CN103251580A - 蛇葡萄素在制备保护血管内皮细胞的保健食品或药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了蛇葡萄素在制备保护血管内皮细胞的保健食品及药物中的应用，可采用经纯化蛇葡萄素或未经纯化的含蛇葡萄素的提取物，制备成药剂学上允许的口服、注射或外用剂型。蛇葡萄素通过降低脂质过氧化，抗氧化损伤等作用来发挥保护血管内皮细胞的功能，从而起到预防和治疗内皮细胞损伤所致的心脑血管疾病，如动脉粥样硬化、高血压、心脑血栓等。

Description

蛇葡萄素在制备保护血管内皮细胞的保健食品或药物中的应用

研究领域： 

本发明涉及蛇葡萄素在保健食品及制药领域的应用，特别是蛇葡萄素在制备保护血管内皮细胞的保健食品及药物中的应用。 

背景技术：

血管内皮细胞(VEC)为衬贴于心血管内腔面的单层扁平细胞。血管内皮细胞不仅具有选择性通透、抗血栓、调节血管紧张度、促进毛细血管形成以及产生血细胞粘接因子等功能，而且还是多种血管活性物质、细胞因子以及生长因子的来源和靶器官。 

血管内皮细胞的损伤与多种心血管疾病(如动脉粥样硬化、高血压、血栓形成等)有密切的关系。以血栓为例，生理状态下内皮细胞具有抗血栓形成的作用。①抑制凝血系统功能。内皮细胞可合成肝素样葡萄胺聚糖，增强抗凝血酶III的功能；可合成蛋白聚糖，维持血管壁结构的完整性；合成血栓调节蛋白C，抑制纤维蛋白质的凝结。②增强纤溶系统功能。内皮细胞一方面可合成并释放大量的t-PA，另一方面也可通过合成并释放NO，PGI₂间接促进内皮细胞释放t-PA，抑制PAI-1，从而增强纤溶系统功能。③抑制血小板聚集功能。内皮细胞表面具有ecto-ADP酶，内皮细胞可合成并释放一氧化氮和类花生酸类活性因子，均可抑制血小板聚集。 

当VEC受损时，可促进血栓形成。实验及临床观察表明，VEC受损后产后PGI₂的能力下降或丧失，出现血栓形成及血管痉挛倾向。除PGI₂以外，tPA合成和释放减少，血栓形成增加。临床观察发现，在不稳定型心绞痛及急性心肌梗死患者，其纤溶酶原激活水平较正常人低，在心肌梗死后第7天逐渐升高，间接说明冠状动脉内皮细胞损伤后，合成tPA能力下降，导致血栓形成。 

VEC损伤后尚可引起血管舒缩功能的异常；VEC受损使内皮素(ET)释放增加，出现强烈的缩血管反应。生理情况下，在ET产生的同时VEC产生血管内皮舒张因子(EDRF)使血管平滑肌舒张，制约其缩血管效应，但是在病理状态下，如动脉硬化时，血管内膜损伤，EDRF生成减少，引起血管收缩。 

总之，目前的研究认为VEC与心、脑血管疾病密切相关。VEC结构与功能的完整，是机体维持血管张力，调节血压，调节止血与抗血栓形成功能平衡的重要环节。 

造成血管内皮细胞损伤的因素有很多：氧自由基、氧化型低密度脂蛋白、细菌内毒素、 高同型半胱氨酸、血管紧张肽II(ATII)等物质均可造成血管内皮细胞的损伤。 

导致内皮细胞损伤的氧化性物质主要是氧自由基(OFR)。OFR是一种具有很强破坏力的炎性递质，几乎对所有体内大分子都可造成氧化损伤，破坏间隙基质或使炎性递质释放，从而损伤内皮细胞，引起屏障受损、血管通透性增加。部分中药可通过减轻血管内皮细胞的脂质过氧化，减少氧化产物丙二醛(MDA)、乳酸脱氧酶(LDH)等物质的产生，增加超氧化物歧化酶(SOD)的含量，抑制氧自由基的生成等作用来提高细胞的抗氧化能力。丹参酮II A能抑制由过氧化氢(H₂O₂)损伤引起的人脐静脉血管内皮细胞(CRL-1730)减少，抑制损伤的CRL-1730释放LDH和MDA，保护血管内皮细胞。川芎嗪共培养可抑制由低氧缺糖引起的血管内皮细胞(EVC-340)释放LDH增多、MDA生成增多和膜流动性增强，可提高一氧化氮(NO)的水平。羟乙基葛根素对过氧化氢损伤的牛脑微血管内皮细胞(BCMEC)的坏死和凋亡有保护作用，其作用机制与其提高过氧化氢损伤的BCMEC存活率、降低LDH的释放量、抗氧化作用有关。吴勇等发现黄芪多糖可明显降低兔动脉粥样硬化内皮细胞损伤模型的血清中总胆固醇、三酰甘油、MDA和内皮缩血管肽的含量，升高一氧化氮、SOD及总抗氧化活力，提示黄芪多糖可能通过抗氧化损伤作用及减轻内皮细胞缩血管肽对血管的损伤作用来发挥其保护血管内皮细胞的功能。麦冬含药物血清共培养可降低内毒素损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中MDA水平，增加SOD含量，增加细胞数目，降低细胞凋亡率，对HUVEC有保护作用，减少内毒素对其诱导的凋亡作用。氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)可导致血管内皮细胞内MDA含量增多、细胞培养液内LDH活力增强、细胞增殖能力及生命活力下降，而补肾益气方对OX-LDL导致的上述变化均有明显的改善作用，可通过抗氧化损伤等机制来保护血管内皮细胞。六味地黄方大鼠含药物血清共培养能促进OX-LDL损伤的血管内皮细胞增殖，抑制OX-LDL造成的内皮细胞凋亡，降低细胞内MDA含量，减少细胞LDH释放，提高SOD活力及一氧化氮含量，对血管内皮细胞有保护作用。 

本申请人令人惊奇地发现蛇葡萄素具有显著的保护血管内皮细胞损伤的作用。蛇葡萄素通过降低脂质过氧化，抗氧化损伤等作用来发挥保护血管内皮细胞的功能，从而起到预防和治疗内皮细胞损伤所致的心脑血管疾病，如动脉粥样硬化、高血压、心脑血栓等。 

蛇葡萄素是一种已知的化合物，是中国华南一带发布广泛的葡萄科几种蛇葡萄属植物，如显齿蛇葡萄[Ampelopsis grossedentata(Hand.-Mazz.)W.T.Wang]或无莿根[Ampelopsis cantoniensis(HooK.etArm)Planch]等的主要成分。蛇葡萄素又名二氢杨梅素，属黄酮类化合物，其结构式如下。由于蛇葡萄素特殊的分子结构，极易与具有氧化性的化合物反应，脱去一个H₂O分子，形成具有稳定的芳环结构的杨梅素分子，所以具有很强的还原性(即抗氧化性)。 

蛇葡萄素可以从葡萄科植物显齿蛇葡萄(又名藤茶)或无莿根按常规方法提取得到，也可以通过化学领域常规方法得到。 

自20世纪70年代开始，蛇葡萄素逐渐引起人们的关注，对其提取纯化、分离鉴定等进行较全面的研究。中国专利00117225.5报道了其具有抗肿瘤的作用，CN99119123.4公开了二氢杨梅素的制备方法及在治疗肝炎，保肝护肝，抗菌消炎和增强免疫系统免疫力用途；CN03149572.9公开了二氢杨梅素在制备降血脂的药物和保健品中的用途；CN03149573.7公开了二氢杨梅素在制备镇痛、祛痰的药物和保健品中的用途。CN200310110467.3公开了二氢杨梅素在制备药物中的应用，具体用于制备治疗口腔溃疡、胃溃疡、十二指肠溃疡、急性或慢性咽炎、盆腔炎和/或附件炎、慢性胃炎和/或肠炎的药物；CN200510087033.5公开了二氢杨梅素作为提高肉类加工品质的饲料添加剂的应用；CN200710106278.7公开了二氢杨梅素在制备治疗胃溃疡和胃炎的药物中的用途；CN200710034610.3公开了二氢杨梅素治疗心血管疾病的用途，主要是公开二氢杨梅素具有与阿司匹林相似的抗体内静脉血栓形成作用，即抗ADP诱发的血栓形成。但是该发明并未涉及本发明的内容，即二氢杨梅素具有保护血管内皮细胞损伤作用，通过降低脂质过氧化，抗氧化损伤等作用来发挥保护血管内皮细胞的功能，从而起到预防和治疗内皮细胞损伤所致的心脑血管疾病，如动脉粥样硬化、高血压、心脑血栓等。但迄今为止，也未见有蛇葡萄素在制备保护血管内皮细胞的保健食品及药物中的应用的报道。 

发明内容：

本发明目的之一是提供蛇葡萄素的新用途，即其在制备蛇葡萄素在制备保护血管内皮细胞的保健食品及药物中的应用。 

本发明的蛇葡萄素可以采用药学上允许的任何剂型均有效。包括口服剂型如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、袋泡茶、口服液体制剂等；也可以采用注射剂型如注射液、输液、粉针等。还可以采用外用剂型如贴剂、膏剂、膜剂、气雾剂、搽剂、凝胶剂、涂剂、栓剂等。 

本发明中的蛇葡萄素，可从含有蛇葡萄素的植物(如显齿蛇葡萄、无莿根)的水提物或醇提物的经提取纯化而得或通过化学领域常规方法得到纯度较高的蛇葡萄素。也可以采用含有蛇葡萄素的植物(如显齿蛇葡萄、无莿根)的水提物或醇提物未经纯化的混合提取物的方 式，而不必采用纯度非常高的蛇葡萄素。 

本发明可采用蛇葡萄素与其他具有保护血管内皮细胞损伤的药物制成复方制剂。 

本发明提供的含蛇葡萄素的具有保护血管内皮细胞的保健食品和药品的用途，即在制备预防和治疗内皮细胞损伤所致的心脑血管疾病中的应用。 

本发明中所指的内皮细胞损伤所致的心脑血管疾病包括动脉粥样硬化、高血压、心脑血栓。 

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。 

具体实施例：

实施例1 

取显齿蛇葡萄，采用常规的提取方法提取、纯化制备蛇葡萄素，分装成0.4g/支的粉针安瓿或注射液。 

实施例2 

取藤茶经常规提取蛇葡萄素提取物，不经纯化，经含量测定后，取340g蛇葡萄素提取物，加入30g维生素E，30g维生素C，按常规方法添加辅料，制粒，混匀，过筛，添加助流剂硫酸镁、滑石粉，按片剂常规生产工艺加工成片剂，制成蛇葡萄素片剂，每片含蛇葡萄素200mg。 

实施例3 

取显齿蛇葡萄10kg，采用常规的乙醇提取方法提取2遍，将醇提液合并后浓缩至相对密度为1.35-1.38的清膏，加入蔗糖粉适量，混匀，制成颗粒剂。 

实施例4 

取显齿蛇葡萄嫩叶10kg，去核山楂2kg，清洗，干燥，粉碎，过4目筛，混匀，装成袋泡茶。 

实施例5 

取显齿蛇葡萄，采用常规的水提方法，提取液合并后浓缩至相对密度为1.1～1.2(85℃±5℃)，冷却至40℃，加醇使含醇量达30％，搅匀，静置24小时，滤过，回收乙醇至无醇味，加水调整总量至1000ml，搅匀，静置，滤过，灌封，灭菌，即得口服液。 

实施例6 

取显齿蛇葡萄1000g，采用常规的提取方法提取，脱色，浓缩成浸膏。按常规方法制备膏剂基质，加入浸膏，过80目筛，涂膏，加衬，切割，包装即得膏剂。 

实施例7：蛇葡萄素对溶血磷脂酰胆碱(LPC)对血管内皮细胞(VEC)的损伤的保护作用。 

由于溶血磷脂酰胆碱(LPC)是氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)致动脉粥样硬化(AS)的重要脂质成分，AS发生过程中血浆LPC水平会显著上升。研究认为OX-LDL对VEC的损伤归因于LPC的增加，LPC这一重要脂质在AS发生发展中起着重要的作用。 

1.试验材料 

DMEM培养基，GIBCO公司产品；LPC，胰蛋白酶，SIGMA公司产品；特级小牛血清，Hyclon公司产品；二甲亚砜，Merk公司产品；噻唑蓝(MTT)，Serva公司进口分装；蛇葡萄素注射液(实施例1)； 

血管内皮细胞原代和传代培养：无菌条件下剪取新生未进食小牛胸主动脉约10厘米长，并迅速转入灭菌D-Hanks溶液中。在超净工作台内剥离主动脉上的结缔组织并结扎分支动脉，扎住主动脉细端，将血管翻身，使血管内皮朝外，用胰蛋白酶消化10min，取消化液离心，得内皮细胞，计数分装进行原代培养。传代培养后选用4-7代的内皮细胞进行实验。分别接种于24孔细胞培养板，每孔细胞密度平均为5×10⁵(个)。96孔细胞培养板，每孔细胞密度平均为1×10⁵(个)。 

2.试验方法 

本试验分为7组：(1)对照组；(2)LPC(5ug/ml)组；(3)LPC(5ug/ml)+蛇葡萄素(0.005mg/ml)；(4)LPC(5ug/ml)+蛇葡萄素(0.01mg/ml)；(5)LPC(5ug/ml)+蛇葡萄素(0.02mg/ml)组；(6)蛇葡萄素(0.01mg/ml)组； 

测定方法：按照细胞乳酸脱氢酶(LDH)含量的测定方法，用紫外分光光度计测定LDH含量；按照细胞内丙二醛(MDA)含量的微量测定方法，用荧光分光光度计测定MDA含量；按照MTT比色测定方法，用酶联免疫检测仪测定570nm波长细胞的OD值。按照一氧化氮(NO)的荧光检测方法，用荧光分光光度计测定NO含量。 

统计学处理：实验数据均以均数±标准差(X±s)表示，组间差异比较采用t检验。 

3.试验结果 

蛇葡萄素对LPC致VEC损伤后LDH和MDA含量的影响：当LPC(5ug/ml)与VEC共培养24h后可显著地增加LDH从细胞中的泄漏量，同时显著地加剧细胞膜的脂质过氧化，MDA含量增加，且均与对照组比较P＜0.001。而同时加入不同浓度的蛇葡萄素，则能减轻LDH从细胞中的泄漏量，也降低细胞MDA含量。说明蛇葡萄素能减轻LPC致VEC的损伤，结果见下表。 

蛇葡萄素对LPC致VEC损伤后细胞增殖的影响：当LPC(5ug/ml)与VEC在96孔培养板共培养24h后可显著地抑制细胞的生长，成活率下降，与对照组比较P＜0.001。可能由于细胞损伤抑制了细胞的正常生长。加入不同浓度的蛇葡萄素后细胞的生长逐渐恢复，与LPC 组比较差异显著，结果见下表。 

蛇葡萄素对LPC致VEC损伤后细胞NO含量的影响：当LPC(5ug/ml)与VEC共培养24h后可显著地减少细胞NO的含量，且与对照组比较P＜0.001。而同时加入不同浓度的蛇葡萄素后，则能逐渐增加细胞NO的含量，且呈量效关系。说明蛇葡萄素能抵抗LPC致VEC的损伤，对细胞具有保护作用，结果见下表。 

蛇葡萄素对LPC对VEC损伤的保护作用 

结论：从本实验结果看，蛇葡萄素能抵抗LPC致VEC的损伤，能保护细胞减少乳酸脱氢酶的泄漏，降低细胞脂质过氧化程度，增加细胞中一氧化氮的产生。其作用机理是因为LPC致VEC的损伤是一种氧化损伤，而蛇葡萄素能保护VEC免受氧自由基的伤害，是通过抗氧化途径达到保护细胞的目的的。这对防止由氧化损伤引起的AS形成，具有一定的保护作用。 

实施例8：蛇葡萄素未纯化提取物对H₂O₂损伤的血管内皮细胞保护作用。 

本实验采用体外细胞培养方法，用H₂O₂诱导血管内皮细胞损伤模型，研究蛇葡萄素未纯化提取物对内皮细胞的保护作用。 

1.实验材料 

小牛血管内皮细胞株及培养基，检测材料与实施例7相同。 

SD雄性大鼠8只，体重(280±20)g。 

蛇葡萄素未经纯化的提取物，水提或醇提均可，经检测含蛇葡萄素不低于30％。 

2.试验方法 

药物血清的制备：蛇葡萄素以临床等效剂量的2.5倍给大鼠连续灌胃3d，2次/d，另设正常血清对照组：大鼠给予等量生理盐水灌胃。灌胃前禁食不禁水12h。于末次灌后1h，颈动脉取血，以1000r/min离心10min，分离血清，然后56℃30min灭活以除去补体，再用0.22um的微孔滤膜过滤除菌，密封后置于-20℃冰箱保存备用。分别制得含药血清和正常对照血清。 

细胞分组正常组：用10％正常对照血清培养，不做任何处理；模型组：用10％正常对照血清培养，加终浓度为380umol/LH₂O₂；蛇葡萄素提取物含药血清组：加终浓度为380mol/L H₂O₂、含10％蛇葡萄素提取物药物血清的培养液。阳性药物对照组：用10％正常对照血清培养，加终浓度为380umol/LH₂O₂和终浓度为0.5g/L的丹参注射液。 

LDH、NO、NOS、MDA含量测定取各组细胞上清液，按试剂盒方法进行操作。 

统计学处理应用SPSS统计软件进行统计分。 

3.实验结果 

结果发现，模型组LDH和MDA值最高，NOS值最低，与正常组和蛇葡萄素提取物组的差别具有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，蛇葡萄素提取物组含药血清组的NOS活性显著提高，MDA含量、LDH活力显著降低(P＜0.05)。结果见下表。 

蛇葡萄素提取物对H₂O₂损伤的ECV分泌LDH、NOS和MDA的影响 

注：与正常组比较#P＜0.05，与模型组比较*P＜0.05 

结论：蛇葡萄素提取物可降低H₂O₂对ECV的损伤程度，具有明显的保护作用，其机理可能与维持细胞膜结构的完整性、提高抗氧化能力以及提高NOS活性等途径有关。 

实施例10：蛇葡萄素口服制剂对脉粥样硬化、高血压、心脑血栓的预防和治疗效果 

本发明的药物可以片剂为主(每片含蛇葡萄素200mg，制备见实施例2)。用法用量为每天3次，每次2片，一个月为一疗程。也可做含等量蛇葡萄素的胶囊，颗粒剂，口服液、袋泡茶或丸剂等，制备见实施例3-5。 

我们用上述蛇葡萄素口服剂型对120例心脑血管病进行临床使用观察。男性83例，女性37例，患者年龄45-80岁，其中57例有心脑血栓史，37例有轻度或中度动脉粥样硬化，90％以上患者高血脂、高血压。 

患者服用蛇葡萄素口服制剂30天后，患者的神经系统、运动功能及语言状况有很明显改善，患者普遍反映服药后感觉舒服，且无不良反应和副作用。 

临床试验结果：参与临床试验的120例患者中，显效(比服药前指标改善)104人，无效的(比服药前指标未改善或恶化)16人，总有效率86.67％。 

实施例1]：典型病例 

姓名：张继文(男)年龄65岁职业：退休干部 

简要病史：1994年头晕，头痛，健忘失眠，心烦，血压80-170毫米汞柱，诊断结果为脑动脉硬化。医院建议用多种药物终身服用，一直疗效甚微。后来服用蛇葡萄素片剂1个月后，完全取消这些支持药物，而且各种症状减轻，继续服药4月后不良感觉完全消失，各种检查均正常。 

实施例12：典型病例 

患者姓名：李文广(男)，年龄73岁，退休司机 

简要病史：2003年因口齿不清，口角流涎，右半身不遂，神情呆滞，反应迟钝血压90-190毫米汞柱等症状。诊断结果，脑梗，医院建议服用心痛定，降压胶囊等八种药物维持。后尝试服用蛇葡萄素袋泡茶，一天4袋，连服一个月后感觉症状减轻。继续服药4个月后不良感觉完全消失，血压也正常。现仅服用蛇葡萄素袋泡茶，不再服用其他药物。 

实施例13：典型病例 

患者姓名：赵丽娟(女)，年龄70岁，退休教师 

简要病史：右侧肢活动不灵一周，患者一周前午后睡醒下床时突然摔倒，被家人扶起，自觉右侧上、下肢无力，不听使唤，无头痛、头晕，到当地医院就诊，按“脑梗塞”给予“脉通+胞二磷胆碱”等药物治疗一周，不见好转，且感右侧肢体瘫痪加重，头颅CT可见左内囊肚脂部和双底节区多发生性梗塞灶，以“多发脑梗塞”收住院。既往史，冠心病10年，高血压。治疗：低分子右旋糖苷，加服蛇葡萄素颗粒剂，一天4袋。 

患者一周后被搀扶可下床行走，两周后持拐杖可行走，治疗三周后，右上肢力和功能 基本正常，右下肢在上楼时感觉不如左腿。第四周各症状完成消失。建议继续服用蛇葡萄素颗粒剂2月。 

Claims (7)

1.蛇葡萄素在制备预防或治疗心脑血栓的保健食品或药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物采用药剂学上允许的任何口服剂型。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物采用药剂学上允许的任何注射剂型。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物采用药剂学上允许的任何外用剂型。

5.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其特征在于，蛇葡萄素与其他保护血管内皮细胞损伤的药物制成复方制剂。

6.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其特征在于，蛇葡萄素采用显齿蛇葡萄的未经纯化的提取物。

7.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其特征在于，蛇葡萄素采用无莿根的未经纯化的提取物。