcg taggggg 47
<210> 124
<211> 17
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 124
ggggggttcg tcggggg 17
<210> 125
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 125
ggggggttcg tcttcgtcgg ggg 23
<210> 126
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 126
ggggggttcg tcttcgtctt cgtcggggg 29
<210> 127
<211> 35
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 127
ggggggttcg tcttcgtctt cgtcttcgtc ggggg 35
<210> 128
<211> 41
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 128
ggggggttcg tcttcgtctt cgtcttcgtc ttcgtcgggg g 41
<210> 129
<211> 47
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 129
ggggggttcg tcttcgtctt cgtcttcgtc ttcgtcttcg tcggggg 47
<210> 130
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 130
ggggggttcg ttttcgtttt cgttggggg 29
<210> 131
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 131
ggggggggcg ttggcgttgg cgttggggg 29
<210> 132
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 132
ggggggaacg ttaacgttaa cgttggggg 29
<210> 133
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 133
ggggggcccg ttcccgttcc cgttggggg 29
<210> 134
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 134
ggggggttcg ggttcgggtt cgggggggg 29
<210> 135
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 135
ggggggttcg aattcgaatt cgaaggggg 29
<210> 136
<211> 29
<212> DNA
<213> 合成的DNA
<400> 136
ggggggttcg ccttcgcctt cgccggggg
1

Claims (8)

1.免疫刺激性非甲基化的寡脱氧核苷酸，其由选自以下的式所示的序列组成：ODN X4、ODN Y3、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y12、Y14、Y15、Y16、X41、X42、X43、X4-5MIN1、X4-5MIN2、X4-3MIN1、X4-3MIN2、X4-3MIN3、X4-3MIN4、X4-3MIN5、X4 - plus1、X4 - plus2、X4-Li3、X4-Li5、X4-Li6、X4-Li7、X4-Li8、X4-Li9、X4-Li10、X4-Bo1、X4-Bo3、X4-Bo4、X4-Bo5、X4-Bo6、X4-Bo7、X4-Bo8、X4-Bo9、X4-Bo10、X4-Trip、X4-Quad、X4-Pent、X4-Hex、X4-Hept、X4-Oct、X4-Non、X4-Dec、X4-I、X4-II、X4-III、X4-I-trip、X4-I-quad、X4-I-pent、X4-I-hex、X42-trip、X42-quad、X42-pent、X42-hex、CC-X、X23。
2.根据权利要求1的寡脱氧核苷酸，其中所述寡脱氧核苷酸偶联于载体或半抗原。
3.包含根据权利要求1或2的寡脱氧核苷酸的载体。
4.预防或抗击感染性疾病的疫苗，其特征在于所述疫苗包含免疫刺激性量的根据权利要求1或2的寡脱氧核苷酸和/或根据权利要求3的载体、免疫量的抗原组分或编码抗原组分的遗传信息、和药学上可接受的载体。
5.根据权利要求4的疫苗，其特征在于所述抗原组分是或者源自在其野生型形式下对家禽是致病的病毒或微生物。
6.根据权利要求5的疫苗，其特征在于所述病毒或微生物选自传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病（甘布罗病囊）、鸡贫血剂、禽呼肠孤病毒、鸡败血支原体（Mycoplasma gallisepticum）、火鸡鼻气管炎病毒、副鸡嗜血菌（鼻炎）（Haemophilusparagallinarum (Coryza)）、鸡痘病毒、禽脑脊髓炎病毒、减蛋综合征病毒、传染性喉气管炎病毒、火鸡疱疹病毒、艾美耳球虫种（Eimeria species）、鼻腔鸟杆菌（Ornithobacteriumrhinotracheale）、多杀性巴斯德氏菌（Pasteurella multocida）、关节液支原体（Mycoplasma synoviae）、沙门氏菌属物种（Salmonella species）和大肠杆菌（E. coli）。
7.根据权利要求1或2的免疫刺激性非甲基化的寡脱氧核苷酸在制备药物中的用途。
8.根据权利要求1或2的免疫刺激性非甲基化的寡脱氧核苷酸制备药物中的用途，所述药物用于预防家禽中的感染。
CN201180063723.0A 2010-12-30 2011-12-29 免疫刺激性寡脱氧核苷酸 Active CN103270159B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10197435.0 2010-12-30
EP10197435A EP2471926A3 (en) 2010-12-30 2010-12-30 Immunostimulatory oligodeoxynucleotides
US201161430301P 2011-01-06 2011-01-06
US61/430301 2011-01-06
PCT/EP2011/074211 WO2012089800A1 (en) 2010-12-30 2011-12-29 Immunostimulatory oligodeoxynucleotides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103270159A CN103270159A (zh) 2013-08-28
CN103270159B true CN103270159B (zh) 2016-10-26

Family

ID=44913150

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180063723.0A Active CN103270159B (zh) 2010-12-30 2011-12-29 免疫刺激性寡脱氧核苷酸

Country Status (10)

Country Link
US (1) US9364531B2 (zh)
EP (2) EP2471926A3 (zh)
JP (2) JP5876889B2 (zh)
CN (1) CN103270159B (zh)
BR (1) BR112013016683A2 (zh)
CA (1) CA2823065C (zh)
MX (1) MX343048B (zh)
RU (1) RU2615457C2 (zh)
WO (1) WO2012089800A1 (zh)
ZA (1) ZA201304712B (zh)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2471926A3 (en) 2010-12-30 2012-07-11 Intervet International BV Immunostimulatory oligodeoxynucleotides
BR112013029966A2 (pt) 2011-05-26 2017-01-31 Intervet Int Bv oligodesoxinucleotídeo imunoestimulatório não metilado, vetor, e, vacina para prevenir ou combater uma doença infecciosa
AR091569A1 (es) * 2012-06-28 2015-02-11 Intervet Int Bv Receptores de tipo toll
EP2754714A1 (en) * 2013-01-14 2014-07-16 Sarepta Therapeutics, Inc. Inhibitory oligonucleotides and their use in therapy
JP2016526532A (ja) 2013-06-14 2016-09-05 インターベット インターナショナル ベー． フェー． ＧｐＧオリゴデオキシヌクレオチドおよびサイクリックｄｉ‐ＧＭＰを含む医薬組成物
AR097029A1 (es) * 2013-07-26 2016-02-17 Intervet Int Bv Aceleración de la respuesta inmune inducida por virus vectorial en aves, composición, uso, método para la vacunación y método para acelerar la respuesta inmune
US10493147B2 (en) 2014-10-03 2019-12-03 Intervet Inc. Broad-spectrum vaccine against avian reovirus
CN105816868B (zh) * 2016-03-21 2020-01-03 青岛易邦生物工程有限公司 一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗
MX2018014857A (es) * 2016-06-02 2019-03-07 Zoetis Services Llc Vacuna contra la bronquitis infecciosa.
CN106177937A (zh) * 2016-07-25 2016-12-07 江苏省农业科学院 鸡减蛋综合征和禽脑脊髓炎二联灭活疫苗及其制备方法
CN106177956B (zh) * 2016-08-29 2019-11-26 东北农业大学 提高鸡抗ndv病毒效果的方法
US20200323975A1 (en) * 2017-12-04 2020-10-15 Intervet Inc. Vaccination with replicon particles and oil adjuvant
EP3701032A1 (en) * 2017-12-15 2020-09-02 Bayer Animal Health GmbH Immunostimulatory oligonucleotides
MX2020006343A (es) 2017-12-20 2020-09-03 Intervet Int Bv Diluyente mejorado para vacuna de herpesvirus alfa asociado con celulas.
CN110404064B (zh) * 2018-04-27 2023-06-16 洛阳赛威生物科技有限公司 一种禽用佐剂组合物及其制备方法
CN113194989B (zh) 2018-12-20 2024-01-30 英特维特国际股份有限公司 初免-强化免疫接种方案
BR112022010825A2 (pt) 2019-12-20 2022-08-23 Intervet Int Bv Vacina de vetor hvt multivalente
CN116648259A (zh) 2020-12-24 2023-08-25 英特维特国际股份有限公司 多价hvt载体疫苗
WO2023213946A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Intervet International B.V. New multivalent hvt vector vaccine

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010125480A1 (en) * 2009-04-30 2010-11-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Pneumococcal vaccine and uses thereof

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
AU2001231245A1 (en) 2000-01-31 2001-08-07 The Regents Of The University Of California Immunomodulatory polynucleotides in treatment of an infection by an intracellular pathogen
US7585847B2 (en) 2000-02-03 2009-09-08 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy
PT1446162E (pt) * 2001-08-17 2009-01-27 Coley Pharm Gmbh Agrupamentos imunoestimuladores oligonucléotidos com actividade melhorada
CN1599623B (zh) 2001-09-14 2011-05-11 赛托斯生物技术公司 免疫刺激物向病毒样颗粒内的包装:制备方法与用途
EP1551221A4 (en) 2002-07-03 2007-08-01 Coley Pharm Group Inc NUCLEIC ACID COMPOSITIONS FOR STIMULATING IMMUNE RESPONSES
AR040996A1 (es) 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
RU2338750C2 (ru) * 2002-08-19 2008-11-20 Коли Фармасьютикал Груп, Инк. ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИЕ ФОСФОРТИОАТНЫЕ CpG-ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ФОСФОДИЭФИРНЫЕ СВЯЗИ, СПОСОБ ИММУНОМОДУЛЯЦИИ, СПОСОБ СТИМУЛИРОВАНИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА
PT1992635E (pt) * 2002-12-23 2012-03-20 Dynavax Tech Corp Oligonucleótidos de sequência imunoestimuladora e métodos de utilização dos mesmos
WO2006056142A1 (fr) * 2004-11-29 2006-06-01 Changchun Huapu Biotechnology Co., Ltd. Desoxynucleotides cpg a brin unique a utiliser comme adjuvant
CN1810970B (zh) 2005-01-27 2011-05-18 长春华普生物技术有限公司 含CpG的单链脱氧核苷酸与其疫苗组合物及其应用
WO2007020017A1 (en) 2005-08-12 2007-02-22 Bionostra, S.L. Composition for bird immunization administered by aerosol
DE102006031483B4 (de) 2006-07-07 2009-12-24 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Zellulärer Pyrogentest
KR20100010509A (ko) * 2007-05-17 2010-02-01 콜레이 파마시티컬 그룹, 인코포레이티드 면역자극 효과를 갖는 ａ 클래스 올리고뉴클레오타이드
EP2178896A1 (en) * 2007-07-31 2010-04-28 The Johns Hopkins University Polypeptide-nucleic acid conjugate for immunoprophylaxis or immunotherapy for neoplastic or infectious disorders
WO2009088401A2 (en) * 2007-09-24 2009-07-16 Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Immunostimulatory combinations of tlr ligands and methods of use
US20100239523A1 (en) * 2007-10-30 2010-09-23 The Regents Of The University Of Colorado Tlr modulators and methods for using the same
TWI351288B (en) * 2008-07-04 2011-11-01 Univ Nat Pingtung Sci & Tech Cpg dna adjuvant in avian vaccines
CA2734643A1 (en) 2008-08-18 2010-02-25 The Kitasato Institute Avian influenza virus antigen, and booster immunization method for avian influenza vaccine in combination with mucosal adjuvant which is effective through oral administration
EP2865389A1 (en) 2008-12-09 2015-04-29 Pfizer Vaccines LLC IgE CH3 peptide vaccine
EP2471926A3 (en) 2010-12-30 2012-07-11 Intervet International BV Immunostimulatory oligodeoxynucleotides
BR112013029966A2 (pt) 2011-05-26 2017-01-31 Intervet Int Bv oligodesoxinucleotídeo imunoestimulatório não metilado, vetor, e, vacina para prevenir ou combater uma doença infecciosa

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010125480A1 (en) * 2009-04-30 2010-11-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Pneumococcal vaccine and uses thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Transcriptional regulation of Wnt inhibitory factor-1 by Miz-1/c-Myc;Licchesi et al;《Oncogene》;20101104;supplementary table 1 *
Vaccination with Newcastle disease vaccine and CpG oligodeoxynucleotides induces specific immunity and protection against Newcastle disease virus in SPF chicken;Zhang et al;《Veterinary Immunology and Immunopathology》;20071231;216–222 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2658974B1 (en) 2016-07-20
JP5876889B2 (ja) 2016-03-02
RU2615457C2 (ru) 2017-04-04
ZA201304712B (en) 2014-03-26
RU2013135485A (ru) 2015-02-10
MX343048B (es) 2016-10-21
MX2013007657A (es) 2013-08-29
CN103270159A (zh) 2013-08-28
BR112013016683A2 (pt) 2017-07-11
EP2658974A1 (en) 2013-11-06
EP2471926A3 (en) 2012-07-11
CA2823065C (en) 2019-03-05
CA2823065A1 (en) 2012-07-05
JP2016105707A (ja) 2016-06-16
EP2471926A2 (en) 2012-07-04
JP2014507131A (ja) 2014-03-27
US9364531B2 (en) 2016-06-14
US20140205633A1 (en) 2014-07-24
WO2012089800A1 (en) 2012-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103270159B (zh) 免疫刺激性寡脱氧核苷酸
CN107513533A (zh) 免疫刺激性寡脱氧核苷酸
RU2658439C2 (ru) Мультивалентные рекомбинантные вирусы птичьего герпеса и вакцины для иммунизации птиц
CN102405058B (zh) 用于免疫接种水禽物种的重组禽疱疹病毒载体和疫苗
Glávits et al. Comparative pathological studies on domestic geese (Anser anser domestica) and Muscovy ducks (Cairina moschata) experimentally infected with parvovirus strains of goose and Muscovy duck origin
CN103547674A (zh) 免疫刺激性寡脱氧核苷酸
Ottiger Development, standardization and assessment of PCR systems for purity testing of avian viral vaccines
JP2779447B2 (ja) 弱毒マレック病ウイルス・ベクターを用いる組換え遺伝子作成法、及び該ウイルスの組換え体
Moreno et al. Epidemic of infectious laryngotracheitis in Italy: characterization of virus isolates by PCR–restriction fragment length polymorphism and sequence analysis
Luan et al. Development of a real-time quantitative RT-PCR to detect REV contamination in live vaccine
Alvarado et al. Molecular characterization of avian infectious bronchitis virus strains isolated in Colombia during 2003
Ball et al. Comparative protective immunity provided by live vaccines of Newcastle disease virus or avian metapneumovirus when co-administered alongside classical and variant strains of infectious bronchitis virus in day-old broiler chicks
CN106661592A (zh) 以重组血清型9禽腺病毒载体形式的疫苗
Chacón et al. Development and validation of nested-PCR for the diagnosis of clinical and subclinical infectious laryngotracheitis
Ginsberg Adenoviruses
Bourogâa et al. Evaluation of protection conferred by a vaccination program based on the H120 and CR88 commercial vaccines against a field variant of avian infectious bronchitis virus
CN105814203B (zh) 禽流感病毒miRNA及其鉴定、检测和应用
Rim et al. Viral interference between H9N2-low pathogenic avian influenza virus and avian infectious bronchitis virus vaccine strain H120 in vivo
Okino et al. Rapid detection and differentiation of avian infectious bronchitis virus: an application of Mass genotype by melting temperature analysis in RT-qPCR using SYBR Green I
Fazel et al. Evaluation of the viral interference between lentogenic Newcastle disease virus (Lasota) and avian influenza virus (H9N2) using real-time reverse transcription polymerase chain reaction in SPF chicken
Reemers et al. Reduced immune reaction prevents immunopathology after challenge with avian influenza virus: A transcriptomics analysis of adjuvanted vaccines
CN104357460B (zh) 重组鸭病毒性肠炎病毒、制备方法和应用
Wambura et al. Determination of organ tropism of Newcastle disease virus (Strain I-2) by virus isolation and reverse transcription–polymerase chain reaction
Fathy et al. Evaluation of bivalent inactivated infectious bronchitis viral vaccine prepared from local isolates
Abdulmaged Efficacy of infectious bronchitis disease vaccines as measured by viral shed after virulent challenge in broiler

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant