CN103251645A - Polyflavanostilbene A在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及Polyflavanostilbene A在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用。Polyflavanostilbene A可通过调节血脂、保护内皮细胞而起到抗动脉粥样硬化的作用。用Polyflavanostilbene A制备的抗动脉粥样硬化的药物对动脉粥样硬化具有较好的疗效，可以用来抗人或动物的动脉粥样硬化。本发明涉及的Polyflavanostilbene A在制备抗动脉粥样硬化药物中的用途属于首次公开，由于骨架类型属于全新的骨架类型，而且其对于动脉粥样硬化的抑制活性强得意想不到，不存在由其他化合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性特点，同时用于抗动脉粥样硬化显然具有显著的进步。

Description

Polyflavanostilbene A在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用

技术领域

本发明涉及化合物Polyflavanostilbene A的新用途，尤其涉及Polyflavanostilbene A在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用。

背景技术

心脑血管疾病是当代危害人体健康和生命的最严重病症，是中、老年人的常见病和多发病，在许多国家和地区的发病率和死亡率皆位于重病之首。动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是心脑血管疾病的主要病理基础，迄今为止其病因和发病机理尚未完全阐明，故目前没有简明有效地防治措施和治疗药物。

本发明涉及的化合物Polyflavanostilbene A是一个2013年发表（Fushuang Li,etal.,2013.Polyflavanostilbene A,a New Flavanol-Fused Stilbene Glycoside fromPolygonum cuspidatum.Organic Letters3(15),674–677.）的新化合物，该化合物拥有全新的骨架类型，还没发现其药理活性（Fushuang Li,et al.,2013.PolyflavanostilbeneA,a New Flavanol-Fused Stilbene Glycoside from Polygonum cuspidatum.OrganicLetters3(15),674–677.），对于本发明涉及的Polyflavanostilbene A在制备治疗动脉粥样硬化药物中的用途属于首次公开，由于属于全新的结构类型，而且其对于动脉粥样硬化的抑制活性强得意想不到，不存在由其他化合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性特点，同时用于动脉粥样硬化的防治显然具有显著的进步。

发明内容

本发明就是针对上述问题提供Polyflavanostilbene A在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用，用Polyflavanostilbene A制备的抗动脉粥样硬化的药物，具有较好的疗效。

本发明提供的技术方案是：Polyflavanostilbene A在制备抗动脉粥样硬化药物中的作用。

本发明可用作抗人或动物的动脉粥样硬化。本发明所述药物可通过口服或静脉注射给予。本领域技术人员可根据实际情况容易地确定给药剂量。

所述化合物Polyflavanostilbene A,结构如式（Ⅰ）所示：

对于本发明涉及的Polyflavanostilbene A在制备治疗动脉粥样硬化药物中的用途属于首次公开，由于骨架类型属于全新的骨架类型，而且其对于动脉粥样硬化细胞的抑制活性强得意想不到，不存在由其他化合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性特点，同时用于动脉粥样硬化的防治显然具有显著的进步。

以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的保护范围不受具体实施例的任何限制，而是由权利要求加以限定。

具体实施方式

本发明所涉及化合物Polyflavanostilbene A的制备方法参见文献（Fushuang Li,etal.,2013.Polyflavanostilbene A,a New Flavanol-Fused Stilbene Glycoside fromPolygonum cuspidatum.Organic Letters3(15),674–677.）

以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的保护范围不受具体实施例的任何限制，而是由权利要求加以限定。

实施例1：本发明所涉及化合物Polyflavanostilbene A片剂的制备：

取20克化合物Polyflavanostilbene A,加入制备片剂的常规辅料180克，混匀，常规压片机制成1000片。

实施例2：本发明所涉及化合物Polyflavanostilbene A胶囊剂的制备：

取20克化合物Polyflavanostilbene A，加入制备胶囊剂的常规辅料如淀粉180克，混匀，装胶囊制成1000粒。

下面通过药效学实验来进一步说明其药物活性。

本发明通过细胞水平的研究及建立动脉粥样硬化模型等技术揭示了PolyflavanostilbeneA对动脉粥样硬化的作用。

本发明经口及静脉注射给予Polyflavanostilbene A，可使动脉粥样硬化大鼠斑块面积/内膜面积（%）、内膜厚度（um）/中膜厚度（%）显著降低；使血中甘油三酯、总胆固醇及低密度脂蛋白含量下降，表明Polyflavanostilbene A可治疗动脉粥样硬化。

材料与方法

1.实验材料：

1.1动物和饲料

实验动物：健康大鼠，雌雄各半，体重（200.0±20）g。

饲料：基础饲料由江苏省实验动物中心提供；高脂饲料由2%的胆固醇、10%的猪油和88%的基础饲料组成，由江苏省实验动物中心加工完成。

1.2药品及试剂

胆固醇试剂盒：南京建成生物工程研究所；

甘油三酯试剂盒：南京建成生物工程研究所；

高密度脂蛋白试剂盒：南京建成生物工程研究所；

低密度脂蛋白试剂盒：南京建成生物工程研究所；

考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；

MDA测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；

SOD测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；

1.3器材

美国雅培AEROSET全自动生化分析仪；

JY601电子天平：上海海康电子仪器厂；

TN-100B型托盘扭力天平：上海上平仪器公司；

OLYMPUS倒置型系统显微镜；

WF10X-18MM光学显微镜：重庆光学仪器厂；

TGL-16G离心机：上海安亭科技仪器厂

1.实验方法：

2.1内皮细胞培养及Polyflavanostilbene A作用研究

2.1.1建立高脂血清损伤的内皮细胞模型

取健康日本大耳白兔6只，每日饲喂高脂饲料（2%胆固醇，10%猪油，88%基础饲料），4周后无菌条件下心脏取血5ml，分离血清，合并，56℃水浴30min灭活处理，再以0.45及0.22双层微孔滤膜过滤后，-30冷冻保存备用。

2.1.2细胞培养和传代

将传代培养的人脐静脉内皮细胞株ECV304培养于含20%小牛血清、2mmol/LL-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100g/L链霉素的DMEM培养基中。用0,25%胰蛋白酶液与0.02%EDTA（1:1）消化传代。接种于100ml培养瓶中，送入5%CO2培养箱中培养。以备实验用。Polyflavanostilbene A，临用前用无血清培养基稀释。

2.1.3分组

取对数生长期的细胞用于实验。细胞加处理因素前24h更换无血清培养基，使细胞同步化至G1期，然后随机分5组：对照组、高脂血清组、Aphanamixoid A组0.4μg/ml组、Aphanamixoid A组2μg/ml组、Aphanamixoid A组10μg/ml组。其中对照组：加无血清DMEM培养基；高脂血清组：加含5%高脂血清DMEM培养基。

2.1.4MTT法检测细胞存活率

将生长良好的EVC304细胞制备成5×107个·L-1的细胞悬液，按每孔0.1ml接种于96孔板，37℃，5%CO2温育24h，无血清同步化处理及分组同上。各组细胞作用24h后，每孔加入20ul MTT（5.0g·L-1），37℃孵育4h，弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜100ul，充分细胞存活率（%）=处理组A570/对照组A570×100%

2.1.5MDA和SOD含量测定

细胞分组及处理同上。作用24h后弃去上清液，用PBS洗3次后每孔加入0.5ml细胞裂解液（150mmol/L NaCl，150mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，1%TritonX-100），待细胞充分裂解后，参照MDA和SOD检测试剂盒说明书测定细胞MDA含量。

2.2Polyflavanostilbene A对高脂动物的影响

2.2.1动物以基础饲料喂养1w，作为适应期。随机等分为6组：正常组、模型组、Polyflavanostilbene A低剂量组（400μg/kg）、Polyflavanostilbene A中剂量组（2000μg/kg）、Polyflavanostilbene A高剂量组（10000μg/kg）和多烯康对照组。正常组喂以基础饲料100g·只-1·d-1；模型组及其他给药组喂以高脂饲料20g·100g-1·d-1，给药组每天经口或注射给予相应剂量的Polyflavanostilbene A药物，连续给药20d。

2.2.2指标的测定

2.2.2.1血脂的测定

于给药后20d，将动物禁食不禁水12h，心脏采血，3000rpm·min-1离心10min，取上层血清0.5ml，测定。利用美国雅培AEROSET全自动生化分析仪，分别以氧化酶法测定TG、TC含量，直接测定法测定HDLC、LDLC的含量。

2.2.2.2主动脉斑块的病变分级

动物处死后，立即摘取主动脉（自心脏至髂动脉分叉处），将其上的脂肪组织剔除，于背侧面纵行切开，用10%的甲醛溶液固定，苏丹IV染色，使斑块呈红色，铺平，照像。

图像分析仪测定斑块面积及血管内膜总面积，并计算斑块/血管内膜面积比。

按以下规定进行分级：

0级：无病变

1级：病变占1%-25%；

2级：病变占26%-50%；

3级：病变占51%-75%；

4级：病变占76%-100%。

2.2.2.3血清MDA及SOD的测定

动物心脏采血，3000rpm·min-1离心10min，取上清，用生理盐水稀释5倍，混匀待测。采用MDA试剂盒测定MDA含量及SOD活性。

实验结果

（1）Polyflavanostilbene A对高脂血清损伤的内皮细胞细胞存活率的影响

高脂血清能显著降低内皮细胞的细胞存活率（P<0.01），Polyflavanostilbene A0.004mg/ml、Polyflavanostilbene A0.02mg/ml、Polyflavanostilbene A0.1mg/ml三个浓度能不同程度抑制高脂血清引起的细胞存活率的降低（P<0.05，P<0.01，P<0.01）。

表1Polyflavanostilbene A对高脂血清损伤的内皮细胞细胞存活率的影响（x±s，n=6）

与正常组相比*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比^▲P<0.05，^▲▲P<0.01

（2）Polyflavanostilbene A对高脂血清损伤的内皮细胞MDA和SOD含量的影响

高脂血清能显著升高内皮细胞中MDA的含量（P<0.01），SOD含量变化不明显。Polyflavanostilbene A能不同程度抑制高脂血清引起的MDA含量的升高，提高血清SOD酶活性。

表2Polyflavanostilbene A对高脂血清损伤的内皮细胞MDA和SOD的影响（x±s，n=4）

与正常组相比*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比^▲P<0.05，^▲▲P<0.01

（3）Polyflavanostilbene A对高脂饮食大鼠血脂的影响

与正常组相比，模型组甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）、低密度脂蛋白LDLC的含量均显著升高（P<0.01），高密度脂蛋白（HDLC）无明显影响；与模型组相比，PolyflavanostilbeneA组和多烯康对照组TC、LDLC的含量均显著降低（P<0.01），对HDLC无明显影响。

表3Polyflavanostilbene A对高脂饮食大鼠血脂的影响（x±s，n=4）

与正常组相比*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比^▲P<0.05，^▲▲P<0.01

（4）Polyflavanostilbene A对高脂致动脉粥样硬化大鼠主动脉斑块的病变分级的影响与模型组相比，Polyflavanostilbene A中剂量组斑块面积/内膜面积（%）、内膜厚度（um）、内膜厚度/中膜厚度（%）均显著降低（P<0.05），Polyflavanostilbene A高剂量组合多烯康对照组斑块面积/内膜面积（%）、内膜厚度（um）、内膜厚度/中膜厚度（%）均显著降低（P<0.01）。

表4Polyflavanostilbene A对高脂致动脉粥样硬化大鼠主动脉斑块面积/内膜面积（%）、内膜厚度/中膜厚度（%）的影响（x±s，n=4）

与模型组相比^▲P<0.05，^▲▲P<0.01

（5）Polyflavanostilbene A对高脂致动脉粥样硬化大鼠血清MDA、SOD的影响

与正常组相比，模型组血清中MDA的含量显著升高（P<0.01），SOD活性显著下降；与模型组相比，AA中、高剂量组血清中MDA的含量均显著降低（P<0.05，P<0.05），SOD的含量显著升高（P<0.05）。

表5Polyflavanostilbene A对高脂致动脉粥样硬化大鼠血清中MDA、SOD的影响（x±s，n=4）

与正常组相比**P<0.01；与模型组相比^▲P<0.05，^▲▲P<0.01

结论：Polyflavanostilbene A能够显著抑制动脉粥样硬化，可以用来制备抗动脉粥样硬化药物。

Claims (1)

1.Polyflavanostilbene A在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用，所述化合物Polyflavanostilbene A结构如式（Ⅰ）所示：

式（Ⅰ）。