CN103255203A - 一种分子标记在猪初生重性状关联分析中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于猪的分子标记制备与应用技术领域，具体涉及一种与繁殖性状中特别是与猪初生重性状相关的分子标记的新用途。该分子标记是从HPSE基因中克隆得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在该序列的80bp处有一个A\G等位基因突变，导致Alu I-RFLP多态性。本发明公开了该分子标记的具体新用途的步骤。

Description

一种分子标记在猪初生重性状关联分析中的应用

技术领域

本发明属于猪的分子标记制备与应用技术领域，具体涉及一种猪繁殖相关性状特别是与猪初生重性状分子标记的应用。该分子标记与猪初生重性状相关，从HPSE基因中克隆得到，本发明主要涉及该分子标记的新用途。

背景技术

猪是重要的经济动物，作为我国广大人民动物性蛋白的主要来源之一。近年来，人们对猪肉的消费量与日俱增，对于养猪生产者来说，如何提高生产性能、降低生产成本成了他们关注的焦点。在过去的几十年里，育种工作者通过常规的育种技术，对猪的许多重要经济性状进行了遗传改良，并取得了较理想的成果(如瘦肉率，背膘厚等)。但是对于猪繁殖性状的改良进度很缓慢，且效果不是很明显，没有取得预期的实质性突破。

分子生物学技术的迅速发展为此提供了重要的契机，凭借这一技术手段，科学家们发掘出了一大批与猪的初生重，生长速度，断奶重，产仔数等重要的繁殖性状有着显著关联的分子标记。这为提高猪的生产性能提供了理论依据，并从实质上使之得到了很大的提高。

猪的初生重作为一个重要的繁殖性状，对猪出生后的生长速度及成活率具有重要的作用。最近有很多文献报道了初生重对猪出生后生长速度的影响，李剑豪(李剑豪.长白猪初生重对生长速度及哺育率的影响.仔猪生产[J].2006.18)研究发现长白猪60日龄重与35日龄重均与初生重呈正相关且初生重与生长速度呈正相关。Beaulieu等(Beaulieu AD等，Impact of pigletbirth weight，birth order and litter size on subsequent growth performance，carcass quality，musclecomposition and eating quality of pork[J].J Anim Sci.2010)和Poore等(Poore K.R.等，Theeffects of birth weight and postnatal growth patterns on fat depth and plasma leptin concentrationsin juvenile and adult pigs.J.Physiol.2004)研究发现，初生重较低的猪生长速度较慢，从而使其进入市场的时间增加。另有研究表明仔猪的初生重与育成率亦悉悉相关，初生重在1.0Kg以下时仔猪育成率随着初生重的增加而上升；初生重在1.0Kg以上时仔猪育成率没有明显的规律。初生重小于等于0.5Kg时仔猪育成率仅为55.56％(高建国.二花脸猪初生重对出生后生长速度及育成率的影响[J].畜牧与兽医，1992，24(1)：26)，Gondret，F.L.等(Gondret，F.L.等，Low birth weight is associated with enlarged muscle fiber area and impaired meat tendesness ofthe longissimus muscle in pigs.J.Anim.Sci.2006)和Wolter等(Wolter，B.F.等The effect of birthweight and feeding of supplement milk replacer to piglets during lactation on preweaning andpostweaning growth performance and carcass characteristic.J.Anim.Sci.2002)研究报道称，猪出生重与出生后早期的生长速度相关，初生重小的胎儿初生重大的胎儿更虚弱，出生后需要更好地环境条件来保证它的存活。因此，对猪初生重相关基因的克隆和鉴定可为解释猪和其它哺乳动物胎儿生长发育的遗传机制提供重要线索，并为猪的繁殖性状遗传改良提供理论依据。猪在妊娠期，绒毛膜上皮和子宫内膜上皮形成皱褶，褶皱折叠水平影响着胎盘的相对大小，胎盘的相对大小是影响胎儿存活的主要因素之一，胎儿的存活率又与猪初生重具有重要的关系。

粘多糖(Glycosaminoglycans，GAG)是ECM的主要组成成分之一，硫酸类肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans，HPSGs)在胚胎发育、形态发生、血管生成、上皮间叶细胞间的相互作用中起着主要作用，肝素蛋白酶(heparannase，HPSE)是一类可以裂解连接于HPSGs核心分子上硫酸肝素的一类内切糖苷酶，HPSE主要降解硫酸类肝素，是猪胎盘中最丰富的一种糖胺聚糖(GAG)。即HPSE可以降解胎盘基质，使胎盘更好的发育形成，为胎儿的发育创造了良好的条件，进而影响胎儿的初生重，最终影响胎儿出生后的成活和生长速度。因此推测HPSE可能与胎儿的初生重具有重要的关系。

与本发明密切相关的研究成果是本申请人(专利权人)前期工作的基础，在申请人华中农业大学2010年公开的专利文献中(公开号：CN101892225A，公开日：2010.11.24)，涉及到一种发明名称为HPSE基因作为猪免疫性状相关的分子标记及其应用(专利号：ZL 201010223062.0)该专利文献报道了利用HPSE基因的特异片段检测猪免疫性状的关联分析和应用。但该分子标记并未涉及与猪繁殖性状特别是与猪初生重相关性状关联分析中的应用(用途)。

发明内容

发明的目的在于寻找HPSE基因的片段作为一个分子标记在猪初生重性状关联分析中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

一种分子标记Alu I-RFLP在猪初生重性状关联分析中的应用，其步骤如下所述：

1)用人HPSE基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性80％以上的表达序列标签(EST)，然后对EST进行拼接；提取猪肺脏组织总RNA并做cDNA第一链反转录；设计引物对，该引物对的正向引物为5’-AGCCAGGTGAGCCCGAGATG-3’，反向引物为5’-GCATCTGCTCGTGTTCCTAC-3’(见序列表SEQ ID NO：9，10)，用RT-PCR方法扩增猪HPSE基因的cDNA片段，PCR产物纯化克隆和测序，通过序列分析获得如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；

2)根据SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列设计引物对，该引物对的核苷酸序列如下所示：正向引物：5′-GGATGAAGGCTGGTATTT-3′，反向引物：5′-TGGGATAAGGCAATACAG-3′(见序列表SEQ ID NO：3，4)，扩增猪基因组DNA，将PCR产物纯化克隆和测序，通过序列分析获得如下所述的核苷酸序列：

GGATGAAGGCTGGTATTTACATTGATGGATTTCAGTTAGGAGAAGATTTTATTGACTTGCACAAACTTCTAAGAAAATCRGCTTTCAAAAATGCAAAACTCTATGGTCCTGATATTAGCCAGCCTCGACGAAAGAATGCTGAGATGCTGAAGAGGTAAGAGTGAGAGGAAGCAGAACCACTTTTCTTAAAAATAATATTTTCCTGTGGTGGAGACTCCTCAACAAACCACCTAATATTAAACGATTTGCTGCCTGACTTGAAGGTTTACCAAAAGAGGAAACAGTGATTGGCTCAGAAGACCAAAGATTTTGTGACAAATGGCACCATGATAAAATTTGTTTCAGAATTAGGAAGTCTGTATTGCCTTATCCCA

上述序列中的R是A或G，导致Alu I-RFLP多态性；

3)检测目的基因HPSE mRNA在猪胎盘的绒毛膜组织样中转录水平的表达，设计用于检测目的基因HPSE mRNA表达水平的引物对以及作为内参基因GAPDH的引物对，其核苷酸序列分别如下所示：

目的基因HPSE的引物对：

正向引物：5′GTTTGTCTCCCGCATACCTGA 3′，

反向引物：5′CAAGTCCAGTCCTGAGCAAT 3′，(见序列表SEQ ID NO：5，6)

内参基因GAPDH的引物对：

正向引物：5′ATCCCGCCAACATCAAAT 3′，

反向引物：5′CACGCCCATCACAAACAT 3′；(见序列表SEQ ID NO：7，8)

4)定位HPSE基因的mRNA在猪胎盘组织的表达位置；

5)应用PCR-RFLP方法对序列表SEQ ID NO：1的第80位碱基进行检测，然后进行基因型与猪初生重性状的关联分析。

在本申请人的公开号：CN101892225A，公开日：2010.11.24，发明名称：HPSE基因作为猪免疫性状相关的分子标记及其应用，专利号：ZL 201010223062.0文献中，报道了从猪HPSE基因片段中克隆得到一种与免疫性状相关的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所述，获得HPSE基因第五外显子上g.80A＞G突变位点，该突变位点是同义突变。针对该突变位点所设计HPSE-SNP-(正向引物和反向引物)引物扩增出完整的第五外显子和部分内含子，该片段上第80bp处的A/G突变可被限制性内切酶Alu I(AG CT)所识别。即在序列表SEQ ID NO：1(见图1)所示序列的第80位碱基处有一个R(A/G)的碱基突变，该突变位于第5外显子内，导致Alu I-RFLP多态性。

同时通过荧光定量PCR检测了HPSE基因在大白猪和梅山猪两个品种妊娠的第26天、50天、95天和114天的绒毛膜组织样中转录水平的表达水平，结果(如图2所述)表明，HPSE基因在妊娠50天大白猪绒毛膜组织中的表达显著高于梅山猪；在妊娠50天大白猪和梅山猪猪绒毛膜组织中的表达都显著性低于26天、95天和114天。可能暗示着在妊娠50天时，胎盘发育达到一个“相对静止”状态。同时妊娠50天正处于猪妊娠的中期，申请人通过原位杂交技术确定了HPSE基因在大白猪和梅山猪两个品种妊娠的第26天、50天、95天在胎盘中的表达位置，结果表明在妊娠25天和95天猪绒毛膜滋养层上皮细胞检测到了HPSEmRNA的表达，妊娠50天的胎盘组织中没有检测到阳性信号(如图3所示)，HPSE基因在猪胎盘组织中的时期特异性表达说明其在胎盘发育及功能中有重要作用，因而可能对猪的初生重具有重要影响。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明制备的分子标记的核苷酸序列，序列全长为374bp，在该序列的第80bp处有一个A/G突变，导致Alu I-RFLP多态性。

序列表SEQ ID NO：2是扩增的HPSE基因的cDNA序列，序列全长为1735bp。

序列表SEQ ID NO：3-10是设计的引物序列(这些引物序列与说明书正文中的序列一致)。

图1：是本发明HPSE基因制备的流程图。

图2：本发明中猪HPSE基因用于PCR-RFLP检测的DNA片段(下划线部分为引物，英文字母R代表突变位点，(A/G)为等位基因突变)。

图3：猪胎盘组织中肝素蛋白酶mRNA表达量qPCR检测结果(纵坐标表示目的基因HPSE mRNA转录水平的相对表达量，横坐标表示梅山猪和大白猪的不同妊娠时间：Y26d，大白猪妊娠26天；M26d，梅山猪妊娠26天；Y50d，大白猪妊娠50天；M50d，梅山猪妊娠50天；M95d，梅山猪妊娠95天；Y95d，大白猪妊娠95天；M114d，梅山猪妊娠114天；Y114d，大白猪妊娠114天)。

图4：猪胎盘组织中肝素蛋白酶(HPSE)mRNA定位结果，阳性信号如图中箭头所示，(左图中的阳性对照和阴性对照是通过普通光学显微镜(奥林巴斯DH-2，日本)拍摄，可以清楚定位阳性信号的具体所在位置；右图中的荧光图和白光图是通过荧光显微镜(尼康ECLIPSE TE2000-S，日本)拍摄，可以明确阳性信号的强弱)。

图5：本发明中猪HPSE基因Alu I-RFLP的三种基因型(AA AG GG)电泳结果。图中M：DNA分子量标准(marker I，购自普博欣公司)。

具体实施方式

实施例1HPSE基因的克隆

(1)引物设计

引物设计工作参照申请人前期工作的基础(专利文献公开号：CN101892225A，公开日：2010.11.24，发明名称：HPSE基因作为猪免疫性状相关的分子标记及其应用，专利号：ZL 201010223062.0)，用人HPSE基因cDNA(GenBank收录号：NM_006665.3)为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为80％以上的ESTs(片段长度大于100bp)，将这些ESTs的收录号在NCBI中用ENTREZ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Search/index.html)查询相应序列，然后用GeneTool中的ASSEMBLY程序构建猪EST-重叠群。根据EST拼接序列设计一对引物，其核苷酸序列如下所述：

HPSE：正向引物：5′-AGCCAGGTGAGCCCGAGATG-3′，

反向引物：5′-GCATCTGCTCGTGTTCCTAC-3′。

(2)PCR产物的克隆和测序

将纯化后的PCR产物与pMD-18T载体，购自宝生物工程(大连)有限公司，在4℃水浴过夜连接；无菌状态下取100-120μl感受态细胞于1.5ml Ependorff管中，将5μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，后冰浴3-4min，加入400ul无抗生素的LB液体培养基，于37℃振荡培养45min。取100μl上述LB涂布于异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)X-gal的琼脂平板上，于37℃平放1h后倒置培养。挑取平板上的单菌落，接种于2-3ml LB中，于37℃，300r/min培养过夜。用1.5ml EP管12000r/min离心30秒收集菌体制备少量质粒。将验证后的重组质粒采用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上进行测序，序列测定由委托北京奥科生物技术有限公司完成。用GeneTooll.0软件中的ASSEMBLY程序进行拼接，得到一条长度为如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，其长度为1735bp。

DNA序列同源性检索鉴定：

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。检索结果表明所测序列与人HPSE基因DNA(GenBank收录号：NM_006665.3)的部分序列同源性达83％。

实施例2.HPSE基因在胎盘组织中mRNA表达量的荧光定量检测

(1)猪绒毛膜组织样品采集

选取纯种的梅山猪和大白青年母猪(来自华中农业大学精品猪场)为研究对象，通过人工受精，用一头纯种梅山公猪(来自华中农业大学精品猪场)与梅山母猪配种，用一头纯种大白公猪与大白母猪(来自自华中农业大学精品猪场)配种，连续两天进行配种。在妊娠的第26天、50天、95天和114天(每个时期每个品种(梅山猪和大白青年母猪)的妊娠母猪各2头)分别进行屠宰采集猪胎盘的绒毛膜组织样品。

(2)组织总RNA的提取

梅山和大白猪子宫内膜组织样品的总RNA的提取采用天根生化科技(北京)有限公司的动物组织总RNA提取试剂盒(货号：DP431)，具体操作步骤详见该试剂盒说明书。提取的RNA用Thermo scientific公司的NanoDrop 2000核酸蛋白测定仪测定总RNA浓度。

(3)第一链cDNA的合成

在DEPC处理过的无RNase污染的的0.2mL的离心管中加入2μg的总RNA与0.4μg的oligo(dT)引物和0.1μg的随机引物，70℃温育5min以解开总RNA的二级结构，迅速置于冰上以防二级结构复性。然后一次加入：10μL 5×反转录缓冲液，2.5μL 10mmol/L dNTP mix，1μL RNase inhibitor，1.5μL M-MLV反转录酶(200U/μL)，用无核酸酶水(万分之一的DEPC水，通过高温高压灭菌)将终体积补至50μL，混匀离心后于37℃温育10min，42℃温育50min，在85℃温育5min以灭活反转录酶。反转录后的cDNA(GenBank收录号：NM_001146130.2)可于-20℃保存3个月。

(4)用于荧光定量PCR检测的引物设计

从NCBI的Genebank下载目的基因HPSE(GenBank收录号：NM_001146130.2)和内参基因GAPDH(GenBank收录号：NM_001206359.1)的mRNA序列，采用primer5.0设计引物，其核苷酸序列分别如下所述：

目的基因HPSE的引物对：

正向引物：5′GTTTGTCTCCCGCATACCTGA 3′，

反向引物：5′CAAGTCCAGTCCTGAGCAAT 3′，

内参基因GAPDH的引物对：

正向引物：5′ATCCCGCCAACATCAAAT 3′，

反向引物：5′CACGCCCATCACAAACAT 3′；

利用Mfold网站验证引物的特异性9http://mfold.rna.albany.edu/？q＝mfold/DNA-Folding-Form)。

(5)荧光定量检测

反应体系(总体积)为20μl，其中cDNA各0.5μl，SYBR green I Mix 10μl，正、反向引物各0.3μM，余下体积用灭菌纯净水补足。样品在96孔板混合均匀后直接放入Roche实时定量PCR仪(型号Roche 410)上进行扩增反应，反应程序为95℃3min，40个循环，94℃20s，60℃30s，72℃20s，最后做融解曲线从55℃-90℃每分钟上升0.5℃。

(6)定量PCR数据分析

目的基因HPSE的各个样品都与内参基因GAPDH的引物同时扩增，反应的相对量以目标基因HPSE与内参基因GAPDH的Ct值(取三个重复的平均值)的差值ΔCt计算，再选取ΔCt最大作为参照，用其它样品的ΔCt减去参照ΔCt得到ΔΔCt，Ct值大于35的视为无效数据。最后各基因的相对表达水平用PfaffI(Michael W.Pfaffl，A new mathematical model for relativequantification inreal-time RT-PCR，2001)方法计算，具体公式如下：

$\mathrm{ratio}=\frac{{\left(E_{t\arg \mathrm{et}}\right)}^{{\mathrm{\ΔCP}}_{t\arg \mathrm{et}}(\mathrm{control}-\mathrm{sample})}}{{\left(E_{\mathrm{ref}}\right)}^{{\mathrm{\ΔCP}}_{\mathrm{ref}}(\mathrm{control}-\mathrm{sample})}}$

(7)荧光定量PCR结果

结果表明(如图3所述)，妊娠50天时，HPSE基因在大白猪绒毛膜组织中的表达显著高于梅山猪，与妊娠26天、95天和114天相比，HPSE基因在大白猪和梅山猪胎盘绒毛膜组织中的表达都显著性降低，这种表达模式说明HPSE基因在胎盘发育及功能中有重要作用，因而可能对猪的初生重具有重要影响。

实施例3HPSE基因mRNA在猪胎盘组织中的原位表达定位检测

(1)样品采集

采集大白猪妊娠第26天、51天和梅山猪95天的猪胎盘组织样，切成1cm×2cm组织块，浸泡在4％的多聚甲醛溶液中24h-48h。

(2)石蜡切片制作

1)水洗：将上步得到的猪胎盘组织置于脱水盒中，流水冲洗约12h。

2)脱水：将上步处理后的猪胎盘组织放在脱水盒中依次用梯度浓度(50％(2h)，70％，(过夜)80％(2h)，95％(2h)，100％I(2h)，100％II(2h))酒精脱水至100％无水乙醇；

3)透明：将上步处理后的猪胎盘组织经过1∶1(体积比)的无水乙醇二甲苯和二次二甲苯透明各一小时。

4)浸蜡与包埋：将上步处理得到的已透明的猪胎盘组织块投入熔化的石蜡内进行包埋。

5)切片：切片厚度6微米；56℃水浴展片，用多聚赖氨酸处理过的玻片捞片，然后放入30℃温箱。

(3)原位杂交

为了确定HPSE基因mRNA在猪胎盘组织中的原位表达位置，采用Affymetrix公司(美国)提供的viewRNA试剂盒(QuantiGene ViewRNA ISH Tissue Assay Kit，Lot：2711121；QuantiGeneViewRNA Chromogrnic Signal Amplification Kit，Lot：2711121；QuantiGene ViewRNA TYPE1Probe Set(s))具体操作步骤详见该试剂盒说明书；同时也可以参考Honkavuori和Lee，K.，et al等的报道(Honkavuori，K.S.，et al.，Novel Picornavirus in Turkey poults with hepatitis，California，USA.Emerg Infect Dis，2011.17(3)：480-7.和Lee，K.，et al.，Precursor miR-886，a novel noncodingRNA repressed in cancer，associates with PKR and modulates its activity.RNA，2011.17(6)：1076-89.)中的主要步骤。

(4)猪胎盘组织中肝素蛋白酶(HPSE)mRNA定位结果

在妊娠25天和95天猪绒毛膜滋养层上皮细胞检测到了HPSE mRNA的表达，妊娠50天的胎盘组织中没有检测到阳性信号(图4所示)，与实施例3中妊娠50天HPSE mRNA表达量极显著性的低于妊娠第26天、95天和114天三个时期的结果完全相吻合。

实施例4PCR-RFLP诊断方法的建立

(1)引物序列(引自公开号：CN101892225A，公开日：2010.11.24“HPSE基因作为猪免疫性状相关的分子标记及其应用”，专利号：ZL 201010223062.0专利文献)

正向引物：5′-GGATGAAGGCTGGTATTT-3′

反向引物：5′-TGGGATAAGGCAATACAG-3′

(2)PCR扩增条件

PCR反应总体积20μl，其中猪基因组DNA约100ng，含1倍的缓冲液(购自Promega公司)，1.5mmol/L MgCl2，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.4μmol/L，2U TaqDNA聚合酶(购自Promega公司)。PCR扩增程序是：94℃3min，循环35次94℃30s，54℃30s，然后72℃25s，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。得到374bp特异扩增片段，该片段位于第4-5内含子内(如图2和序列表SEQ ID NO：1所示的序列)。测序的结果发现在该374bp片段中存在一个Alu I酶切位点(AG↓CT)，其中第80bp处为多态性位点，位于外显子5中。

(3)PCR-RFLP检测条件

PCR产物酶切反应体积是10μl，其中1×buffer 1μl，PCR产物3-5μl，限制性内切酶Alu I为0.3μl(10U)，用H₂O补足10μl，将样品混匀后离心，37℃水浴4h，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。对该位点两个纯合子的测序结果显示，当第80bp位置是G时，则该Alu I酶切位点不存在，Alu I酶切后检测结果只有1个片段，长度是374bp(定为等位基因G)；但存在G80→A80替换时，其结果导致第80bp处一个Alu I酶切位点的产生，得到2个片段，长度分别为294bp和80bp(定为等位基因A)，三种基因型AA，AG，GG(如图5所述)。

(4)本发明的分子标记在猪初生重标记性状关联分析中的应用

实验猪群来自广东华农温氏畜牧股份有限公司水台原种猪场的长白猪(为国外猪种血缘)，父母代为17头长白猪公猪和36头长白猪母猪，子一代长白猪共302头仔猪的血样并采集基因组DNA，DNA的提取按照常规苯酚/氯仿抽提法(参考J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等翻译的分子克隆实验指南第三版(2002)，科学出版社，463-470页)，其具体步骤如下所述：

第一步：过夜消化：2ml全血+2ml裂解液(Tris/EDTA/SDS)+20μl蛋白酶k，55℃，摇床水浴，过夜消化。

第二步：酚仿醇抽提

1)Tris-饱和酚抽提

4ml Tris-饱和酚，轻轻地上下颠倒混匀10分钟，离心(4℃，5000r/min，15min)，用剪掉尖嘴的大口径枪头转移上清至一新的离心管。

2)重复抽提

4mlTris-饱和酚，轻轻地上下颠倒混匀10分钟，离心(4℃，5000r/min，15min)，用剪掉尖嘴的大口径枪头转移上清至一新的离心管。

3)酚仿醇抽提

4ml酚/仿/醇(体积比为25∶24∶1)，轻轻地上下颠倒混匀10分钟，离心(4℃，5000r/min，15min)，用剪掉尖嘴的大口径枪头转移上清至一新的离心管。

4)氯仿/异戊醇抽提

4ml酚/仿(体积比为24∶1)，轻轻地上下颠倒混匀10分钟，离心(4℃，5000r/min，15min)，用剪掉尖嘴的大口径枪头转移上清至一新的离心管。

5)沉淀DNA

4ml无水乙醇，轻微震荡，析出絮状DNA，-20℃放置1h-3h。

6)洗涤DNA

用剪口黄枪头将DNA吸至1.5ml离心管中，加入1-1.5ml 75％乙醇，洗涤，离心(4℃，3000rpm，5min)，弃乙醇。

7)重复洗涤

加入1-1.5ml 75％乙醇，洗涤，离心(4℃，3000rpm，5min)，弃乙。

8)自然晾干。

本试验共确定了284头长白猪的基因型，并进行基因型与初生重关联分析，具体模型如下：Y＝μ+Genotype_i+Sex_j+Environment_l+Sire_m+Dam_n(Sire_m)+ε_ijlmn，其中Y为性状观测值；μ为总体均数；Genotype_i为基因型效应；Sex_j为性别效应；Environment_l为环境效应；Sire_m为公畜效应；Dam_n(Sire_m)为公畜内的母畜效应；ε_ijlmn随机误差，假定ε_ijlmn独立，服从N(0，σ²)分布，基因型检测结果表明在284个个体中AA基因型有48个，AG基因型有132个个体，GG基因型有104个个体。基因型与性状关联分析的结果表明：HPSE基因与初生重呈显著相关。

由表1可知，HPSE基因SNP位点对初生重有显著影响(P＜0.05)，其中AG基因型个体的初生重显著高于AA基因型个体的对应值，GG基因型个体居中，因此可以看出AA基因型个体的初生重较低。

表1.肝素蛋白酶(HPSE)SNP性状关联分析结果

注：*表示P＜0.05。表中性状值为平均数±标准误。

Claims (1)

1.一种分子标记Alu I-RFLP在猪初生重性状关联分析中的应用，其特征在于下列步骤：

1)用人HPSE基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性80％以上的表达序列标签(EST)，然后对EST进行拼接；提取猪肺脏组织总RNA并做cDNA第一链反转录；设计引物对，该引物对的正向引物为5’-AGCCAGGTGAGCCCGAGATG-3’，反向引物为5’-GCATCTGCTCGTGTTCCTAC-3’，用RT-PCR方法扩增猪HPSE基因的cDNA片段，PCR产物纯化克隆和测序，通过序列分析获得如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；

2)根据SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列设计引物对，该引物对的核苷酸序列如下所示：

正向引物：5′-GGATGAAGGCTGGTATTT-3′，反向引物：5′-TGGGATAAGGCAATACAG-3′，扩增猪基因组DNA，将PCR产物纯化克隆和测序，通过序列分析获得如下所述的核苷酸序列：

GGATGAAGGCTGGTATTTACATTGATGGATTTCAGTTAGGAGAAGATTTTATTGACTTGCACAAACTTCTAAGAAAATCRGCTTTCAAAAATGCAAAACTCTATGGTCCTGATATTAGCCAGCCTCGACGAAAGAATGCTGAGATGCTGAAGAGGTAAGAGTGAGAGGAAGCAGAACCACTTTTCTTAAAAATAATATTTTCCTGTGGTGGAGACTCCTCAACAAACCACCTAATATTAAACGATTTGCTGCCTGACTTGAAGGTTTACCAAAAGAGGAAACAGTGATTGGCTCAGAAGACCAAAGATTTTGTGACAAATGGCACCATGATAAAATTTGTTTCAGAATTAGGAAGTCTGTATTGCCTTATCCCA

上述序列中的R是A或G，导致Alu I-RFLP多态性；

3)检测目的基因HPSE mRNA在猪胎盘绒毛膜组织样中转录水平的表达，设计用于检测目的基因HPSE mRNA表达水平的引物对以及作为内参基因GAPDH的引物对，其核苷酸序列分别如下所示：

目的基因HPSE的引物对：

正向引物：5′GTTTGTCTCCCGCATACCTGA 3′，

反向引物：5′CAAGTCCAGTCCTGAGCAAT 3′；

内参基因GAPDH的引物对：

正向引物：5′ATCCCGCCAACATCAAAT3′，

反向引物：5′CACGCCCATCACAAACAT3′；

4)定位目的基因HPSE基因的mRNA在猪胎盘组织的表达位置；

5)应用PCR-RFLP方法对序列表SEQ ID NO：1的第80位碱基进行检测，然后对基因型与猪初生重性状进行关联分析。

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