JP5876889B2 - 免疫賦活性オリゴデオキシヌクレオチド - Google Patents
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Description
これは[N1]および[N2]ヌクレオチドがGであるときの特別な場合である。
2)5’[G]x{N3TCGTC}n[G]z 3’ ここでN3=GまたはT、n=5〜100、x=3〜10、z=0〜10
3)5’[G]x{TTCGCC}n[G]z 3’ ここでn=5〜100、x=3〜10、z=0〜10
4)5’[G]x{T[T]pCG[T]qT}n[G]z 3’ ここでp=1〜10、q=1〜10、n=5〜100、x=3〜10、z=0〜10
これら4の全ての式にとって、費用対効果の理由からnは好ましくは5〜18の範囲である。Xは4〜9、5〜8、6または7の範囲がその優先順位で好ましく、zは8、7、6、5、4、3、2、1または0がその優先順位で好ましい。該当する場合は、pは好ましくは1〜5ならびにqは好ましくは1〜5である。
最近のニワトリTLR研究の進歩は、TLR21は鳥類における哺乳動物のTLR9の機能的ホモログであることを示唆する(Keestra 2008年、Brownlieら、2009年)。
ヒト胎児腎(HEK)細胞293は1970年代にウイルスによる形質転換によって樹立され(Grahamら、1977年)、今ではATCC等の細胞株寄託機関経由で研究者たちに入手可能である。
ニワトリHD11細胞および異種的に発現されたニワトリTLR21に対する異型の6塩基配列モチーフの活性を同定するために、CpGエレメントに直に隣接する位置が並び替えられた誘導体を作成した。
ニワトリ細胞HD11に対するさらなる6塩基配列モチーフをさらに同定するために、ODN‐X4中のTpCpGpTエレメントの5’側の隣接位置を並び替えた。
ニワトリ細胞HD11および異種的に発現されたニワトリTLR21におけるPDE型ODN X4に対する構造活性相関(SAR)をさらに特性化するために、5’‐dG6の短縮または削除の効果を研究した。
ODN‐X4‐5’‐4〜‐6はこの濃度範囲では不活性である。
ニワトリHD11細胞および異種的に発現されたニワトリTLR21におけるPDE型ODN X4に対する構造活性相関(SAR)をさらに特性化するために、3’‐dG6の短縮または削除の効果を研究した。
CpG‐ODNの安定性および免疫賦活性の効力を改善するために、ホスホロチオエート型(PTO)アナログによるリン酸ジエステル(PDE)結合の置換を研究した。HD11‐pNifTyhygニワトリマクロファージおよび異種的に発現されたニワトリTLR21におけるPDE‐ODN X4に対する構造活性相関(SAR)という観点をさらに特性づけるために、PTOによるすべてのPDE結合の置換(ODN‐X4‐PTO)の効果および5’‐dG6および3’‐dG5の連続配列だけにおけるPTOによるPDE結合の置換(ODN‐X4‐PTO‐Gonly)の効果を研究した。
ODN‐X4(PDE)の種特異性を研究するために、HEK293‐XL‐pUNO‐ヒトTLR9細胞を購入し、その後pNifTy2を用いて形質移入し、文献のPTO‐CpGに対するそれらの応答性を確立し、機能細胞株を樹立し、それからその中の一つをHEK293‐pNifTy2‐pcDNA3.1‐chiTLR21に関する比較試験に使用した。
X41: 未検、 >> 100 nM
X42: 62.1 nM
X43: 3.3 nM
これら(および以前の)結果に基づくと、最大刺激作用およびEC50値の双方に関してODN‐X43はODN‐X4より優れている。ODN‐X42は最大刺激作用に関してはやや低いが、EC50はODN‐X4のそれと同等である。
PDE‐ODNの効力をODN‐X2に基づき探索するために、以下のODNを6量体の5’末端および3’末端の修飾体として合成した。X2、X24、X25およびX26/X4の結果は上述した。
X4: 61.6 nM
これらの(および以前の)結果に基づくと、ODN‐X23は最大刺激作用およびEC50値の双方に関してODN‐X4より優れている。
ODN‐X4‐trip 40.6 nM
ODN‐X42‐trip 33 nM
ODN‐X42‐quad 3.1 nM
ODN‐X42‐pent 0.84 nM
ODN‐X42‐hex 0.37 nM
ODN‐X4‐trip‐PTO‐Gonly 6.8 nM
先の試験で検討した通り、X4‐tripおよびX42‐tripの効力は同等である。X42系列におけるヘキサヌクレオチド繰り返し数を減少させることは、活性の損失をもたらすが(X42‐sing、X42‐doub)、一方で4、5および6までの数の増加は、最大シグナルおよびEC50におけるその順での増加をもたらし、X42‐pentではピコモルの効力に達する。また驚くべきは、X42‐quad以降のODNがODN‐X4‐trip‐PTO‐Gonlyよりも優れているという事実である。
ODN‐43はTTCGTCモチーフの三量体に基づいている。モチーフ数の効果を試験するために、1から6までモチーフ数を研究した。
PDE‐ODNの効力をODN‐X4に基づきさらに探索することを目的として、CpGエレメントの5’‐側および3’‐側のTTジヌクレオチドをGG、AAおよびCCそれぞれで置換してODNを合成した。
1 諸言
1.1 目的
W/O型エマルジョンと組み合わせた、最小限量の不活化NDVクローン30抗原と併用するTLR(Toll様受容体)が、生NDV Hedrts33/56の攻撃感染に対し保護を与えるかどうかを評価すること。
2 材料と方法
2.1 試験の簡単な概略
隔離飼育器に収容した、3週齢のSPFホワイトレグホンニワトリの18群に、表1「群分けおよび投薬」に示す製剤の一つにより、右胸筋の筋肉内に1回だけワクチン接種した(筋肉内注射)。12羽の動物からなる各々の群から、10羽だけにワクチン接種し、残りの2羽は対照として役立てた。血液試料は、ワクチン接種一日前(T=0)に無作為に選びとった18羽の動物(各々の群から1羽)から、およびワクチン接種後のT=3週間目に全群の全動物から採取した。ワクチン接種後のT=3週間目の血液採取後に、全ニワトリは、ニワトリ当たり0.2mlの短潜伏期性のNDV株Herts33/56(106.0EID50)を用いて右下肢筋に筋肉内(i.m.)経路により攻撃感染した。攻撃感染後の14日の期間、ニワトリはNDV感染の臨床エビデンスまたは致死率の発生に関し毎日点数化した。攻撃感染後の2週間目に、血液を全動物から採取し、その後動物を安息死させた。局所反応は肉眼的にしらべて点数化した。反応または病変が観察可能であるときは型通りの組織学用試料を採取した。
2.2.1
2.2.1.1 ワクチン:0.25%w/wの不活化NDVクローン30(W/O型エマルジョン中)
2.2.1.2 TLRリガンド:X4‐PDE(Y11)―Biolegio社製―オランダ
X4‐PTO(Y11)‐TibMolBiol社製―ベルリン‐ドイツ
X4‐PTO‐G‐only(Y11)―TibMolBiol社製
2007‐PTO(文献公知)―TibMolBiol社製
2.2.1.3 CpG配列:
各々のTLRリガンドについて一定の希釈液を新たに作成し、0.5ml当たり1μgまたは10μgの用量となるように、終濃度2.5%v/vになるまでそれを[0.25%w/wNDVのW/O型エマルジョン]‐ワクチンに添加した。(ここで使用する試験ワクチンのワクチン総投与量は、8.06%w/vNDV感染卵尿膜腔液/W/O型エマルジョンを含む。)ワクチンへTLRリガンドを添加した後、ミニ‐ボルテックスを使用して激しく混合した。
2.3 ワクチン接種
各々の群の動物10羽に、3週齢で0.5mlのワクチンを用いて筋肉内注射で右胸筋に接種した。各々の群の残りの動物2羽は接種せずに対照として役立てた。
ワクチン接種後3週間目に、全18群の全12動物を、0.2mlの生NDV Herts33/65(ニワトリ当たり106.0EID50)を用いて筋肉内注射経路により右下肢筋に攻撃感染した。
血清学用の血液は、ワクチン接種一日前に(T=0)無作為に選びとった18羽の動物(各々の群から1羽)から、および一次接種後T=3週間目に全動物から採取した。攻撃感染後2週間目の血液を、NDV攻撃感染に生き残った全ての残っている動物から採取した。
NDV特異抗体の血清レベルは、赤血球凝集抑制(HI)アッセイによって測定した。血清の2段階希釈液をマイクロタイタープレート中で調製し、それからNDV抗原50μl中に8赤血球凝集単位を含む等容量と混合した。力価は、ニワトリの赤血球(緩衝食塩水中1%(v/v))の血球凝集を完全に抑制する最高希釈倍数の逆数で表した。試料は、1:2以上の希釈倍数における赤血球凝集抑制に対して陽性とみなした。
結果から、またNDVのHI力価は保護と正確に相関することも明らかである。保護を誘導した各々のTLRリガンドに対し、最高のHI力価が、換言すれば用量当たり10μgで、最高の保護と相関することが見出された。対照的に、TLRリガンドの最も高い用量でHI力価は最も低かった。
注射部位の肉眼観察による研究において、異なる群由来のトリの注射部位の間に肉眼観察による差異は認められなかった。これらの観察は、使用したTLRリガンドが安全であり、しかもそれらが例えば局所反応等の追加の副作用を誘発しなかったことを示している。
結果から、NDVのW/O型エマルジョンだけを用いては保護が得られなかったことが明らかであり(群1)、一方いくつかの他の群においては20%ないし90%のトリが、0.25%(w/w)NDVクローン30W/O型エマルジョンへのTLRリガンドの付加により保護された。
1.1 目的
W/O型エマルジョン(鉱物油に基づいた油中水型エマルジョン)と組み合わせたX4‐Pent‐PDEのニワトリにおける抗NDV、抗IBVおよび抗TRT抗体力価に及ぼす影響を評価すること。
本試験において発明者らは、W/O型エマルジョンと組み合わせた総用量の1/4の不活化NDV、IBVまたはTRT抗原へのX4‐Pent‐PDEの付加が、NDVおよびTRTの総用量、またはIBVの半分の用量と比べたときに同等かより高い抗体力価を惹起することができるか否かを研究した。
2.1 試験の簡単な概要
4週令のSPFホワイトレグホンニワトリの群(群当たりn=10)に、表2に示す製剤の一つにより右下肢筋に1回、筋肉内注射でワクチン接種した。血液試料は、ワクチン接種一日前(T=0)に無作為に選びとった20羽の動物から、およびワクチン接種後のT=4およびT=6週間目に全群の全動物から採取した。血清は、抗NDV、抗IBVおよび抗TRT抗体力価を測定するために使用した。
2.2.1 試験物質
2.2.1.1 抗原(不活化):NDVクローン30:ワクチン総用量は、NDV‐感染卵/W/O型エマルジョンの8.06%w/v尿膜腔液を含む。
X4‐Pent‐PDE型TLRリガンドの予備希釈液を新たに作成し、ワクチン0.5ml当たり1μgまたは10μgの用量となるように、終濃度2.5%v/vまでワクチンに添加した。TLRリガンドの添加後にワクチンをミニ‐ボルテックスを使用して激しく混合した。
各々の群由来の動物は、4周齢のときにワクチン0.5mlを用いて右下肢筋に筋肉内注射で接種した。
血清学用の血液試料は、ワクチン接種前(T=0)に無作為に選びとられた動物20羽からおよび一次接種後T=4週間目に全動物から採取した。
2.5.1 NDVのHI‐アッセイ
NDV特異抗体の血清レベルは、赤血球凝集抑制(HI)アッセイによって測定した。血清の2段階希釈液をマイクロタイタープレート中で調製し、それからNDV抗原50μl中に8赤血球凝集素単位を含む等容量と混合した。力価は、ニワトリの赤血球(緩衝食塩水中1%(v/v))の血球凝集を完全に抑制する最高希釈倍数の逆数で表した。試料は、1:4以上の希釈倍数における赤血球凝集抑制に対して陽性とみなしたが、2の対数で示す。
IB特異抗体力価の血清レベルは、赤血球凝集抑制(HI)アッセイによって測定した。血清の2段階希釈液をマイクロタイタープレート中で調製し、それからIBV‐D274抗原50μl中に8〜16赤血球凝集素単位を含む等容量と混合した。力価は、ニワトリの赤血球(緩衝食塩水中1%(v/v))の血球凝集を完全に阻害する最高希釈倍数の逆数で表した。試料は、1:16以上の希釈倍数における赤血球凝集抑制に対して陽性とみなしたが、2の対数で示す。
TRT特異抗体の血清レベルは、標準ELISAによって測定した。手短に言えば、1:200希釈TRT抗原材料の100μlをマイクロタイタープレートに被覆した。血清は1:100および1:800に予備希釈し、それからマイクロタイタープレートに添加した。血清力価は、5以上の力価で陽性とみなしたが、2の対数で示す。
表2の結果より以下のことが直ちに結論し得る。
Claims (8)
- 配列番号:7,22,25,28,29,30,36,37,43,44,45,46,47,49,55,56,59,61,62,63,65,66,71,72,73,74,75,76,83,84,85,86,93,94,95,96,98,99,100,103,104,105,106,114,120,121,122,123及び136よりなる群から選択される配列を有する免疫賦活性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドまたはその薬学的に許容可能な塩。
- 当該オリゴデオキシヌクレオチドが担体またはハプテンに結合している請求項1に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
- 請求項1または2に記載のオリゴデオキシヌクレオチドを含むベクター。
- 免疫賦活性量の請求項1または2に記載のオリゴデオキシヌクレオチドおよび/または請求項3に記載のベクター、免疫学性量の抗原成分または抗原成分をコードする遺伝情報、ならびに薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とする、感染症の予防または防止用ワクチン。
- 前記抗原成分がその野生型形態において家禽に対し病原性であるウイルスまたは微生物であるかまたはそれに由来することを特徴とする請求項4に記載のワクチン。
- 前記ウイルスまたは微生物が、伝染性気管支炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病(ガンボロ病)、ニワトリ貧血ウイルス、トリレオウイルス、トリ呼吸器感染症病原菌、七面鳥鼻気管炎ウイルス、トリ伝染性コリザ病原菌(鼻感冒)、水痘ウイルス、ニワトリ脳脊髄炎ウイルス、産卵低下症候群ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、七面鳥ヘルペスウイルス、Eimeria種、トリ感染症病原菌(オルニソバクテリウム・ライノトラキア)、出血性敗血症菌(パスツレラ・ムルトシダ)、トリ病原菌(マイコプラズマ・シノビエ)、Salmonella種および大腸菌から成る群より選択されることを特徴とする請求項5に記載のワクチン。
- 薬剤としての使用のための請求項1又は2に記載の免疫賦活性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド。
- 家禽の感染予防における使用のための請求項1又は2に記載の免疫賦活性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド。
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