CN103269715B - 用于改进流感病毒和疫苗种子的生产的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于生产流感病毒，特别是疫苗种子或靶向流感病毒的疫苗的方法，其特征在于，所述生产在Mdm2蛋白和p53蛋白之间相互作用的抑制剂的存在下进行。

Description

用于改进流感病毒和疫苗种子的生产的方法
本发明涉及流感病毒和疫苗种子的技术领域。更具体地，本发明涉及用于改进流感病毒和疫苗种子的生产的方法。
流感是全世界性常见病毒呼吸道感染，由流感病毒引起，冬季期间在温带地区出现疫情发作。该疾病当今仍然存在，并且为仅次于肺炎的第二大致死性传染病。导致人体病理状态的流感病毒有A型和B型流感病毒。B型流感病毒以代系形式(lineageform)传播，而A型流感病毒则根据两个主要表面糖蛋白，即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性质而分为不同的病毒亚型。流感病毒表面具有介于300种至700种的糖蛋白，与之相关的NA/HA理论比例为1：10。在人之间流行且造成季节性疫情的病毒为A(H1N1)和A(H3N2)病毒。由于流感病毒的主要储存宿主是动物(禽类和猪)，因此动物病毒能够跨越种间屏障并感染人类。病毒，例如导致2009年大流行的高致病性A型(H5N1)禽病毒和A型(H1N1)病毒能够导致严重的公共健康问题。
目前，免疫接种是保护人群免受流感病毒影响的唯一有效途径。“季节性”疫苗使得能够获得对抗流行的季节性A(H1N1)和A(H3N2)病毒和B型病毒的免疫力。“季节性”疫苗由WHO每年基于前一年的原型株而确定。宿主的免疫反应主要是体液型，并合成靶向HA和NA蛋白的中和抗体。特别地，对于A型病毒，因为这两种蛋白的显著抗原更换，每年必须疫苗组合物作出重新评定。
流感病毒的培养构成了疫苗生产领域以及对流感病毒的基础和生物医学研究领域中的关键元素。重配(Reassortant)疫苗流感病毒主要培养在鸡胚蛋(embryonatedchickenegg)系统中。目前，估计一颗鸡蛋能够产生一个剂量的三价疫苗(Hampsonetal.InfluenzaOtherRespi.Viruses.2008Nov.2(6),191-2)。用于在蛋中生产疫苗的方法需要5至6个月的时间，并且不能缩短。在面临对抗流行性季节株疫苗的不断增加的需求，以及对难以预期的抗一种(或多种)潜在爆发流行株疫苗的需求时，蛋类的可用性会成为限制因素，考虑到家禽场中的禽流行病风险时更是如此。此外，家禽本身能够受到流感病毒感染，如果用于病毒生产的饲养场本身卷入流感病毒流行中，则会导致供给困难。在本发明中且从经济学的观点来看，探索并开发用于生产疫苗种子的新优化方法(缩短时间和或/消减成本)是合理的。
过去几年已开发了用于获得免疫剂量(vaccinedoses)的可选策略。实际上，使用细胞系用来扩增重配疫苗(vaccinereassortants)使得疫苗生产可能不再依赖于“蛋”系统(蛋的数量可能不足以控制疫情)，降低常见于尿囊生产中的表面抗原修饰，并且产生的过敏反应风险较低。然而，目前，由于工业方法远没有尿囊系统有效，几乎没有厂商选择这种新生产模式。实际上，在细胞培养物中生产病毒和病毒抗原(HA和NA)都面临产率的问题，以及由此带来的病毒或抗原产量的问题。很多研究团队都正在开发生产病毒的细胞系统，以补充乃至替代在蛋中生产的模型。这些细胞系统通常允许高于尿囊系统中的病毒株数量，并可快速地设置成工业级水平(Barrettetal.Curr.Opin.Mol.Ther.2010Feb;12(1):21-30)。此外，这些系统可以与反向遗传学技术偶联，使其能够以快速且灵活的模式生产重组病毒(疫苗种子)，也可根据其病毒性质(复制、抗原表达等)进行优化。出于健康安全和规章限制的原因，所选的细胞系必须根据其在无动物源蛋白的合成培养基(不含动物源血清的合成培养基)中产生高效价病毒的能力进行选择。还描述了用于细胞悬浮生产的细胞系统(LeRuetal.Vaccine.2010May7;28(21):3661-71)。迄今为止，得到监管授权的细胞系，例如MDCK、Vero、BHK21、CHO、HEK293和PERC6，尚不能获得对厂商而言足够的产率。
主要的经济学挑战之一是能够降低产生接种剂量的成本和所需时间(每次生产更多的剂量和/或减少获得相同剂量所需的时间)。
本发明基于预想不到的观察结果，即对Mdm2活性的拮抗作用，以及更特别地抑制p53-Mdm2相互作用的作用对流感病毒的复制周期的影响。
在本文中，本发明提供了用于生产流感病毒和疫苗种子的新方法，其特征在于所述生产在Mdm2蛋白拮抗剂的存在下进行。
Mdm2蛋白拮抗剂特别用于在数量上改进所生产流感病毒的生产，这是现有技术中未知且没有暗示的。
根据一个具体实施方式，所述Mdm2蛋白的拮抗剂是Mdm2蛋白和p53蛋白之间相互作用的抑制剂。
在更详细描述本发明之前，现给出本发明文中使用的术语的具体定义。
术语“流感病毒”是指所有的流感病毒，特别是人、禽、马、猪和猫流感病毒。所述流感病毒可选自A、B和C亚型。特别地，所述流感病毒可以是A亚型，并特别地，能够对应于H1N1、H2N2、H3N2、H4N2、H4N6、H5N1、H5N2、H7N7和H9N2株，特别是A型(H1N1)和A型(H3N2)病毒。在H1N1株中，可更特别地提到A/PortoRico/8/34(也称作A/PR/8/34)、A/NewCaledonia/20/99、A/Beijing/262/95、A/Johannesburg/282/96,A/Texas/36/91、A/California/969/09A(H1N1)sov。在H3N2株中，可更特别地提到A/Panama/2007/99、A/Moscow/10/99、A/Johannesburg/33/94。在B亚型流感病毒中，可提到，例如B/PortoRico/8/34、B/Johannesburg/5/99、B/Vienna/1/99、B/AnnArbor/1/86、B/Memphis/1/93、B/Harbin/7/94、N/Shandong/7/97、B/HongKong/330/01和B/Yamanashi/166/98亚型。尽管本发明靶向无论其来源的所有流感病毒，但本发明最有利地用于人流感病毒，特别是在人群中流行的流感病毒。根据一个具体实施方式，所述流感病毒选自人A型(H1N1)和人A型(H3N2)病毒。在本发明中，术语“病毒”包括野生型病毒、从受感染个体获得的原代病毒分离株、重组病毒、减毒病毒、重配病毒以及通过反向遗传学产生的病毒。最常见地，用于疫苗生产的“疫苗种子”通过遗传重配或反向遗传学获得，因此，构成用于本发明目的的具体实例。
目前，用于生产疫苗的传统方法基于，首先对于WHO确定的每种流感病毒的3个年度原型种子中的每一种，通过与A/PR8/34(H1N1)株的遗传重配从蛋上获得疫苗种子。大多数疫苗厂商通常使用主要源自A/PR/8/34亲本病毒的这些重配病毒。因此，每个疫苗种子均是原型株与在蛋中具有目标复制能力的A/PR8/34(H1N1)病毒之间的遗传重配的结果。
野生型流感病毒(也称作与天然流行的病毒对应的原型病毒)的病毒颗粒包含由RNA单链组成的8个不同基因片段，每个基因编码病毒的1至3个预定蛋白：HA、NA、M1、M2、NP、NS1、NEP、PB1、PB1F2、PB1N40、PB2和PA。在适用于大规模生产的原型病毒(其目前对应于A/PR/8/34亲本株(组合物“6+2”)的遗传背景下，通过重配获得的疫苗种子对应于至少包含编码原型株HA和NA的基因片段的重配疫苗。随后，可在蛋或细胞培养物中扩增由此遗传重配产生的，从3个年度原型株获得的重配疫苗，亦称作疫苗种子。目前，蛋系统在工业规模上得到非常广泛的应用。过去几年开发的用于生产疫苗种子的其他技术也以反向遗传学为基础。然而，通过反向遗传学的疫苗种子生产不是得到WHO批准的登记方法。
无论使用何种技术生产疫苗种子，疫苗最常对应于HA和NA抗原，其在尿囊细胞中由生产的疫苗种子纯化而来，或来自体外细胞培养物。在疫苗中，这些糖蛋白可任选地与助剂组合。目前，疫苗剂量通过固定量的HA抗原定义(15毫克/病毒亚型/剂)。NA抗原的阳性检测结果对于疫苗批次的确认是必需的。
在本发明中，术语“Mdm2拮抗剂”是指能够与Mdm2相互作用，并至少部分阻断其生物活性的分子。具体地，在本发明中，所使用的Mdm2拮抗剂的作用如Mdm2蛋白和p53蛋白之间相互作用的抑制剂。
“Mdm2蛋白和p53蛋白之间相互作用的抑制剂”可定义为抑制p53和Mdm2蛋白之间相互作用的化合物。此类化合物为，例如结合至p53和Mdm2之间的界面并抑制其结合的，靶向Mdm2的反义脱氧核苷酸，或更广泛研发的肽或非肽的小分子量分子。
p53肿瘤抑制蛋白在细胞周期、凋亡、DNA修复和多种代谢途径的调控中发挥核心作用。由于其核心地位，p53是人肿瘤中最常突变的蛋白。实际上，近50%的癌症显示了p53基因的突变，导致此蛋白失活或丧失。更广泛地，p53功能在癌症中往往受到抑制。在正常条件下，p53的活性和量受到Mdm2蛋白(鼠双微体2，或称作Hdm2)的严密调控。这种独特的蛋白是E3泛素连接酶，其能够与p53直接相互作用，这两种蛋白之间复合体的形成构成了自调控循环的步骤：当p53被激活时，其与Mdm2的P2启动子结合，并诱导Mdm2的转录和表达。进而，对于Mdm2的方面，其能够结合p53，并通过多种机制抑制p53(p53转录活化抑制，使p53脱离细胞核并通过蛋白酶降解p53)(Freedmanetal.CellMolLifeSci.1999Jan.55(1),96-107)。
在本发明中，可使用任何Mdm2拮抗剂，特别是Mdm2蛋白和p53蛋白之间相互作用的任何抑制剂。这些化合物最为知名的性质是诱导p53蛋白的活性，以及抑制细胞增殖。p53和Mdm2蛋白之间的相互作用涉及这两个配偶体之间的氨基末端区域。这些相互作用区域已通过双杂交(酵母)法以及免疫沉淀试验得到确定。这些区域在p53上对应于1至41/52的区域，而在Mdm2上，则对应于1/19至118/202的区域。定点突变试验已显示了与Mdm2的相互作用中具有重要意义的p53的多个残基：Leu14、Phe19、Leu22和Trp23(KleinC,etal.Br.J.Cancer.2004Oct18;91(8):1415-9)。
用于评估化合物抑制p53与Mdm2蛋白之间相互作用的有效性的主要方法包括，通过产生作为待抑制的生物参数(即p53/Mdm2相互作用)的函数的反应曲线，计算50%抑制浓度(IC50)，并间接计算抑制常数(Ki，通过Cheng-Prusoff等式)。
例如，如Vassilev等人(Science2004Feb6;303(5659):844-8)所述，可通过使抑制分子与Mdm2竞争：将不同浓度的化合物与重组Mdm2蛋白一起温育，并注射到带有连接有重组p53蛋白的芯片的小室(SPR)中，从而通过表面等离子体共振(SPR,Biocore)测量计算IC50。也可使用基于荧光测量技术的其他技术(Kaneetal.AnalBiochem.2000Feb1;278(1):29-38；Luetal.JMedChem.2006Jun29;49(13):3759-62)。在如Nutlin-3的分子家族的情况下，所述化合物具有约100-300nm的IC50(Vassilevetal.,2004，如上)。在NSC66811分子的情况下，Ki常数为120nM(Luetal.2006，如上)。
在此类竞争试验中，可引入源自p53的天然肽作为对照，特别是如上文(Luetal.,2006)所述的，p53的13至29残基的肽（SEQIDNo.1:PLSQETFSDLWKLLPEN-NH2），该文献中测量并给出了其Ki常数为6670nM。特别地，认为在如上文(Vassilevetal.,2004；Kaneetal.,2000和Luetal.,2006)所述的至少一个竞争测试中显示低于该肽的Ki或IC50的化合物，是本发明中Mdm2/p53相互作用的抑制剂。更普遍地，优选在上文(Luetal.,2006)所述的竞争测试以及补充信息JM060023中显示小于10μM，更优选小于5μM，更优选小于1μM的Ki的化合物。
作为实例，可用在本发明中的“Mdm2蛋白与p53蛋白之间相互作用的抑制剂”可以是现有技术中描述的作为Mdm2抑制剂的咪唑啉衍生物(imidazolinederivatives,特别是US6734302、WO03/051359、WO2007/082805、WO2007/063013、EP1463501、WO2006/097261、US2008/0255119和WO2008/130614中所述的那些)、咪唑衍生物(imidazolederivatives,特别是WO2008/130614和WO2008/119741中所述的那些)、羟吲哚衍生物(oxindolederivatives,特别是US7576082和WO2008/034736中所述的那些)、螺吲哚啉酮衍生物(spiroindolinonederivatives,特别是EP1856123、J.Med.Chem.2006,49,3432-5、US60/781958、US7495007、WO2007/104714和WO2008/141975中所述的那些),喹啉衍生物(quinoline)，特别是异喹啉衍生物(isoquinolinederivatives,特别是WO2008/034039、US2009/0068144和Chem.Med.Chem.2008,3,1118-28中所述的那些)、双芳基磺酰胺衍生物(bisarylsulfonamidederivatives,特别是EP1519932中所述的那些)、苯二氮卓类衍生物(benzodiazepinederivatives,特别是J.Med.Chem.2005,48,909-12、EP1443937和US7115598中所述的那些)、哌啶衍生物(piperidinederivatives,特别是US7060713和WO2008/005268中所述的那些)、苯氧基乙酸衍生物或苯氧甲基四唑衍生物(phenoxyaceticacidderivativesorphenoxymethyltetrazolederivatives,特别是EP0947494中所述的那些)、查耳酮衍生物(chalconederivatives,特别是Biochemistry,2001,40,336-44和US7514579中所述的那些)、四唑衍生物(tetrazolederivatives,特别是US2008/0262200中所述的那些)、二硫化物衍生物(disulfidederivatives,特别是US2009/008553中所述的那些)、二氨基芳基衍生物(diaminoarylderivatives特别是WO2006/032631、WO2007/107543和WO2007/107545中所述的那些)，或肽衍生物(apeptidederivative,特别是Bottgeretal.,inResearchPaper,7(11),1997,860-9中所述的那些)。更多细节可参照，LutzWeber(ExpertOpin.Ther.Patents2010,20(2),179-190)和Shangary等(AnnuRevPharmacolToxicol.2009;49:223-41)的公开中给出的关于此类抑制剂的综述。
更具体的实例可参考：
Vassilev等人(Science.2004Feb6,303(5659),844-8)所述的Nutlin-3，(±)-4-[4,5-双(4-氯苯基)-2-(2-异丙氧基-4-甲氧基-苯基)-4,5-二氢咪唑-1-羰基]哌嗪-2-酮，见下式：
其是肿瘤学中两个I期临床试验的主题；
-NSC66811分子，下式的(2-甲基-7-[苯基(苯基氨基)甲基]-8-喹啉醇)：
-以及具有下式的分子：
其中，X、Y、R1、R2、R3、R4和R5如国际申请WO2008/119741中所述；
已知此类分子在癌症治疗的应用，但从未预想到其用于改进流感病毒生产数量的应用。本发明的贡献在于Mdm2拮抗剂，优选Mdm2蛋白和p53蛋白之间相互作用的抑制剂用于生产流感病毒或疫苗种子的应用。可使用用于其生产的任何技术。
在细胞系统中，在Mdm2拮抗剂，特别是Mdm2蛋白和p53蛋白之间相互作用的抑制剂的存在下，进行流感病毒或疫苗种子的生产。
可由本领域技术人员调整的多个参数可对Mdm2拮抗剂，特别是Mdm2蛋白和p53蛋白之间相互作用的抑制剂的作用具有影响：抑制剂的量，添加抑制剂的时机，感染时的病毒初始量，生产时间。
例如，可使用0.1至100μM浓度的Mdm2拮抗剂，特别是Mdm2蛋白和p53蛋白之间相互作用的抑制剂。具体地，在使用诸如Nutlin-3的咪唑衍生物时，优选选择约1μM至10μM的浓度，在使用诸如NSC66811的喹啉衍生物时，可优选选择约0.5μM至5μM的浓度。
使用流感病毒或流感疫苗种子感染所选择的细胞系统(蛋或细胞培养物)。可在感染前、后或感染时添加Mdm2拮抗剂，特别是Mdm2蛋白和p53蛋白之间相互作用的抑制剂。特别地，可在鸡胚蛋中的尿囊细胞或体外细胞培养物中进行病毒，特别是疫苗种子的生产。所使用的细胞可以是适合细胞培养、病毒的复制和生产以及病毒抗原生产的任何类型的细胞。有利地，所述细胞选自人或动物源的哺乳动物细胞，禽细胞或昆虫细胞。
在哺乳动物细胞中，可更特别地提到源自人细胞，猪细胞或犬细胞的培养细胞。这些细胞可具体源自肺上皮细胞(例如人肺癌A549CCL-185)或肠上皮细胞(Caco-2ATCCHTB-37)。
在哺乳动物细胞中，可提到以下细胞：
оSJPL猪肺上皮细胞，尤其包括保藏在ATCC的PTA-3256细胞系(US2004/0142450和WO2009/059411)；
о来自犬的MDCK细胞；
оBHK21CCL-10金黄仓鼠(Mesocricetusauratus；仓鼠)细胞；
оHOS人细胞，尤其包括CRL-1543细胞系。
在一个具体实施方式中，所述细胞是适合于细胞培养的禽细胞，例如：
оCCL-141家鸭(Anasplatyrhynchosdomesticus)；
оCRL-12135原鸡(Gallusgallus)ConA-C1-VICK；
оCRL-12203原鸡UMNSAH/DF-1；
оCRL-12357原鸡ConA-B1-VICK；
оCRL-1590原鸡SL-29；
оCRL-1708日本鹌鹑(Coturnixcoturnixjaponica)QT6；
оCRL-1962日本鹌鹑QM7(鹌鹑肌肉克隆7)；
оCRL-2111原鸡(鸡)DT40；
оCRL-2112原鸡(鸡)DT95；
оCRL-8135野火鸡(Meleagrisgallopavo；火鸡)MDTC-RP19；和
о保藏在ATCC(CRL-1632)的QM7成肌细胞系，其描述于US2005/0084503。
其他禽细胞系是本领域技术人员已知的，并且可以使用。其可具体为禽胚细胞。EB66和EBx细胞系描述于WO03/076601和WO2008/129058。Lohr等人描述了用于病毒增殖或复制的AGE1.CR和AGE1.CR.pIX禽细胞系的建立。WO2009/004016还描述了用于病毒生产的永生化禽细胞及其制备方法。
根据一个具体实施方式，这些细胞选自MDCK、Vero和A549细胞，并通常来自用于生产流感病毒的禽细胞系。
MDCK细胞描述于，例如US2006/0188977和EP1862537。可具体提到以下细胞系：MDCK-SF101(ATCCPTA-6501)、MDCK-SF102(ATCCPTA-6502)和MDCK-SF103(ATCCPTA-6503)。
所述细胞例如选自以下细胞：
о胚细胞，特别是非洲绿猴(Cercopithecusaethiops)CCL-81胚细胞系；
оCHO细胞，特别是黑线仓鼠(Cricetulusgriseus；中国仓鼠)CRL-12444和CHODP-12克隆#1933aIL8.92NB28605/12细胞系；
оMDCK细胞，特别是CCL-34犬(Canisfamiliaris)MDCK(NBL-2)细胞系；
оCOS细胞，特别是非洲绿猴CRL-1650、非洲绿猴CRL-1651和COS-7细胞系；
оCV1细胞，特别是CCL-70非洲绿猴(Cercopithecusaethiops)CV-1细胞系；
оHeLa细胞，和
оHep-2细胞。
CV-1、CV-C、Vero和BSC-1细胞系用于病毒生产的应用描述于，例如US6303371。
在有利的实施方式中，所述细胞选自CHO、MDCK、COS、CV-1、Vero、BHK21、PERC6、A549、HEK、HeLa、AGE1.CR、AGE1.CR.pIX、EB66、EBx和Hep-2。有利地，所述细胞选自得到监管授权用于在细胞培养中进行用于医药目的的病毒生产的细胞系。
根据一个具体实施方式，本发明用于生产流感病毒的方法包括以下步骤：a)使用流感病毒，特别是流感疫苗种子感染细胞系统，所述细胞系统可以是鸡胚蛋，或细胞培养基中细胞系的细胞；b)在允许所述流感病毒，尤其是所述流感疫苗种子复制的条件下培养步骤a)中选择并感染的细胞系统；c)收获特别是在培养上清和/或所述培养细胞中产生的完整(whole)流感病毒，特别是疫苗种子。在蛋系统中，所述培养在体内进行，而在细胞系的情况下，其在体外进行。
Mdm2拮抗剂，特别是Mdm2蛋白与p53蛋白之间相互作用的抑制剂的应用能够实现任何类型流感病毒的生产，特别是野生型病毒、从受感染个体获得的原代病毒分离株、重组病毒、减毒病毒、重配病毒以及通过反向遗传学产生的病毒。
根据一个具体实施方式，所述生产可在体外细胞系统进行。使用所选择的流感病毒感染细胞系的细胞是在细胞培养基中进行，优选无血清培养基，更优选不含动物源蛋白质的培养基(校准的合成培养基)。根据一个具体实施方式，所述感染细胞的培养在足以确保所述病毒在培养基中繁殖的条件下，在存在蛋白水解酶的培养基中进行。所述蛋白水解酶是，例如选自胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶A、弹性蛋白酶、弗林蛋白酶(furin)和羧肽酶。有利地，此酶是重组酶，因此不是动物源。
由于流感病毒的片段性质(fragmentednature)，本发明的方法可用于生产重配流感病毒。在这种情况下，使用至少两个流感病毒株感染所选择的细胞系统，其导致在单个宿主细胞中生产来自两个病毒株的片段的混合物。在病毒的组装过程中，所有的片段组合在理论上都是可能的。新的组合称作重配体。可通过例如通过抗体的方式抑制或消除其他病毒，而选择具体的重配体。根据此类方法产生疫苗种子。关于这些技术的其他细节，可参考KilnourneE.D.inPlotkinSA和MortimerE.A.Eds,Vaccines1994。
本发明的方法还可用于通过反向遗传学生产流感病毒。具体地，可将表达质粒转入到细胞中，由此可产生重组病毒(JGenVirol.2000Dec;81(Pt12):2843-7)。较少使用的另一种技术包括，使用流感病毒的病毒RNA的修饰转录本，其在纯化蛋白，特别是纯化的NP、PB1、PB2和PA的存在下，从cDNA构建物体外转录而来。随后，将由此产生的合成核糖核蛋白颗粒转染到此前由流感病毒感染的细胞中。关于后一种技术的更多细节，可参考Enami,Proc.Natl.Acad.Sci.8th,1990,3802-3805，Enami和Palese,J.Virol.1991,65,2511-2513(1991)和Luytjes,Cell.1989,59,1107-1113。
在本发明中，根据一个具体实施方式，本发明用于制备流感病毒，特别是疫苗种子的方法可包括将收获的病毒灭活的步骤。所述灭活可根据任何已知的技术进行，且例如，借助于使用甲醛、β-丙内酯、醚、醚和去污剂(例如Tween-80)、溴化十六烷基三甲铵(CTAB)、TritonN102、脱氧胆酸钠或三-N-丁基磷酸酯的处理。
本发明用于生产病毒，特别是疫苗种子的方法可包括在用于生产疫苗的方法中。在这种情况下，本发明用于制备疫苗的方法包括从产生的完整流感病毒生产抗原表面蛋白(HA和NA)的步骤。在这种情况下，有必要使用降解脱氧核糖核酸(DNA)的酶，例如DNase或核酸酶，处理包含所得完整病毒的培养基，特别是上清。还可添加阳离子去污剂，例如十六烷基三甲基铵或十四烷基三甲基铵盐，lipofectin或lipofectamine。
病毒或表面蛋白的收获最常伴随有浓缩和/或纯化，并使用特别是超滤或离心，而根据本领域技术人员熟知的技术进行(描述于例如Furminger,inNicholson,WebsterandHay(Eds.),Textbookofinfluenza，第24章，324-332页)。
通过本发明方法获得的疫苗可对应于死(也称作灭活)病原或活的减活病原。所述疫苗可以，例如，对应于在病毒生产后获得的培养上清，或能够使用根据本发明方法生产的病毒而获得的抗原性表面蛋白。
可参考下文和附图，以非限定的方式说明本发明。
图1显示了在Nutlin-3存在或缺失的条件下，未感染的A549细胞层和H3N2病毒感染的A549细胞层的照片。
图2至7显示了在不同培养条件，以及在不同感染时间后，在培养上清中观察到的病毒基因组拷贝量M/ml(其中M为编码M1和M2病毒蛋白的病毒基因组片段)。
对于所有以下实施例，所述试验均在37°C的温度下进行。所使用的培养基是DMEM(Ref41966,Gibco)，在感染期间补充胰蛋白酶(1ug/mL,Sigma)。
1)Nutlin-3对流感诱导的细胞病理效应的影响-使用H3N2A/Moscow/10/99病毒在A549细胞上进行测试。
A549细胞(ATCC，美国典型培养物保藏中心CCL185)是来自肺癌的细胞，其与II型肺泡上皮细胞(源自人呼吸道的极性上皮细胞)显示类似的特征(Lieberetal.IntJCancer.1976Jan15;17(1):62-70)。对来自感染患者的肺组织的多个离体研究显示，此类上皮细胞很可能构成流感病毒的原发感染位点(Nichollsetal.NatMed.2007Feb;13(2):147-9；vanRieletal.Science.2006Apr21;312(5772):399)。因此，认为这些细胞与流感病毒的研究相关，并由此非常广泛地用于流感病毒的基础研究领域。
对病毒诱导的细胞病理效应的随时观察和监视通常允许对细胞层感染程度进行第一评估。病毒诱导的细胞病理效应的特征特别在于，受感染细胞彼此融合，形成多核细胞结构(合胞体)。通过光子显微镜，对细胞层上这些结构的量和尺度的观察使得有可能获得感染程度的评估。在相同感染条件(MOI(感染复数)=2×10-3)下，在存在或缺失Nutlin-3(10μM)下获得的细胞病理效应的比较表现出显著差异，如图1所示，与未感染(MOCK)细胞相比，其可以自24hpi(感染后小时数)起观察到。在Nutlin-3缺失时，A549细胞显示出高级感染的细胞病理效应特征，带有大量细胞聚集体和大量合胞体结构。与此相比，经Nutlin-3(在感染前14h添加，随后，在感染期间保留的分子)处理的细胞显示出更显著的细胞病理效应，特别是存在更多的合胞体感染结构。
2)Nutlin-3对病毒产生的影响使用H3N2A/Moscow/10/99病毒在A549细胞上进行测试。
通过在上清中随时测定感染滴度(TCID50/ml)量化感染期间产生和释放的病毒，其表明Nutlin-3存在时更多的子代病毒量(自24hpi起获得1个log10的差异，图2A)。为了获得更精确的结果，随后通过病毒RNA提取和实时RT-qPCR量化进行上清中病毒基因组拷贝数量的量化(M/ml)(图2B)。在48hpi，Nutlin-3缺失下，检测到6.66x106拷贝M/ml，与此相比，在Nutlin-3存在下，检测到2.44x108拷贝M/ml，即病毒产量增长大于36倍。在72hpi进行的相同计算表明在使用Nutlin-3的有利条件下获得88倍的增长。
3)使用不同的初始病毒接种量，Nutlin-3对一个或多个病毒复制周期后产生的病毒滴度的影响-评估预处理和不同浓度Nutlin-3的影响
a)使用H3N2A/Moscow/10/99病毒在A549细胞上进行的测试
在Nutlin-3存在或缺失下，使用不同的病毒量(MOI0.01、0.1和1)感染A549细胞，在单个病毒周期(10hpi)或多个病毒周期(28hpi)后，通过RT-qPCR测量上清的拷贝数M/ml。在感染前14h(T=-14h)，或感染后立即(T=0h)使细胞接触Nutlin-3(图3)。在所有情况下，Nutlin-3均一次性添加。
在单个病毒周期的时间尺度(10hpi)上，只有在MOI为0.1和1的感染条件下，才能在上清中量化到病毒基因组。在细胞中存在Nutlin-3时，观察到上清中更高的拷贝数M/ml。例如，分别对于0.1和1的MOI，在Nutlin-3存在下，T=0开始处理时，在感染细胞上清中测量到的基因组拷贝数比不含Nutlin-3的对照多11-50倍(图3)。
使用10-3的MOI进行类似的试验，但改变进行预处理的时间(14h，相比感染前10h)。在48hpi，对于0.1、1和10μM的各个浓度，Nutlin-3可获得比对照高1.5、5.7和40倍的上清拷贝数M/ml(图4)。
b)使用H3N2A/Moscow/10/99病毒在MDCK细胞上进行的测试
MDCK细胞系(ATCCNo.CCL-34)是最常用于流感病毒的试验室生产的细胞系，也是经注册，并由Novartis和Solvay生产多批次疫苗的细胞系。
图5中显示的结果表明，在10-3的初始MOI下，不同浓度的Nutlin-3分子(0.1、1和10μM)，在感染前14h的预处理，显著提高了多个连续病毒周期后细胞上清中的病毒滴度(基因组拷贝数M/ml)。在24hpi，在Nutlin-3存在下获得的基因组拷贝数M/ml比对照高出达19倍。这些额外的数据确认了使用A549细胞系获得的结果。
4)另一种Mdm2拮抗剂分子(NSC66811)对病毒复制的影响使用H3N2A/Moscow/10/99病毒在A549细胞上进行测试。
-已知NSC66811分子，下式的(2-甲基-7-[苯基(苯基氨基)甲基]-8-喹啉醇,MerckBiosciences)：
与Mdm2相互作用，并还由此阻断p53/Mdm2相互作用(与Nutlin-3的作用类似)。
此分子以2和20μM的浓度使用，MOI为10-3。
图6中给出了在48hpi获得的结果，并显示NSC66811分子能够获得与此前对Nutlin-3分子所述完全类似的结果。因此，在48hpi，2μM浓度的NSC66811使其能够获得比对照高出约6倍的上清中基因组拷贝数M。类似地，在72hpi，20μM浓度的NSC66811使其能够获得比对照高出约5倍的上清中基因组拷贝数M。
5)Mdm2过表达对病毒复制的影响-使用H3N2A/Moscow/10/99病毒在A549细胞上进行测试。
还研究了Mdm2过表达对病毒产生的影响。所述结果显示在图7中，其中给出了在10-3的初始MOI下，在48hpi和72hpi的拷贝数，显示当Mdm2蛋白过表达(pcdNA-Hdm2)时，H3N2病毒的复制效率降低。此结果确认了所测试的分子对流感病毒产生的影响确实与其对Mdm2蛋白的拮抗作用相关。
6)总结
1)、2)、3)、4)和5)中呈现的所有试验均显示了Nutlin-3或另一种Mdm2拮抗分子(NSC66811)在两个不同细胞系统(A549/MDCK)中对流感病毒的病毒生产的明显作用。所检测的两个分子(p53-Mdm2相互作用的抑制剂)的作用模式之间的功能联系及其对流感病毒的细胞生产的调控性质得到了在Mdm2过表达条件下所得结果的支持。

Claims (20)

1.用于生产流感病毒的方法，其特征在于，所述生产在Mdm2拮抗剂的存在下进行，所述Mdm2拮抗剂是Mdm2蛋白与p53蛋白之间相互作用的抑制剂。
2.如权利要求1所述的用于生产流感病毒的方法，其特征在于，使用Mdm2拮抗剂用于在数量上改进所生产流感病毒的生产。
3.如权利要求1或2所述的用于生产流感病毒的方法，其特征在于，所述流感病毒是疫苗种子。
4.如权利要求1或2所述的用于生产流感病毒的方法，其特征在于，所述流感病毒选自A、B和C亚型。
5.如权利要求1或2所述的用于生产流感病毒的方法，其特征在于，所述流感病毒选自H1N1、H2N2、H3N2、H4N2、H4N6、H5N1、H5N2、H7N7和H9N2株的A亚型流感病毒。
6.如权利要求1或2所述的用于生产流感病毒的方法，其特征在于，所述流感病毒是H3N2的A病毒。
7.如权利要求1或2所述的用于生产流感病毒的方法，其特征在于，使用除人之外的细胞系统进行所述生产，其中使用流感病毒感染所述细胞系统，并在感染之前、之后或感染时添加所述Mdm2拮抗剂。
8.如权利要求1或2所述的用于生产流感病毒的方法，其特征在于，在鸡胚蛋的尿囊细胞中进行所述生产。
9.如权利要求1或2所述的用于生产流感病毒的方法，其特征在于，在体外细胞培养物中进行所述生产。
10.如权利要求9所述的用于生产流感病毒的方法，其特征在于，在选自CHO、MDCK、COS、CV-1、Vero、BHK21、PERC6、A549、HEK、HeLa、AGE1.CR、AGE1.CR.pIX、EB66、EBx和Hep-2的细胞系中体外进行所述生产。
11.如权利要求1或2所述的用于生产流感病毒的方法，包括以下步骤：a)使用流感病毒感染细胞系统，所述细胞系统可以是鸡胚蛋或细胞培养基中细胞系的细胞；b)在允许所述流感病毒复制的条件下培养步骤a)中选择并感染的生产细胞系统；c)收获在培养上清和/或培养的所述细胞中产生的完整流感病毒。
12.如权利要求11所述的用于生产流感病毒的方法，其特征在于，所述流感病毒是疫苗种子。
13.如权利要求11所述的用于生产流感病毒的方法，其特征在于，包括灭活在步骤c)中收获的病毒。
14.如权利要求1或2所述的用于生产流感病毒的方法，其特征在于，所述病毒是野生型病毒、从受感染个体获得的原代病毒分离株、重组病毒、减毒病毒、重配病毒或通过反向遗传学产生的病毒。
15.如权利要求1或2所述的用于生产流感病毒的方法，其特征在于，所述Mdm2拮抗剂是Mdm2蛋白和p53蛋白之间相互作用的抑制剂，其选自咪唑啉衍生物、咪唑衍生物、羟吲哚衍生物、螺吲哚啉酮衍生物、喹啉衍生物、双芳基磺酰胺衍生物、苯二氮卓类衍生物、哌啶衍生物、苯氧基乙酸衍生物或苯氧甲基四唑衍生物、查耳酮衍生物、四唑衍生物、二硫化物衍生物、二氨基芳基衍生物或肽衍生物。
16.如权利要求1或2所述的用于生产流感病毒的方法，其特征在于，所述Mdm2拮抗剂是Mdm2蛋白和p53蛋白之间相互作用的抑制剂，其选自异喹啉衍生物。
17.如权利要求1或2所述的用于生产流感病毒的方法，其特征在于,所述Mdm2拮抗剂是Mdm2蛋白与p53蛋白之间相互作用的抑制剂，其选自：
下式的Nutlin-3，(±)-4-[4,5-双(4-氯苯基)-2-(2-异丙氧基-4-甲氧基-苯基)-4,5-二氢咪唑-1-羰基]哌嗪-2-酮：
-下式的NSC66811分子，(2-甲基-7-[苯基(苯基氨基)甲基]-8-喹啉醇)：
以及具有下式的分子：
18.用于制备抗流感病毒的疫苗的方法，其特征在于，其包括通过权利要求1-17中任一项所述的方法生产流感病毒。
19.如权利要求18所述的用于制备抗流感病毒的疫苗的方法，其特征在于，其包括从通过权利要求1-17中任一项所述的方法生产的完整流感病毒生产抗原性表面蛋白。
20.如权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所获得的疫苗对应于死病原或活的减毒病原。
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