CN103120675A - Eryngiolide A在治疗动脉粥样硬化药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及Eryngiolide A在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用。Eryngiolide A可通过调节血脂、保护内皮细胞而起到抗动脉粥样硬化的作用。用Eryngiolide A制备的抗动脉粥样硬化的药物对动脉粥样硬化具有较好的疗效，可以用来抗人或动物的动脉粥样硬化。本发明涉及的Eryngiolide A在制备抗动脉粥样硬化药物中的用途属于首次公开，由于骨架类型属于全新的骨架类型，而且其对于动脉粥样硬化的抑制活性强得意想不到，不存在由其他化合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性特点，同时用于抗动脉粥样硬化显然具有显著的进步。

Description

Eryngiolide A在治疗动脉粥样硬化药物中的应用

技术领域

本发明涉及Eryngiolide A在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用。

背景技术

心脑血管疾病是当代危害人体健康和生命的最严重病症，是中、老年人的常见病和多发病，在许多国家和地区的发病率和死亡率皆位于重病之首。动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是心脑血管疾病的主要病理基础，迄今为止其病因和发病机理尚未完全阐明，故目前没有简明有效地防治措施和治疗药物。

本发明涉及的化合物Eryngiolide A是一个2012年发表（Wang, S.J. et al., 2012. Eryngiolide A, a Cytotoxic Macrocyclic Diterpenoid with an Unusual Cyclododecane Core Skeleton Produced by the Edible Mushroom Pleurotus eryngii. Organic Letters 14 (14), 3672–3675.）的新骨架化合物，该化合物拥有全新的骨架类型，目前的用途仅仅涉及癌细胞的细胞毒活性（Wang, S. J. et al., 2012. Eryngiolide A, aCytotoxic Macrocyclic Diterpenoid with an Unusual Cyclododecane Core Skeleton Produced by the Edible Mushroom Pleurotus eryngii. Organic Letters 14 (14), 3672–3675.），对于本发明涉及的Eryngiolide A在制备抗动脉粥样硬化药物中的用途属于首次公开，由于骨架类型属于全新的骨架类型，而且其对于动脉粥样硬化的抑制活性强得意想不到，不存在由其他化合物给出任何启示的可能，具备突出的实质性特点，同时用于抗动脉粥样硬化显然具有显著的进步。

发明内容

本发明就是针对上述问题提供Eryngiolide A在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用，用Eryngiolide A制备的抗动脉粥样硬化的药物，具有较好的疗效。

本发明提供的技术方案是：Eryngiolide A在制备抗动脉粥样硬化药物中的作用。

本发明可用作抗人或动物的动脉粥样硬化。本发明所述药物可通过口服或静脉注射给予。本领域技术人员可根据实际情况容易地确定给药剂量。

所述化合物Eryngiolide A结构如式（Ⅰ）所示：

具体实施方式

本发明所涉及化合物Eryngiolide A的制备方法参见文献（Wang, S. J. et al., 2012. Eryngiolide A, a Cytotoxic Macrocyclic Diterpenoid with an Unusual Cyclododecane CoreSkeleton Produced by the Edible Mushroom Pleurotus eryngii. Organic Letters 14 (14), 3672–3675.）。

以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的保护范围不受具体实施例的任何限制，而是由权利要求加以限定。

实施例1：本发明所涉及化合物Eryngiolide A片剂的制备：

取20克化合物Eryngiolide A，加入制备片剂的常规辅料180克，混匀，常规压片机制成1000片。

实施例2：本发明所涉及化合物Eryngiolide A胶囊剂的制备：

取20克化合物Eryngiolide A，加入制备胶囊剂的常规辅料如淀粉180克，混匀，装胶囊制成1000片。

下面通过药效学实验来进一步说明其药物活性。

本发明通过细胞水平的研究及建立动脉粥样硬化模型等技术揭示了Eryngiolide A对动脉粥样硬化的作用。

本发明经口及静脉注射给予Eryngiolide A，可使动脉粥样硬化大鼠斑块面积/内膜面积（%）、内膜厚度（um）/中膜厚度（%）显著降低；使血中甘油三酯、总胆固醇及低密度脂蛋白含量下降，表明Eryngiolide A可治疗动脉粥样硬化。

材料与方法

1. 实验材料：

1.1  动物和饲料

实验动物：健康大鼠，雌雄各半，体重（200.0±20）g。

饲料：基础饲料由江苏省实验动物中心提供；高脂饲料由2%的胆固醇、10%的猪油和88%的基础饲料组成，由江苏省实验动物中心加工完成。

1.2  药品及试剂

胆固醇试剂盒：南京建成生物工程研究所；

甘油三酯试剂盒：南京建成生物工程研究所；

高密度脂蛋白试剂盒：南京建成生物工程研究所；

低密度脂蛋白试剂盒：南京建成生物工程研究所；

考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；

MDA测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；

SOD测定试剂盒：南京建成生物工程研究所；

1.3  器材

美国雅培AEROSET全自动生化分析仪；

JY601电子天平：上海海康电子仪器厂；

TN-100B型托盘扭力天平：上海上平仪器公司；

OLYMPUS倒置型系统显微镜；

WF10X-18MM光学显微镜：重庆光学仪器厂；

TGL-16G离心机：上海安亭科技仪器厂

（2）实验方法：

2.1  内皮细胞培养及Eryngiolide A作用研究

2.1.1 建立高脂血清损伤的内皮细胞模型

取健康日本大耳白兔6只，每日饲喂高脂饲料（2%胆固醇，10%猪油，88%基础饲料），4周后无菌条件下心脏取血5ml，分离血清，合并，56℃水浴30min灭活处理，再以0.45及0.22双层微孔滤膜过滤后，-30冷冻保存备用。

2.1.2 细胞培养和传代

将传代培养的人脐静脉内皮细胞株ECV304培养于含20%小牛血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100g/L链霉素的DMEM培养基中。用0,25%胰蛋白酶液与0.02%EDTA（1:1）消化传代。接种于100ml培养瓶中，送入5%CO₂培养箱中培养。以备实验用。

Eryngiolide A，临用前用无血清培养基稀释。

2.1.3 分组

取对数生长期的细胞用于实验。细胞加处理因素前24h更换无血清培养基，使细胞同步化至G₁期，然后随机分5组：对照组、高脂血清组、Aphanamixoid A组0.4 μg/ml组、Aphanamixoid A组2 μg/ml组、Aphanamixoid A组10 μg/ml组。其中对照组：加无血清DMEM培养基；高脂血清组：加含5%高脂血清DMEM培养基。

2.1.4 MTT法检测细胞存活率

将生长良好的EVC304细胞制备成5×10⁷个·L^-1的细胞悬液，按每孔0.1ml接种于96孔板，37℃，5%CO²温育24h，无血清同步化处理及分组同上。各组细胞作用24h后，每孔加入20 ul MTT（5.0g·L^-1），37℃孵育4h，弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜100ul，充分细胞存活率（%）=处理组A₅₇₀/对照组A₅₇₀×100%

2.1.5 MDA和SOD含量测定

细胞分组及处理同上。作用24h后弃去上清液，用PBS洗3次后每孔加入0.5ml细胞裂解液（150 mmol/L NaCl，150 mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，1% TritonX-100），待细胞充分裂解后，参照MDA和SOD检测试剂盒说明书测定细胞MDA含量。

2.2 Eryngiolide A对高脂动物的影响

2.2.1 动物以基础饲料喂养1w，作为适应期。随机等分为6组：正常组、模型组、Eryngiolide A低剂量组（400 μg /kg）、Eryngiolide A中剂量组（2000 μg /kg）、Eryngiolide A高剂量组（10000 μg /kg）和多烯康对照组。正常组喂以基础饲料100g·只^-1·d^-1；模型组及其他给药组喂以高脂饲料20g·100g^-1·d^-1，给药组每天经口或注射给予相应剂量的Eryngiolide A药物，连续给药20d。

2.2.2 指标的测定

2.2.2.1 血脂的测定

于给药后20d，将动物禁食不禁水12h，心脏采血，3000 rpm·min^-1离心10 min，取上层血清0.5 ml，测定。利用美国雅培AEROSET全自动生化分析仪，分别以氧化酶法测定TG、TC含量，直接测定法测定HDLC、LDLC的含量。

2.2.2.2 主动脉斑块的病变分级

动物处死后，立即摘取主动脉（自心脏至髂动脉分叉处），将其上的脂肪组织剔除，于背侧面纵行切开，用10%的甲醛溶液固定，苏丹IV染色，使斑块呈红色，铺平，照像。图像分析仪测定斑块面积及血管内膜总面积，并计算斑块/血管内膜面积比。

按以下规定进行分级：

0级：无病变

1级：病变占1%-25%；

2级：病变占26%-50%；

3级：病变占51%-75%；

4级：病变占76%-100%。

2.2.2.3 血清MDA及SOD的测定

动物心脏采血，3000 rpm·min^-1离心10min，取上清，用生理盐水稀释5倍，混匀待测。采用MDA试剂盒测定MDA含量及SOD活性。

实验结果

1.Eryngiolide A对高脂血清损伤的内皮细胞细胞存活率的影响

高脂血清能显著降低内皮细胞的细胞存活率（P<0.01），Eryngiolide A 0.004mg/ml、Eryngiolide A 0.02mg/ml、Eryngiolide A0.1mg/ml三个浓度能不同程度抑制高脂血清引起的细胞存活率的降低（P<0.05，P<0.01，P<0.01）。

表1 Eryngiolide A对高脂血清损伤的内皮细胞细胞存活率的影响（x±s，n=6）

与正常组相比*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比^▲P<0.05，^▲▲P<0.01

2.Eryngiolide A对高脂血清损伤的内皮细胞MDA和SOD含量的影响

高脂血清能显著升高内皮细胞中MDA的含量（P<0.01），SOD含量变化不明显。Eryngiolide A能不同程度抑制高脂血清引起的MDA含量的升高，提高血清SOD酶活性。

表2 Eryngiolide A对高脂血清损伤的内皮细胞MDA和SOD的影响（x±s，n=4）

与正常组相比*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比^▲P<0.05，^▲▲P<0.01

3.Eryngiolide A对高脂饮食大鼠血脂的影响

与正常组相比，模型组甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）、低密度脂蛋白LDLC的含量均显著升高（P<0.01），高密度脂蛋白（HDLC）无明显影响；与模型组相比，Eryngiolide A组和多烯康对照组TC、LDLC的含量均显著降低（P<0.01），对HDLC无明显影响。

表3 Eryngiolide A对高脂饮食大鼠血脂的影响（x±s，n=4）

与正常组相比*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比^▲P<0.05，^▲▲P<0.01

4.Eryngiolide A对高脂致动脉粥样硬化大鼠主动脉斑块的病变分级的影响

与模型组相比，Eryngiolide A中剂量组斑块面积/内膜面积（%）、内膜厚度（um）、内膜厚度/中膜厚度（%）均显著降低（P<0.05），Eryngiolide A高剂量组合多烯康对照组斑块面积/内膜面积（%）、内膜厚度（um）、内膜厚度/中膜厚度（%）均显著降低（P<0.01）。

表4 Eryngiolide A对高脂致动脉粥样硬化大鼠主动脉斑块面积/内膜面积（%）、内膜厚度/中膜厚度（%）的影响（x±s，n=4）

与正常组相比*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比^▲P<0.05，^▲▲P<0.01

5.Eryngiolide A对高脂致动脉粥样硬化大鼠血清MDA、SOD的影响

与正常组相比，模型组血清中MDA的含量显著升高（P<0.01），SOD活性显著下降；与模型组相比，AA中、高剂量组血清中MDA的含量均显著降低（P<0.05，P<0.05），SOD的含量显著升高（P<0.05）。

表5 Eryngiolide A对高脂致动脉粥样硬化大鼠血清中MDA、SOD的影响（x±s，n=4）

与正常组相比**P<0.01；与模型组相比^▲P<0.05，^▲▲P<0.01

结论：Eryngiolide A能够显著抑制动脉粥样硬化，可以用来制备抗动脉粥样硬化药物。

Claims (1)

1.Eryngiolide A在治疗动脉粥样硬化药物中的应用，所述化合物Eryngiolide A结构如式（Ⅰ）所示：

式（Ⅰ）。