CN113194989B - 初免-强化免疫接种方案 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种免疫接种方法。具体地，本发明涉及一种用于保护目标动物免受由病毒引起的感染或疾病的初免‑强化免疫接种方案，其中所述免疫接种方案包括向所述目标动物施用包含所述病毒的活减毒形式的疫苗，然后向所述目标动物施用包含编码来自所述病毒的一种或多种抗原的RP的疫苗。

Description

初免-强化免疫接种方案
本发明涉及免疫接种领域；更具体地，本发明涉及一种用于保护目标动物免受由病毒引起的感染或疾病的免疫接种方法。
自文明开始以来，致病性病毒的感染及其导致的疾病就为人所知，其影响人类和动物，通常对健康和福祉产生严重影响。自1800年代以来，病毒感染已被主动免疫所对抗。这种免疫接种包括向目标动物施用减毒或灭活形式的病毒病原体。减毒病毒疫苗(又称为改良活疫苗)包含可复制但相对无害的病毒，所述病毒通过在目标动物中的复制诱导针对相应致病性形式病毒的保护性免疫应答。
由于大多数病毒的结构相对简单，因而使用其抗原谱中的单一抗原有时就足以产生保护性免疫应答。这种亚单位疫苗可以通过从病毒或其培养物中提取，或通过特定抗原的重组表达来制造。或者，病毒抗原可以通过作为载体的活重组载体微生物递送至目标动物并在其内部表达。病毒载体的实例是用于人类的腺病毒和用于鸡的火鸡疱疹病毒。
使用病毒载体疫苗的一个变化是使用复制子颗粒疫苗(RP；参见Lundstrom,2014,Vaccines,vol.6,p.2392-2415)。这些是病毒样颗粒，但包含有缺陷的病毒基因组，并且通常是异源基因。这些复制子颗粒包含包装在颗粒中的RNA(即，其被包裹起来)，以使得其能够进入目标动物宿主细胞并进行一轮病毒基因组扩增，但不能形成新的颗粒。复制子颗粒不会从受感染的细胞中繁殖，因为其缺乏必要的一个或多个结构蛋白编码序列。因此，与其他复制子疫苗(如裸RNA疫苗，或包含从DNA质粒启动的RNA的疫苗)相比，其更类似于野生型病毒(Hikke,2017,Anu.Rev.Anim.Biosci.2017,5；10.1-10.21)。RP的基因组通常表达编码免疫保护抗原的异源基因。多种RNA病毒已被用于生产RP，如正链黄病毒科、小核糖核酸病毒科和动脉炎病毒科成员，或负链RNA病毒，如布尼亚病毒、副粘病毒和弹状病毒。使用最广泛和研究最广泛的是甲病毒RNA复制子颗粒(Vander Veen等，2012,Anim.Health.Res.Rev.,vol.13,p.1-9；和Kamrud等，2010,J.Gen.Virol.,vol.91,p.1723-1727)，因此这是优选其的实际原因。此外，据信甲病毒RP是比本领域公知的以及基于其他病毒(如布尼亚病毒)的其他RP更强的免疫增强剂。有几个甲病毒物种已用于开发RP疫苗，例如：委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)(Pushko等，1997,Virology,vol.239,p.389-401)、辛德毕斯病毒(Bredenbeek等，1993,J.of Virol.,vol.67,p.6439-6446)和塞姆利基森林病毒(Liljestrom&Garoff,1991,Biotechnology(NY),vol.9,p.1356-1361)。
RP疫苗可以在免疫接种目标动物后引发粘膜和全身免疫应答(Davis等，2002,IUBMB Life,vol.53,p.209-211)。RP疫苗(基于VEE的)也是几种USDA许可疫苗的基础，包括：猪流行性腹泻疫苗，RNA(产品代码19U5.P1)、猪流感疫苗，RNA(产品代码19A5.D0)、禽流感疫苗，RNA(产品代码19O5.D0)和处方产品，RNA颗粒(产品代码9PP0.00)。另外：Wang等，2018,Vaccine,vol.36,p.683-690。
对于灭活疫苗和亚单位疫苗，通常使用免疫刺激剂以获得最佳有效性。作为赋形剂，这种佐剂需要药学上可接受且具有成本效益。众所周知的佐剂是铝盐和油。油佐剂可以是矿物油或非矿物油来源，其中矿物油通常只允许用于兽医用途。
在兽医实践中，通常对牲畜或伴侣动物进行免疫接种。在畜牧业中，经营经济性是一个重要的问题，因为其通常是一种高体量低边际的经营。因此，畜牧业免疫接种需要有效且负担得起。因而，针对获得强免疫保护所需的免疫接种数量和获得的保护范围考虑有效性。最后一个方面与病毒疫苗尤其相关，因为病毒能够迅速变异并作为新的变体出现。结果是，成熟的病毒疫苗产品可能会随着时间的推移而丧失有效性。
因此，在有效性和保护范围方面优化病毒免疫接种是动物免疫接种领域的一个持续关注的问题。
众所周知，提高免疫接种有效性的做法是多次接种疫苗。在这种重复接种的情况下，通常将第一次施用称为：初免免疫接种，并将随后的一次或多次免疫接种称为：一次或多次强化免疫接种。在这种初免-强化免疫接种方案中，可以使用相同疫苗产品进行两次或多次施用，在这种情况下，将该方案称为同源初免-强化方案。例如，包含减毒活病毒的疫苗或包含灭活病毒的疫苗的两次或多次施用。或者，可以使用旨在预防相同病原体或疾病的不同疫苗产品进行免疫接种。在那种情况下，这是异源初免-强化免疫接种方案。综述是：Kardani等，2016(Vaccine,vol.34,p.413-423)，其中描述了大多数异源初免-强化免疫接种方案采用使用包含减毒活病毒形式的疫苗的初免免疫接种与一段时间后使用包含灭活病毒的疫苗的一次或多次强化免疫的组合。
猪流行性腹泻病毒(PEDV)是一种冠状病毒，于1971年首次在英国饲养猪和育肥猪中观察到；这些是像CV777这样的“经典”毒株。后来，2010年亚洲出现了引起高死亡率的高毒力PEDV毒株的爆发，目前PEDV是给亚洲养猪业造成巨大经济损失的主要病原体之一。在2013年4月在美国发现了一种类似亚洲的PEDV毒株，并且已传播到加拿大和南美洲。
在猪中，疾病的严重程度是可变的，其取决于猪群的流行病学状况。特别是乳猪非常易感，其通常表现出水样腹泻、脱水和代谢性酸重度，死亡率很高。另一个方面，饲养猪和生长猪表现出腹泻、厌食和抑郁，发病率高，但死亡率低。
已经描述了针对PEDV的疫苗，其也用于活疫苗+灭活疫苗免疫接种的异源初免+强化免疫接种方案，参见WO 2016/007576和WO 2016/007955。然而，2x灭活PEDV疫苗的同源初免-强化方案被描述为非常有效：Paudel等，2014(Vet.Quart.,vol.34,p.194-200)。
猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)是一种动脉炎病毒，于1987年首次报道，并在1990年代初期成为流行病。由于生殖障碍和生长迟缓，因而该病毒在养猪业中造成重大损失。PRRSV在多因素猪呼吸道疾病的发生中起重要作用。临床症状是流产和死产或木乃伊胎儿，以及耳朵和外阴紫绀。在新生猪和断奶猪中，该病毒会引起呼吸窘迫，增加继发性呼吸道感染的易感性。然而，亚临床感染也很常见。该病毒的变异也很大：所描述的种有两个不同变体：基因型1(此前称为欧洲)和基因型2(此前称为北美)，这两个基因型内的毒株差异很大。
已描述了基于灭活病毒的PRRSV疫苗并且其可商购获得。然而，认为基于减毒活病毒的疫苗更有效。实例是：PorcilisTMPRRS(MSD Animal Health)、Ingelvac PRRSTMMLV(Boehringer Ingelheim)和FosteraTMPRRS(Zoetis)。
本发明的一个目的是克服现有技术中的缺陷，并通过提供一种免疫接种方案来适应本领域的需求，所述免疫接种方案能够提高疫苗针对由病毒病原体引起的感染或疾病的免疫保护。
令人吃惊的发现，可以通过应用包含减毒活病毒形式的疫苗和包含编码异源病毒抗原的RP的疫苗的异源初免-强化免疫接种方案来实现该目的，从而克服现有技术的一个或多个缺陷。当将这两种疫苗以特定顺序施用于目标动物时，发现目标动物中产生的免疫应答相对于来自任一单独疫苗的应答具有改善的强度和/或广度。
值得注意的是，当这些疫苗以相反的顺序给予时，或者甚至当两种疫苗中的任何一种在同源初免-强化方案中重复给予时，都没有观察到这种改善。
目前尚不清楚这种疫苗类型的选择，以及其在这种联合方案中的施用，以及这种特定的顺序，如何或为什么会导致这种改善。尽管发明人不想受任何可能解释这些发现的理论或模型的束缚，但是其推测观察到的免疫应答高度和/或广度增加形式的改善可能是由于用减毒活病毒进行初免免疫接种能够启动完整或至少精巧的免疫应答套件，包括例如先天性免疫应答，因此用RP进行强化免疫接种的应答更好(免疫系统已充分被初免)，甚至能够基于为了使这种免疫接种安全在活疫苗中禁用的那些基因进行免疫接种。由于RP的感染性较低/免疫增强性较低，因而使用RP疫苗进行初免通常只会产生中等强度的免疫应答。因此，目前的方案提供了一个优势，即使用相对安全(但可能不那么有效)的活疫苗充分启动良好的免疫应答，同时针对出于安全性原因在活疫苗中不存在的那些基因(即，相应的蛋白)和/或任何其他基因产生良好的免疫应答。这意味着目前的方案据信针对那些似乎需要活疫苗来充分刺激免疫系统，但是通过对自身使用(安全的)活疫苗(作为一针或多针疫苗)并不能达到针对该病原体的最佳可能保护程度的病原体是特别有利的。此类病原体的实例可以是例如猪病原体PRRSv、PEDV、ASF(非洲猪瘟)。
对免疫应答的这种改进的发现可以以多种方式有利地使用：它可以例如增加来自用包含减毒活病毒形式的疫苗接种的免疫应答的强度或起始。或者，其可以增加包含RP(比如例如基于甲病毒RNA的复制子颗粒)的疫苗的免疫应答的广度。对于这两种情况，这甚至适用于任何一种单一疫苗的重复施用。
此外，通过施用编码来自在初免免疫接种中使用的病毒物种变体的一种或多种抗原的RP作为强化免疫接种，其可以用于扩大使用包含减毒活病毒形式的疫苗或使用包含RP的疫苗的免疫接种的免疫应答。此外，在强化免疫接种中可以使用一种以上类型的RP。这能够有助于提供更广泛的免疫保护，也能够对抗病毒的变体。此外，这能够有助于保持对包含减毒活病毒的许可疫苗的保护，即使目前在田野中的致病性病毒已经发生了突变，否则会导致其逃避包含减毒活病毒的疫苗的免疫应答。
另一个优点是其能够相当快地产生RP疫苗，这增加了根据本发明的免疫接种方法设计的灵活性。
所有这些都是对免疫接种领域非常有益的有利用途，通过本发明使其成为了可能。
这一点从现有技术的任何公开内容中都不是显而易见的，因为最近才描述了包含RP的疫苗，因而还没有采用目前主张的免疫接种方案的异源初免-强化免疫接种方案被公开。因此，没有任何迹象预期通过应用根据本发明的免疫接种方法能够出现免疫应答的这种改善。这样，本发明人没有给出建议，以选择这些特定的疫苗类型；或者以将这些疫苗类型应用到初免-强化方案中；或者以这种特定顺序在此类免疫接种方案中应用这些疫苗类型。
因此，在一个方面中，本发明涉及一种用于保护目标动物免受由病毒引起的感染或疾病的免疫接种方法，其中所述方法包括：
-向所述目标动物施用包含所述病毒的活减毒形式的疫苗，然后
-向所述目标动物施用包含编码来自所述病毒的一种或多种抗原的复制子颗粒(RP)的疫苗。
“免疫接种方法”指针对特定病原体(此处：特定种的病毒)进行预定免疫接种的程序，如初免-强化免疫接种方案。
因此，术语“初免(prime)”和“强化(boost)”，也称为“初免(priming)”和“强化(booster)”或“强化(boosting)”，可以用于指在根据本发明的免疫接种方法中应用的免疫接种，其中初免(prime或priming)是针对病毒对目标动物较早的免疫接种，以及强化(boost，booster，或boosting)是针对该病毒随后进行的免疫接种。初免和强化免疫接种均可以进行一次或多次。
根据本发明的免疫接种方法的免疫接种在时间上被一段足以让目标动物的免疫系统启动对初免免疫接种产生应答的时间所间隔。该时间段可以变化很大，例如，从约1周到很多年。这是由正在免疫接种的病毒和/或其疾病的特征所决定的。而且，该间隔取决于目标动物的特征，如目标动物的预期寿命。
本发明的“目标动物”指人或非人动物。目标动物可能需要或受益于针对由免疫接种方法旨在预防的病毒引起的感染或疾病的免疫接种。
要接种的目标动物的年龄、体重、性别、免疫状态和其他参数并不重要，尽管接种健康的目标动物并尽可能早地接种疫苗显然是有利的。
通过根据本发明的免疫接种方法，目标动物可以在其生命周期的一个或多个不同阶段受到保护，例如，作为通过保护性初乳的哺乳新生儿、作为生命最初阶段的婴儿、作为为屠宰而饲养或育肥的正在生长的动物、作为可以为哺乳的后代提供初乳的妊娠母体、作为免疫系统强度减弱的老年目标动物等。
如本文所用，术语“包含(comprises)”(以及诸如“包含(comprise)”、“包含(comprising)”和“包含(comprised)”之类的变体)指所有要素，以及本发明可以想到的任何可能的组合，其被使用该术语的文本部分、段落、权利要求等覆盖或包含，即使这些元素或组合是没有明确叙述的；并且并不指排除任何此类要素或组合。因此，任何此类文本部分、段落、权利要求等也可以涉及一个或多个实施方式，其中术语“包含”(或其变体)被诸如“由……组成(consist of)”、“由……组成(consisting of)”或“基本上由……组成”的术语代替。
可以使用任何可行的方法和途径将根据本发明的免疫接种方法的疫苗“施用”给目标动物。通常，最佳施用方法将取决于所应用疫苗的类型、目标动物的特征以及其旨在预防的病毒性疾病。例如：由于包含减毒活病毒的疫苗包含复制抗原，因而可以使用大量施用的方法例如通过饮用水或喷雾施用来施用。或者，对于包含减毒活病毒形式的疫苗和包含RP的疫苗而言，胃肠外、粘膜、局部或肠内施用的几种途径是可行的。所有这些是本领域熟知的，参见例如，“兽医疫苗学”(P.Pastoret等编著，1997,Elsevier,Amsterdam,ISBN0444819681)。
“疫苗”是众所周知的组合物，其具有医疗作用并且包含免疫活性组分和药学上可接受的载体。载体可以是液体或(颗粒)固体。相应疫苗中本发明的“免疫活性组分”是减毒活病毒或编码病毒抗原的RP。疫苗刺激目标动物的免疫系统，并诱导免疫应答。应答可能来源于目标动物的先天免疫系统和/或后天免疫系统，并且可能是细胞和/或体液类型的。
根据本发明的免疫接种方法中的疫苗通过降低接种的目标动物中本发明的病毒随后感染的严重性来提供“保护(protection)”或“保护(protecting)”、“抵抗感染或疾病”。例如，通过减少目标动物中病毒复制的数量或持续时间，或缩短或减少由感染引起的损伤的数量、强度或严重程度。此外，或因此，免疫接种方法可有效减少或改善可能由此类感染或复制或目标动物对该感染或复制的应答引起的疾病的(临床)症状。类似地，免疫接种方法通过母源抗体提供的被动免疫，例如通过食用初乳或吸收卵黄，为免疫接种的目标动物的子代提供保护。
可以确定疫苗的有效性，例如，通过监测免疫接种和攻击感染后的免疫应答，例如，通过监测目标动物的疾病体征、临床评分或重新分离病毒病原体，并包括将这些结果与在模拟接种的目标动物中观察到的免疫接种攻击应答进行比较。
对于根据本发明的免疫接种方法中的疫苗，免疫活性组分的剂量或量可以以众所周知的方式确定，例如：可以对减毒活病毒或RP进行滴定，例如，在动物中、在受精卵中或在培养的适宜宿主细胞中。然后，以例如每毫升疫苗的空斑形成单位(pfu)、TCID50或EID50，或者RP/ml的数量表示结果。或者，可以通过血清学或生物化学检测如ELISA或AlphaLisaTM对抗原进行定量，并以与适宜参照标准进行比较的相对单位表示。所有这些是本领域众所周知的。
可以将根据本发明的免疫接种方法用作预防性治疗、后预防性治疗或治疗性治疗。
本发明的“病毒”是指本发明的某个病毒物种。通常，病毒物种的确定和分类特征是参照表型特征的组合(如形态、核酸类型、复制方式、宿主生物体)以及通过病毒可能引起的疾病类型确定的。
在根据本发明的方法中使用的包含减毒活病毒形式的疫苗和包含RP的疫苗，两者均涉及本发明的病毒，因为活疫苗包含减毒形式的病毒物种，并且RP编码来自该病毒物种的至少一个抗原蛋白。
本领域技术人员将理解，本文中使用的分类学名称，如病毒的物种名称，是指微生物当前被指定在其中的分类学组。然而，分类学分类可能会随着时间的推移而改变，因为新的观点可能会导致重新分类为新的或不同的分类组。然而，由于这不会改变微生物本身或其抗原库，而只会改变其科学名称或分类，因而这种重新分类的微生物仍处于本发明的范围内。
本发明对于病毒物种的提及包括该物种内的任何病毒，包括在该病毒物种内的作为变体的任何病毒，例如，涉及该物种内的血清型、生物型、病理型或基因型的变体。例如，有关病毒和疾病的信息可以从手册中获得，如Fields Virology，第6版，ISBN:9781451105636，和"The Merck veterinary manual"，第10版，2010,C.M.Kahn编著，ISBN:091191093X。
可以通过多种方法获得某个病毒物种的活减毒形式：对于很多人类或动物病毒性疾病，此类病毒的活减毒形式已经是可用的。无论是在人类医学领域还是在兽医领域，获得许可的减毒活病毒疫苗的实例不胜枚举。这些可用于根据本发明的免疫接种方法中。本领域技术人员不仅能够评估包含活减毒形式病毒的疫苗是否以及如何可以并入根据本发明的免疫接种方法中，而且能够在适当时进行任何常规修改或优化。参见P.Pastoret等，同上。
或者，某个病毒物种的致病性或减毒形式的病毒可以从多种来源获得，例如，作为来自野外或农场中的生物体，或来自各种实验室、(保藏)机构或(兽医)大学的现场分离物。如果没有减毒形式的病毒可用，则可以对该病毒的致病形式进行减毒方法，如通过体内或体外传代，或通过体外技术，如化学或物理诱变，或通过使用重组DNA技术。然后，可以在体外和体内评估减毒水平。所有这些是本领域众所周知的。
众所周知，“甲病毒RNA复制子颗粒(RP)”是单周期感染性甲病毒结构，由于在其基因组中缺少结构蛋白，因而存在复制缺陷。该基因组可以编码来自其26S亚基因组启动子的异源基因。RP可以进行单轮复制，通过这种方式向目标动物的免疫系统递送和表达异源抗原。
对于本发明，RP编码的基因相对于复制子结构所源自的亲本病毒的物种通常是异源的(即，非天然的)基因。
编码某个病毒物种的异源病毒基因的RP可能已经是可用的，如市售的甲病毒RNARP疫苗。或者，其可以使用众所周知的技术通过将编码免疫保护性抗原的异源核酸整合到(例如，来自TC-83VEE甲病毒的)病毒复制子骨架中来产生。然后，可以从(26S-甲病毒)亚基因组启动子表达一个或多个病毒抗原基因，并且可以通过包装细胞系表达结构蛋白，或通过将复制子RNA和编码结构蛋白的一个或多个“辅助”RNA共转染到适宜宿主细胞中将转录的复制子RNA包装成RP。在US 9,441,247和US 8,460,913中描述了VEE TC-83RNA复制子颗粒的产生。例如，在标准教科书中详细解释了涉及克隆、转染、重组、选择和扩增的一般分子生物学技术，如Sambrook&Russell:“Molecular cloning:a laboratory manual”(2001,Cold Spring Harbour Laboratory Press；ISBN:0879695773)；Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology(J.Wiley and Sons Inc.,NY,2003,ISBN:047150338X)；C.Dieffenbach&G.Dveksler:“PCR primers:a laboratory manual”(CSHLPress,ISBN 0879696540)；和“PCR protocols”，J.Bartlett和D.Stirling(Humana press,ISBN:0896036421)。
包含RP的疫苗可以是针对所选病毒物种的现有疫苗。或者，可以使用众所周知的技术从现有的或新制备的RP开发此类RP疫苗。
本发明的RP是“编码来自”本发明病毒物种的一种或多种抗原的。这可以通过不同方式实现。例如，此类RP能够编码多顺反子阅读框，或者能够编码单独的基因，例如，通过使用亚基因组启动子的一个或多个额外的拷贝，以使得表达一个或多个单独的其他蛋白。
或者或另外地，包含用于本发明的RP的疫苗可以包含一种以上类型的RP，例如，每种编码一个或多个异源抗原。
由用于本发明的RP编码的一个或多个异源抗原“来自”本发明的病毒物种，其中术语“来自”用于指示编码来源于该物种的病毒的所述抗原的核酸。核酸可以从病毒样品或其一部分获得，或者可以基于来自该病毒的序列信息合成。随后，编码核酸序列可能已被基因操纵，以导致表达的蛋白抗原的氨基酸序列的修饰、截短和/或延伸。
下面将描述本发明实施方式和其他方面的细节。
根据本发明的免疫接种方法在兽医实践中是特别有用的，因为其组分的成本价格相对较低、易于使用以及其能够诱导增强的和/或广泛的免疫应答。
因此，在根据本发明的免疫接种方法的一个实施方式中，目标动物是与兽医相关的(非人)动物。优选地，兽医相关的动物是选自以下的动物：牛、猪、山羊、绵羊、鹿、犬、猫、马和禽类。更优选地，动物选自牛、猪、绵羊、犬、猫、马和禽类。甚至更优选地，动物选自猪、犬、猫和禽类。另外甚至更优选地，动物选自猪和禽类。最优选地，动物是猪。
在根据本发明的免疫接种方法的一个实施方式中，病毒是一种与兽医实践相关的病毒。优选地，病毒是动物病原体。更优选地，病毒是选自以下的动物的病原体：牛、猪、山羊、绵羊、鹿、犬、猫、马和禽类。更优选地，病毒是选自以下的动物的病原体：牛、猪、绵羊、犬、猫、马和禽类。甚至更优选地，病毒是选自以下的动物的病原体：猪、犬、猫和禽类。另外甚至更优选地，病毒是选自以下的动物的病原体：猪和禽类。最优选地，病毒是猪病原体。
对于本发明，“猪”指猪科动物，并且优选地，指猪属动物，例如：野生猪或家猪、野猪(wild boar)、野猪(babirusa)或疣猪。这也包括以任何名称表示其性别、年龄或体型的猪，如：母猪、公猪、阉猪、后备母猪、断奶仔猪、育肥仔猪(fattener)、育肥仔猪(feeder)或(哺乳)仔猪。
在根据本发明的免疫接种方法的一个实施方式中，其中目标动物是猪，猪优选地选自母猪、哺乳仔猪、育肥猪(finisher pig)、育肥猪(feeder pig)和育肥猪(fattenerpig)。
在根据本发明的免疫接种方法的一个实施方式中，其中病毒是猪病原体，病毒优选地选自：猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒、经典猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、猪流感病毒、猪呼吸道冠状病毒、口蹄疫病毒、传染性胃肠炎病毒、猪巨细胞病毒、猪轮状病毒、猪痘病毒和水疱性口炎病毒。
在根据本发明的免疫接种方法的一个实施方式中，其中病毒是猪病原体，病毒优选地是巢病毒目中的一个种。更优选地，病毒是动脉炎病毒科或冠状病毒科中的一个种。甚至更优选地，病毒是PEDV或PRRSV种。
在根据本发明的免疫接种方法的一个实施方式中，病毒是PEDV，且RP编码PEDV刺突蛋白。
在根据本发明的免疫接种方法的一个实施方式中，病毒是PRRSV，且RP编码PRRSVGP5蛋白(糖蛋白5，也称为：主包膜蛋白，或ORF 5蛋白)。
在根据本发明的免疫接种方法的一个实施方式中，其中病毒是PEDV，目标动物是妊娠母猪。
在根据本发明的免疫接种方法的一个实施方式中，其中病毒是PRRSV，目标动物是猪；猪可以是从出生之日起的任何年龄。猪可以是妊娠母猪。
对于根据本发明的免疫接种方法，免疫接种的方法与疫苗和目标动物的特征相适应。
因此，在根据本发明的免疫接种方法的一个实施方式中，包含病毒的活减毒形式的疫苗是通过粘膜途径施用的。优选地，粘膜施用是通过饮用水、喷雾剂、滴眼剂、鼻内或口服途径。
在根据本发明的免疫接种方法的一个实施方式中，其中病毒是PRRSV，包含PRRSV的活减毒形式的疫苗优选地通过胃肠外途径施用；更优选地，通过肌内、皮内或皮下途径施用。
在根据本发明的免疫接种方法的一个实施方式中，包含RP的疫苗通过胃肠外途径、通过注射至或通过皮肤施用。优选地，胃肠外施用是肌内、静脉内、腹膜内、皮内、粘膜下或皮下。更优选地，胃肠外施用途径是通过肌内、皮内或皮下途径。
根据本发明的免疫接种方法的时间表优选整合到目标动物可能需要的其他疫苗的现有免疫接种时间表中，以减少目标动物的应激并降低劳动力成本。这些其他疫苗可以以与其注射用途相容的方式以同时(simultaneous)、并行(concurrent)或顺序的方式施用。
用于根据本发明的免疫接种方法的一次或多次初免和强化免疫接种以免疫学有效且目标动物可接受的剂量和体积施用。
每只目标动物施用的活减毒病毒的剂量优选地在10至1x10^8个感染性病毒之间；这可以用pfu、TCID50或EID50来测量，具体取决于哪种方法对于特定病毒物种是最适合的。
每只目标动物施用的RP的剂量优选地在1x10^2至1x10^12个RP之间。这些可以用TCID50或RP/ml来测量。
每次目标动物施用所施用的免疫接种体积在0.01至10ml之间。
所有这些均是本领域众所周知的。
对于本发明，引用的范围还包括所述的终点。
如所示的，当使用编码来自作为用于初免免疫接种的活减毒病毒物种中的变体的病毒的抗原的RP强化免疫接种时，根据本发明的免疫接种方法是特别有利的，因为这拓宽了目标动物的免疫应答。
因此，在根据本发明的免疫接种方法的一个实施方式中，由RP编码的至少一种病毒抗原来自作为减毒活病毒物种内的变体的病毒。
对于本发明，术语“变体”是相对于根据本发明的免疫接种方法旨在针对其保护的病毒物种而使用的。因此，这种变体是与以减毒形式用于初免免疫接种的病毒同种的病毒，但其不是相同的病毒。在这一背景下，“不相同”可以指微小的差异，例如，当变体病毒是来自不同毒株或分离物时，或者其可以指更显著的差异，例如，当变体病毒在其血清型、生物型、病理型和/或基因型方面不同时。这种差异也可能是由RP编码的一种或多种异源基因的遗传操纵导致的。
如上所述，在这方面非常有利的还有在RP强化疫苗中使用不同类型的RP，如使用编码一种以上本发明的病毒物种的抗原的RP，或者使用一种以上类型的RP，例如，每种编码本发明的病毒的不同抗原，或编码相同抗原但来自病毒的不同变体；或者甚至每种都编码多种异源抗原。
因此，在根据本发明的免疫接种方法的一个实施方式中，包含RP的疫苗包含编码本发明病毒物种的一种以上抗原的RP。
在根据本发明的免疫接种方法的一个实施方式中，包含RP的疫苗包含编码来自本发明病毒物种的一种或多种抗原的至少一种另外的RP。优选地，不同RP编码本发明病毒物种的不同抗原。或者或另外地，RP编码相同抗原，但是来自本发明病毒物种中的变体。
在根据本发明的免疫接种方法的一个实施方式中，一种或两种疫苗均包含其他免疫刺激化合物。
优选地，其他免疫刺激化合物选自细胞因子、包含未甲基化CpG的免疫刺激核酸和佐剂。
此类免疫刺激分子是本领域众所周知的。
在根据本发明的免疫接种方法的一个实施方式中，包含未甲基化CpG的免疫刺激核酸是选自以下的一种或多种：WO 2012/089.800(X4家族)、WO 2012/160.183(X43家族)和WO 2012/160.184(X23家族)。
在根据本发明的免疫接种方法的一个实施方式中，一种或两种疫苗均包含佐剂。优选地，佐剂是油佐剂。
在一个优选的实施方式中，一种或两种疫苗均包含矿物油佐剂。
在一个替代的优选实施方式中，一种或两种疫苗均包含非矿物油佐剂。
对于本发明，“矿物油”表示相应的油来自矿物来源，通常来自石油；“非矿物油”是合成、半合成、动物或植物来源的。
在根据本发明的免疫接种方法的一个实施方式中，包含RP的疫苗包含油佐剂，其中油佐剂包含矿物油和一种或多种非矿物油。更优选地，RP强化疫苗的油佐剂包含液体石蜡油和维生素E-醋酸酯。甚至更优选地，包含RP的疫苗包含XsolveTM佐剂。
在根据本发明的免疫接种方法的一个实施方式中，包含RP的疫苗包含油佐剂，其中油佐剂包含一种以上非矿物油。更优选地，RP强化疫苗的油佐剂包含角鲨烷和维生素E-醋酸酯。甚至更优选地，包含RP的疫苗包含SVEATM佐剂。
对于本发明：液体石蜡油是CAS号：8042-47-5；角鲨烷是CAS号：111-01-3；和维生素E醋酸酯是CAS号：58-95-7。在一个实施方式中，维生素E醋酸酯是dl-α-生育酚-醋酸酯。
在根据本发明的免疫接种方法的一个实施方式中，油佐剂与一种或两种疫苗一起配制为水和油的乳剂。优选地，乳剂是水包油乳剂。在一个替代的优选实施方式中，乳剂是油包水乳剂。
在根据本发明的免疫接种方法的一个实施方式中，其中包含RP的疫苗包含油佐剂，佐剂优选地在施用前不久与RP组合，例如，施用前1天、6小时、4小时或2小时内，以此优先顺序。
在根据本发明的免疫接种方法中，一种或两种疫苗均可以包含一种或多种其他赋形剂，其有助于例如在制剂中疫苗的稳定性或递送。实例是稳定剂、防腐剂和粘度调节剂。
在根据本发明的免疫接种方法的一个实施方式中，一种或两种疫苗均包含选自以下的其他赋形剂：稳定剂、防腐剂和粘度调节剂。
优选的稳定剂是选自葡聚糖、甘油、明胶、氨基酸、抗氧化剂和缓冲剂的一种或多种。
优选的防腐剂是选自硫柳汞、苯氧乙醇、甲醛和抗生素的一种或多种。
优选的粘度调节剂是选自聚乙烯吡咯烷酮和GantrezTM的一种或多种。
在根据本发明的免疫接种方法的一个实施方式中，包含病毒的活减毒形式的疫苗包含选自以下的粘度调节剂：聚乙烯吡咯烷酮和GantrezTM。
对于本发明，GantrezTM(Ashland,Covington,KY,USA)是乙烯基醚聚合物和共聚物家族。
在根据本发明的免疫接种方法的一个实施方式中，用包含病毒的活减毒形式的疫苗免疫接种之后，在1周至80年之间的时间段内用包含RP的疫苗免疫接种。
优选地，时间段是1周至3年之间、1周至2年之间、1周至1年之间、1周至6个月之间、1周至3个月之间、1周至2个月之间、1周至1个月之间、1周至4周之间、1周至3周之间或者甚至1周至2周之间，以此优先顺序。
优选地，时间段选自：2年、1年、6个月、4个月、3个月、2个月、1个月、4周、3周、2周和1周。
在根据本发明的免疫接种方法的一个优选的实施方式中，用包含病毒的活减毒形式的疫苗免疫接种之后，在至少一周的时间段内用包含RP的疫苗免疫接种。更优选地，在选自以下的时间段内：至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少1年和至少2年。
在根据本发明的免疫接种方法的一个实施方式中，RP疫苗所基于的病毒是甲病毒，并且优选地，物种是VEEV。
优选地，VEEV来自毒株TC-83。
在根据本发明的免疫接种方法的一个实施方式中，一个或多个条件应用，选自以下：
-目标动物是与兽医相关的动物。优选地，兽医相关的动物选自牛、猪、山羊、绵羊、鹿、犬、猫、马和禽类。更优选地，动物选自牛、猪、绵羊、猫、犬、马和禽类。甚至更优选地，动物选自猪、犬、猫和禽类。另外甚至更优选地，动物选自猪和禽类。最优选地，动物是猪；
-病毒是与兽医实践相关的病毒。优选地，病毒是动物病原体。更优选地，病毒是选自以下的动物病原体：牛、猪、山羊、绵羊、鹿、犬、猫、马和禽类。更优选地，病毒是选自以下的动物病原体：牛、猪、绵羊、犬、猫、马和禽类。甚至更优选地，病毒是选自以下的动物病原体：猪、犬、猫和禽类。另外甚至更优选地，病毒是选自以下的动物病原体：猪和禽类。最优选地，病毒是猪病原体；
-目标动物是猪，猪优选地选自母猪、哺乳仔猪、育肥猪(finisher pig)、育肥猪(feeder pig)和育肥猪(fattener pig)；
-病毒是猪病原体，病毒优选地选自：猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒、经典猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、猪流感病毒、猪呼吸道冠状病毒、口蹄疫病毒、传染性胃肠炎病毒、猪巨细胞病毒、猪轮状病毒、猪痘病毒和水疱性口炎病毒；
-病毒优选地是巢病毒目中的种。更优选地，病毒是动脉炎病毒科或冠状病毒科中的一个种。甚至更优选地，病毒是PEDV或PRRSV种；
-病毒是PEDV，且RP编码PEDV刺突蛋白；
-病毒是PRRSV，且RP编码一个或多个PRRSV糖蛋白，比如例如GP5蛋白；
-病毒是PEDV，目标动物是妊娠母猪；
-病毒是PRRSV，目标动物是猪；猪可以是从出生之日起的任何年龄。猪可以是妊娠母猪；
-粘膜施用是通过饮用水、喷雾剂、滴眼剂、鼻内或口服途径；
-病毒是PRRSV，包含PRRSV的活减毒形式的疫苗优选地通过胃肠外途径施用；更优选地，通过肌内、皮内或皮下途径施用；
-包含RP的疫苗通过胃肠外途径、通过注射至或通过皮肤施用。优选地，胃肠外施用是肌内、静脉内、腹膜内、皮内、粘膜下或皮下。更优选地，胃肠外施用途径是通过肌内、皮内或皮下途径；
-至少一种由RP编码的病毒抗原是来自一种病毒，该病毒是减毒活病毒物种中的变体；
-包含RP的疫苗包含编码本发明病毒物种的一种以上抗原的RP；
-包含RP的疫苗包含编码来自本发明病毒物种的一种或多种抗原的至少一种另外的RP。优选地，不同病毒RNA的RP编码本发明病毒物种的不同抗原。或者或另外地，RP编码相同抗原，但是来自本发明病毒物种中的变体；
-一种或两种疫苗均包含其他免疫刺激化合物。优选地，其他免疫刺激化合物选自细胞因子、包含未甲基化CpG的免疫刺激核酸和佐剂。优选地，包含未甲基化CpG的免疫刺激核酸是选自以下的一种或多种：WO 2012/089.800(X4家族)、WO 2012/160.183(X43家族)和WO 2012/160.184(X23家族)；
-一种或两种疫苗均包含佐剂。优选地，佐剂是油佐剂；
-一种或两种疫苗均包含矿物油佐剂。在一个替代的优选实施方式中，一种或两种疫苗均包含非矿物油佐剂；
-包含RP的疫苗包含油佐剂，其中油佐剂包含矿物油和一种或多种非矿物油。更优选地，RP强化疫苗的油佐剂包含液体石蜡油和维生素E-醋酸酯。甚至更优选地，包含RP的疫苗包含XsolveTM佐剂；
-包含RP的疫苗包含油佐剂，其中油佐剂包含一种以上非矿物油。更优选地，RP强化疫苗的油佐剂包含角鲨烷和维生素E-醋酸酯。甚至更优选地，包含RP的疫苗包含SVEATM佐剂；
-维生素E醋酸酯是dl-α-生育酚-醋酸酯；
-油佐剂与一种或两种疫苗一起配制为水和油的乳剂。优选地，乳剂是水包油乳剂。在一个替代的优选实施方式中，乳剂是油包水乳剂；
-佐剂在施用前不久与RP组合，例如，施用前1天、6小时、4小时或2小时内；
-一种或两种疫苗均包含选自以下的其他赋形剂：稳定剂、防腐剂和粘度调节剂。优选的稳定剂是选自葡聚糖、甘油、明胶、氨基酸、抗氧化剂和缓冲剂的一种或多种。优选的防腐剂是选自硫柳汞、苯氧乙醇、甲醛和抗生素的一种或多种。优选的粘度调节剂是选自聚乙烯吡咯烷酮和GantrezTM的一种或多种；
-包含病毒的活减毒形式的疫苗包含选自以下的粘度调节剂：聚乙烯吡咯烷酮和GantrezTM；
-用包含病毒的活减毒形式的疫苗免疫接种之后，在1周至80年之间的时间段内用包含RP的疫苗免疫接种。优选地，时间段是1周至3年之间、1周至2年之间、1周至1年之间、1周至6个月之间、1周至3个月之间、1周至2个月之间、1周至1个月之间、1周至4周之间、1周至3周之间或者甚至1周至2周之间，以此优先顺序。优选地，时间段选自：2年、1年、6个月、4个月、3个月、2个月、1个月、4周、3周、2周和1周；
-用包含病毒的活减毒形式的疫苗免疫接种之后，在至少一周的时间段内用包含RP的疫苗免疫接种。更优选地，在选自以下的时间段内：至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少1年和至少2年；和
-包含甲病毒RNA RP的疫苗的病毒物种是VEEV。优选地，VEEV来自毒株TC-83。
在根据本发明的免疫接种方法的一个实施方式中，目标动物是猪，病毒是PEDV，猪是妊娠母猪，包含病毒的活减毒形式的疫苗包含粘度调节剂，并且包含甲病毒RNA RP的疫苗的病毒是VEEV。
在根据本发明的免疫接种方法的一个实施方式中，目标动物是猪，病毒是PRRSV，包含甲病毒RNA RP的疫苗的病毒是VEEV，并且包含RP的疫苗包含油佐剂。
用于根据本发明的免疫接种的方法也可以用不同的形式来标书，例如，通过其所体现的免疫接种方案，或通过在该方法中使用的每种疫苗的医疗用途。
因此，在一个进一步的方面中，本发明涉及用于保护目标动物免受由病毒引起的感染或疾病的初免-强化免疫接种方案，其中所述免疫接种方案包括向所述目标动物施用包含所述病毒的活减毒形式的疫苗，随后向所述目标动物施用包含编码来自所述病毒的一种或多种抗原的RP的疫苗。
在一个进一步的方面中，本发明涉及一种包含病毒的活减毒形式的疫苗，其用于初免-强化免疫接种方案，以保护目标动物免受由所述病毒引起的感染或疾病，所述方案包括：
-使用包含病毒的活减毒形式的疫苗免疫接种，随后
-使用包含编码来自所述病毒的一种或多种抗原的RP的疫苗免疫接种。
在一个进一步的方面中，本发明涉及一种包含编码来自病毒的一种或多种抗原的RP的疫苗，其用于初免-强化免疫接种方案，以保护目标动物免受由所述病毒引起的感染或疾病，所述方案包括：
-使用包含所述病毒的活减毒形式的疫苗免疫接种，随后
-使用包含RP的疫苗免疫接种。
在一个进一步的方面中，本发明涉及病毒的活减毒形式用于制备用于保护目标动物免受由所述病毒引起的感染或疾病的疫苗中的用途，其中所述疫苗是以初免-强化免疫接种方案施用的，所述方案包括：
-施用包含病毒的活减毒形式的疫苗，随后
-施用包含编码来自所述病毒的一种或多种抗原的RP的疫苗。
并且在一个进一步的方面中，本发明涉及编码来自所述病毒的一种或多种抗原的RP在制备用于保护目标动物免受由所述病毒引起的感染或疾病的疫苗中的用途，其中所述疫苗是以初免-强化免疫接种方案施用的，所述方案包括：
-施用包含所述病毒的活减毒形式的疫苗，随后
-使用包含RP的疫苗。
在本发明这些进一步方面的优选实施方式中，这些进一步方面的一个或多个或所有特征例如初免-强化免疫接种方案、病毒、包含减毒活病毒的疫苗、包含RP的疫苗、初免接种和强化接种之间的时间间隔、保护、目标动物、感染、疾病和施用都如本文所述的任何一个或多个实施方式中所定义的。
对于本发明，用于根据本发明的制备用途的病毒的活减毒形式或RP以允许生产的疫苗的医学用途的方式进行。通常，这涉及使用药学上可接受的设备和成分，并遵循质量方面的法规(如药品生产质量管理规范标准)。这意味着生产过程的各个阶段都将通过适当的测试进行监控，例如，通过对抗原质量和数量进行免疫学测试；通过对无菌性进行微生物测试，以及没有外来物质；并最终通过在动物中的研究来确认疫苗的有效性和安全性。完成这些检测后，疫苗产品可以上市销售。
所有这些对于技术人员来说均是众所周知的，并且在下述中对适于疫苗制备的一般技术和考虑进行了描述，例如，政府法规，如欧洲药典9和21CFR，以及手册，如P.Pastoret等(同上)和“Remington:the science and practice of pharmacy”(2000,Lippincot,USA,ISBN:683306472)。
用于根据本发明的免疫接种方法的疫苗，包含病毒的活减毒形式的疫苗和包含RP的疫苗可以单独供应给市场，并且然后可以用于根据本发明的免疫接种方法中。或者，疫苗可以以组合形式提供，这有便于其在根据本发明的免疫接种方法中的应用。
因此，在一个进一步的方面中，本发明涉及一种试剂盒，其包含至少两个容器，其中至少一个容器包含如本发明所定义的包含病毒的活减毒形式的疫苗，和至少一个容器包含如本发明所定义的包含编码病毒抗原的RP的疫苗。
在本发明试剂盒的优选实施方式中，试剂盒的一个或多个或所有特征如在如本文所述的任何一个或多个实施方式中所定义的。
在一个优选的实施方式中，含有包含病毒的活减毒形式的疫苗的至少一个容器包含作为冻干物的所述疫苗，可以在施用前不久用稀释剂对其稀释。
在一个优选的实施方式中，含有包含RP的疫苗的至少一个容器包含作为冻干物的所述疫苗，可以在施用前不久用稀释剂对其稀释。
在一个替代实施方式中，含有包含RP的疫苗的至少一个容器包含在水溶液中的所述疫苗；水溶液优选地包含缓冲剂；和含有所述疫苗的水溶液优选地在使用前冷藏或冷冻。在一个实施方式中，含有所述疫苗的水溶液是重构的RP的溶液，其是使RP冻干物与适宜的水性稀释剂混合产生的。
在其中至少一个容器含有冻干物形式的包含RP的疫苗的实施方式中，根据本发明的试剂盒可以包含另一容器，该另一容器可以含有用于重构包含RP的冻干疫苗的适宜稀释剂。在一个优选的实施方式中，稀释剂是水溶液，优选地，包含缓冲剂和/或稳定剂和药学上可接受质量的水。
在一个替代的优选实施方式中，稀释剂是用于重构和辅助包含RP的疫苗的水包油乳剂。
在根据本发明的试剂盒的一个实施方式中，试剂盒包含使用该试剂盒和/或其组成部分的说明书。在优选的实施方式中，使用说明书在试剂盒的一个或多个组成部分上或随其一起提供；或者通过参考电子形式的说明书的形式提供，如可在试剂盒的生产厂商或分销商的互联网网站上查看或下载的信息。
在一个实施方式中，试剂盒是包含至少两个容器，并且包含使用说明书的盒子，使用说明书显示在包含在盒子上、与盒子一起或盒子内的信息载体(例如，卡片或宣传单)上。
在试剂盒的一个实施方式中，试剂盒还可以是用于根据本发明的免疫接种方法的组成部分(与商业销售相关)的邀约，例如，在互联网上。
技术人员完全可以进一步优化本发明的方法、疫苗、用途、方案和试剂盒。通常，这涉及对疫苗的有效性进行微调，以适应可能适用的特定条件。这可以通过调整疫苗的剂量、体积、抗原内容物或佐剂，或者通过调整施用途径或方法来实现。所有这些微调都可以使用本领域公知的常规方法和材料来完成。
在本发明的任何上述实施方式中，优选使用甲病毒RNA复制子颗粒。
现在将通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例
1.实施例1：同源初免-强化PRRSV免疫接种
现有的PRRSV活疫苗PRRS是基于PRRSV的欧洲分离株，DV毒株，基因型1PRRSV。当针对异源攻击毒株进行检测时，发现其有时缺乏有效性，这是所有减毒活PRRSV疫苗的共性问题。研究了不同方法以提高这种免疫接种的有效性，如同源初免-强化免疫接种方案。
在免疫接种攻击实验中，3组使用16头约5周龄的猪，在第一次免疫接种当天，其PRRSV抗体呈阴性。两组接受活减毒病毒Porcilis PRRS的免疫接种，接受一次或两次，间隔为两周。一组保持未免疫接种。在第一次免疫接种后，所有猪分别在免疫接种后4.5周接受使用PRRSV的最新德国基因型1分离株的攻击感染。攻击剂量为5.3Log10 TCID50病毒，每只动物2mL(每个鼻孔1mL)。在免疫接种当天和攻击后0、4、7、10、14和20天采集血液样品。根据PAM细胞上的cpe确定PRRSV病毒血症，均如下所述。
图1显示了3组的病毒血症结果。可以清楚地看出，使用减毒活PRRSV疫苗接种一次或两次疫苗的效果没有显著差异。
因此，对于PRRSV，使用同源初免-强化免疫接种方案不能改善单一免疫接种的免疫保护。
2.实施例2：PRRSV-初免-强化免疫接种，初始实验
2.1.简介
该实验应用根据本发明的免疫接种方法，在强化免疫接种中使用变体：所使用的活减毒病毒疫苗是PRRS，其是PRRSV 1型，DV毒株，和包含甲病毒RNA RP的疫苗，以及所使用的攻击病毒基于PRRSV 1型毒株Sc3。
所使用的甲病毒RNA RP基于VEEV毒株TC-83，并表达一种以上病毒抗原：制备一种类型的RP(此处为：RP1)，以编码PRRSV毒株Sc3基因：E、GP2、GP3和GP4，导致天然E-GP2-GP3-GP4四聚体的表达。制备另一种类型的RP(此处为：RP2)，以编码PRRSV毒株Sc3基因：GP5和M，导致天然GP5-M二聚体的表达。在每种情况下(RP1和RP2)，每个异源基因都处于其自己的亚基因组启动子序列的转录控制之下。在RP1中，存在四个独立的亚基因组启动子序列；在RP2中，存在两个亚基因组启动子序列。
2.2.研究设计
将40只抗PRRSV抗体血清阴性的仔猪分成4组，每组10只动物。当第1组至第3组仔猪约5周龄时，施用活减毒病毒疫苗PRRSV通过肌内(IM)注射途径对其进行初免免疫接种；将第4组动物作为未免疫接种对照动物。在初免免疫接种3周后，使用包含2型甲病毒RNA RP的疫苗对第2组和第3组进行强化免疫接种。在初免免疫接种后约4.5周(即，强化免疫接种后11天)，使用当前毒力基因型1毒株Sc-3通过鼻内途径对所有动物进行攻击。在初免免疫接种当天和此后7、15和23天，以及在攻击当天(＝第32天dpv)和此后4、7、11、17和21天收集血样。从这些样品分离血清，将攻击后获得的样品用于通过测量攻击毒株的病毒血症来确定不同免疫接种的疫苗有效性。
2.3.材料和方法
处理：
使用推荐的PRRS免疫接种途径，即肌内施用，针对包含甲病毒RNA RP的疫苗也使用该途径。对于攻击接种，使用自然感染途径鼻途径。采集血液样品以监测PRRSV感染的相关参数：病毒血症和血清学。
待测物：
攻击病毒为PRRSV毒株Sc-3，稀释至0.5x10^5.0TCID50/mL。
针对冷冻干燥PRRS疫苗的稀释剂为10mM PBS缓冲液。这在使用前不久应用，以获得0.5x10^5.0TCID50/mL的滴度。
在5-7天后，通过读取cpe对原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)进行滴定。
RP的稀释剂是XsolveTM50水包油乳剂，也在使用前不久应用，以针对包含甲病毒RNA RP1或RP2的每种疫苗均达到0.5x10^8.0TCID50/mL的滴度。
当RP被归类为GMO时，所有材料、样品和动物都需要在适当的生物防护水平的实验室中进行处理和保存。
待测动物：
标准仔猪，免疫接种当天约5周龄，混合性别，接种前PRRSV抗体呈阴性。仔猪在运输到检测实验室和免疫接种日之间适应5天。仅使用临床健康的猪；使用编号的耳标识别猪。在实验期间每天观察所有动物的一般健康状况。记录所有观察结果，并在需要时咨询负责的兽医。
所有免疫接种均以IM给予，2mL/动物，攻击以IN给予，2mL/动物。
表1：实施例2的实验提纲
取样
在初免免疫接种后(dpv)0、7、15和23天，以及攻击后(dpc)0(＝32dpv)、4、7、11、17和21天从颈静脉采集血样。最后的血样是在实验结束时的安乐死过程中采集的。将血液收集在不含抗凝剂的真空采血管中。使血液样品在室温下凝血1hr，然后在3000x g下离心10分钟，收集血清并在-20℃以下冷冻保存直至使用。
病毒血症检测
使用特异性针对PRRSV基因型1的引物对和iTaqTMUniversalGreen一步试剂盒(BioRad)，通过实时RT-qPCR，通过定量血清中的PRRSV RNA检测PRRSV的病毒血症(包含病毒的活减毒形式的疫苗和攻击病毒两者)
血清学
使用市售ELISA试剂盒，针对PRRSV的抗体对血清进行检测：IDEXXTMPRRS X3(IDEXXLaboratories,Westbrook,ME,USA)。在重组PRRSV抗原包被的微量滴定孔中孵育血清。然后，使用辣根过氧化物酶缀合的抗猪抗体和色原体检测结合的PRRSV特异性抗体。结果计算为样品与阳性(S/P)的比例。针对PRRSV特异性抗体，将S/P比例≥0.4的样品分类为阳性和将S/P比例<0.4的样品分类为阴性。
2.4.结果和结论
认为实验是有效的，因为免疫接种前所有血清样品均是PRRSV-Ab阴性的，且第4组的血清样品在攻击前均为PRRSV-Ab阴性。
病毒血症测定的结果如图2中所示，其代表了每组汇总的qPCR评分。
未免疫接种的猪(第4组)在其血清中显示出最高的PRRS病毒水平，这是符合预期的。亦如所预期的，在21dpv时使用两种甲病毒RNA RP的初免-强化免疫接种不会导致在血清中检测到PRRSV病毒血症水平(例如，参见第3组，图2)。
在接受包含甲病毒RNA RP1和RP2的初免和强化免疫接种的动物中(第3组)，观察到的病毒血症水平几乎与未接种疫苗的动物中可见的水平一样高。
很明显，使用包含甲病毒RNA RP的疫苗的同源初免-强化方案不能针对PRRSV提供足够的保护，即使其编码了攻击病毒的多种抗原。
活减毒疫苗(第1组)很好地减轻了病毒血症。然而，根据本发明的异源初免-强化免疫接种方案接受免疫接种的组(第2组)针对所有的攻击感染显示出最佳的保护作用；即，攻击后在血清样品中始终具有最低水平的可检测PRRSV。
3.实施例3：PRRSV-初免-强化免疫接种，扩展实验
3.1.简介
安排了进一步的实验，以重复和扩展在实施例2中所描述的实验中发现的显著结果。在该设置中，添加组以检测包含甲病毒RNA RP1或RP2的单独疫苗作为强化免疫接种的效果。另外添加一个组，以检测在根据本发明的免疫接种方法中以相反顺序的免疫接种。
3.2.研究设计
除了额外的测试组以外，在本实施例中的研究设计与在实施例2中基本相同。实施例3的实验提纲总结在表2中。在初免免疫接种后5周(即，在强化免疫接种后2周)，所有组接受使用PRRSV毒株Sc-3的攻击感染。
表2：实施例3的实验提纲
3.3.材料和方法
免疫接种和攻击与实施例2中应用的基本相同。关于时间，攻击是在初免免疫接种后5周时，而不是实施例2中的4.5周。添加两组，第3组和第4组，接受包含甲病毒RNA RP1或RP2的单一疫苗作为强化免疫接种。
3.4.结果和结论
结果见图3。比较结果的最佳时间点是攻击后4天时的病毒血症(以Ct值计)
根据免疫接种前抗PRRSV抗体的血清阴性，该检测也是有效的。此外，未免疫接种的第6组在攻击后的应答与预期一样。在接受减毒活病毒单次免疫接种的组(MLV：改良的活疫苗；第1组)和接受RP1(E-GP2-3-4)疫苗强化免疫接种的第4组检测到了与第6组相似的病毒血症。比未免疫接种的组略好一点的是第5组，该组接受根据本发明的免疫接种方法的免疫接种，但顺序相反。
然而，最好的是接受仅包含甲病毒RNA RP2单独或与RP1组合的疫苗作为强化剂的组。接受包含甲病毒RNA RP1和RP2的疫苗作为强化剂的第2组在攻击后病毒血症大大降低，但在接受包含活减毒的PRRSV的疫苗后接受包含甲病毒RNA RP2的疫苗作为强化剂免疫接种的第3组具有总体上最低的病毒血症。
第3组(根据本发明的免疫接种方法，使用RP2)和第5组(顺序相反)之间在攻击后4天时病毒血症的差异是约5个Cq点，这对应于2^5的病毒载量差异。因此，当应用正确的根据本发明的免疫接种方法时，攻击病毒的病毒血症可以减少32倍。
类似地，当考虑活减毒病毒的单一疫苗(第1组)和第3组(根据本发明的免疫接种方法)之间疫苗保护的改善时，检测到的病毒血症差异为8个Cq点，病毒血症减少256倍，这对于控制疾病和猪群中PRRSV的传播具有重要意义。
这也代表通过使用包含编码Sc3基因的甲病毒RNA RP的疫苗，将免疫保护从初免免疫接种的PRRSV DV毒株扩大到攻击病毒的PRRSV Sc3毒株。
4.实施例4：PEDV-初免-强化免疫接种实验
与针对PRRSV进行的实验一致，使用根据本发明的免疫接种方法进行类似实验以保护猪免受PEDV感染。
4.1.简介
在该实验中，使用根据本发明的免疫接种方法检测了妊娠母猪免疫接种的有效性，以保护其哺乳后的后代免受PEDV感染和疾病。对于包含活减毒病毒的疫苗，使用PEDV毒株S-INDEL Iowa 106。这是两种新出现的PEDV毒株之一(Lin等，2016,Virus Res.,vol.226,p.20-39)。甲病毒RNA RP的疫苗包含编码强毒力PEDV美国分离株的刺突蛋白的RP，该毒株是非-S-INDEL毒株。
4.2.研究设计
将14只妊娠母猪随机分成4个治疗组，包括3个免疫接种组和一个非免疫接种对照组(第4组)。所有免疫接种的母猪(第1-3组)在分娩前6、3和1周接受三次免疫接种。用于第2组和第3组母猪第一次和第二次免疫接种的疫苗是包含PEDV毒株S-INDEL Iowa 106的活减毒病毒的疫苗，将其与两种不同粘膜粘附剂的一种混合。第1组中的母猪接受用编码PEDV非-S-INDEL毒株的刺突基因的RP疫苗的两次初免免疫接种。在第3次免疫接种时，在第1-3组中的所有母猪接受使用编码PEDV刺突基因的甲病毒RNA RP的疫苗的强化免疫接种。表3中给出了实验组的概述。
使用强毒力PEDV毒株胃肠内攻击从不同母猪组出生的哺乳仔猪。通过疫苗降低仔猪死亡率和维持仔猪体重增加的能力来衡量疫苗的有效性。还评估了仔猪对PEDV特异性、母源性抗体(MDA)的免疫应答。
表3：实施例4的实验提纲
4.3.材料和方法
待测物：
甲病毒RNA RP的疫苗：
包含甲病毒RNA RP的疫苗基于来自VEEV毒株TC-83的复制子构建体。其被构建为包含美国强毒力PEDV毒株AH2012的刺突蛋白的编码序列(参见GenBank登录号KC210145)。将其配制成10^8RP/mL，针对1mL剂量，无佐剂，用于IM免疫接种。
RP在96孔板中的Vero细胞单层培养物上以10倍连续稀释进行滴定。将板在37℃下孵育18-24hr。接下来，洗板、固定并使用一抗染色，随后用缀合的二抗染色。使用荧光显微镜检查细胞。对单个抗原阳性细胞进行计数。滴度以RP/mL表示，由已知稀释和接种体积计算，并在重复孔之间取平均值。
减毒活疫苗：
第2组疫苗：
在口服接种不久之前，将每剂10^6TCID50的PEDV S-INDEL Iowa 106(第36代)与GantrezTM(1:1v/v比例)、5％蔗糖和20mM HEPES pH 7.3混合。
第3组疫苗：
在口服接种不久之前，将每剂10^6TCID50的PEDV S-INDEL Iowa 106(第36代)与聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(1:1v/v比率)、5％蔗糖和20mM HEPES pH 7.3混合。
在具有汇合的Vero细胞的96孔板上滴定PEDV S-INDEL Iowa 106病毒。将板在37℃和5％CO2下孵育，每天观察感染后的细胞病变效应，持续2-3天，和/或在孵育期结束时，使用利用猪抗PEDV特异性抗体(USDA-NVSL,Ames,IA)的IFA染色，随后用FITC缀合的二抗进行检测。PEDV滴度计算为Log10 TCID50/mL，使用法。
攻击病毒：
对3至5日龄哺乳仔猪进行胃内攻击，使用PEDV毒株Colorado 2013分离株，每只猪10^5TCID50。
与PEDV活减毒病毒类似，在Vero细胞上滴定攻击病毒。
粪便脱落
根据Chen等(2014,J.Clin.Microbiol.,vol.52,p.234-243)，使用qRT-PCR进行PEDV RNA提取和PEDV病毒血症检测。根据生产厂商的说明书，使用MagMAXTM病原体RNA/DNA试剂盒(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)和Kingfisher 96仪器(ThermoScientific,Waltham,MA,USA)。使用Path-ID Multiplex One-setp RT-PCR试剂盒(LifeTechnologies)进行qRT-PCR，并在ABI 7500Fast仪器TM(Life Technologies)上进行。
血清学
通过荧光焦点中和(FFN)检测确定母猪血清、初乳和母乳中的PEDV特异性中和抗体和在仔猪血清中的被动抗体。
在抗体ELISA中测定了针对攻击PEDV毒株PEDV刺突蛋白S1部分的血清中的PEDV抗体：使用100μl PEDV刺突蛋白(来自PEDV毒株Colorado 2013的重组S1二聚体；0.25μg/mL)包被微量滴定板。按照1:900将血清在PBS/1％BSA中稀释，并加入包被的孔中，随后在37℃下孵育1小时。使用PBS/0.05％吐温20洗涤2次后，将按照1:10.000在PBS/1％BSA/0.5％吐温20中稀释的100μl兔抗猪IgG HRPO缀合物加入孔中，并将板在37℃下孵育1小时。使用PBS/0.05％吐温20洗涤3次后，将100μl/孔的TMB“super slow”TM底物加入各孔中，随后在室温下避光孵育10min。每孔加入100μL 25％的硫酸终止反应。使用ELISA酶标仪测量在450nm处的光密度(OD)。将来自自然PEDV感染猪的血清作为阳性对照。
4.4.结果和结论
结果如下表4-6中所示。
与从未免疫接种母猪(第4组)出生的仔猪相比，以及与接受同源初免-强化RP疫苗的组(第1组)相比，从使用根据本发明免疫接种方法免疫接种的第2组和第3组的妊娠母猪出生的仔猪的死亡率显著降低。
与使用同源初免-强化RP疫苗免疫接种的母猪(第1组)和未免疫接种的对照母猪(第4组)相比，使用异源免疫接种方法口服初免的母猪(第2组和第3组)血清中PEDV特异性抗体水平显著更高。
与从第1组和第4组母猪出生的仔猪相比，从第2组和第3组母猪出生的仔猪PEDV特异性中和MDA显著更高。来自第2组母猪的仔猪的IgA抗体水平显著高于所有其他免疫接种的组。
表4：以窝显示的仔猪发病率、死亡率和体重增加情况
表5：在母猪中免疫接种后通过FFN和IgA ELISA测定的PEDV特异性抗体应答
表6：攻击前仔猪中的PEDV特异性母源抗体
附图说明
图1：在实施例1的实验中检测的各组的PRRSV病毒血症结果。
图2：根据每组的qPCR评分，来自在实施例2中描述的实验的PRRSV病毒血症测定结果。
图3：根据每组的qPCR评分，来自在实施例3中描述的实验的PRRSV病毒血症测定结果。

Claims (10)

1.包含病毒的活减毒形式的疫苗和包含编码来自所述病毒的一种或多种抗原的复制子颗粒(RP)的疫苗在制备药物组合中的用途，所述药物组合用于保护目标动物免受由所述病毒引起的感染或疾病，其中所述病毒选自猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)，其中所述药物组合配制成包括：
-向所述目标动物施用的包含所述病毒的活减毒形式的疫苗，和
-然后向所述目标动物施用的包含编码来自所述病毒的一种或多种抗原的复制子颗粒(RP)的疫苗。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述目标动物是猪。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中包含RP的所述疫苗包含编码来自所述病毒的一种或多种抗原的至少一种其他RP。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其中由所述RP编码的至少一种病毒抗原来自为活减毒病毒物种中的变体的病毒。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述疫苗的一者或两者包含佐剂。
6.包含病毒的活减毒形式的疫苗和包含编码来自所述病毒的一种或多种抗原的RP的疫苗在制备药物组合中的用途，所述药物组合用于保护目标动物免受由病毒引起的感染或疾病的初免-强化免疫接种方案，其中所述病毒选自猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)，其中所述药物组合配制成包括：向所述目标动物施用的包含所述病毒的活减毒形式的疫苗，和然后向所述目标动物施用的包含编码来自所述病毒的一种或多种抗原的RP的疫苗。
7.包含病毒的活减毒形式的疫苗在制备药物组合中的用途，所述药物组合用于初免-强化免疫接种方案，以保护目标动物免受由所述病毒引起的感染或疾病，其中所述病毒选自猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)，其中所述药物组合包括：
-用于免疫接种的包含病毒的活减毒形式的所述疫苗，和
-用于然后免疫接种的包含编码来自所述病毒的一种或多种抗原的RP的疫苗。
8.包含编码来自病毒的一种或多种抗原的RP的疫苗在制备药物组合中的用途，所述药物组合用于初免-强化免疫接种方案，以保护目标动物免受由所述病毒引起的感染或疾病，其中所述病毒选自猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)，其中所述药物组合包括：
-用于免疫接种的包含所述病毒的活减毒形式的疫苗，和
-用于然后免疫接种的包含RP的所述疫苗。
9.病毒的活减毒形式在制备用于保护目标动物免受由所述病毒引起的感染或疾病的疫苗组合中的用途，其中所述病毒选自猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)，其中所述疫苗组合在初免-强化免疫接种方案中施用，所述疫苗组合包括：
-用于施用的包含病毒的活减毒形式的疫苗，和
-用于然后施用的编码来自所述病毒的一种或多种抗原的RP的疫苗。
10.编码来自病毒的一种或多种抗原的RP在制备用于保护目标动物免受由所述病毒引起的感染或疾病的疫苗组合中的用途，其中所述病毒选自猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)，其中所述疫苗组合在初免-强化免疫接种方案中施用，所述疫苗组合包括：
-用于施用的包含所述病毒的活减毒形式的疫苗，和
-用于然后施用的包含RP的疫苗。
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