CN103245738A - 一种脑膜炎球菌多糖中ctab含量的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种脑膜炎球菌多糖中CTAB含量的测定方法，包括以下步骤：取CTAB标准溶液和脑膜炎球菌多糖溶液样品，分别上样于高效凝胶色谱柱，根据色谱图计算脑膜炎球菌多糖溶液样品中CTAB的浓度。本发明提供了一种准确、重复性好、快速、便捷的脑膜炎球菌多糖原液中CTAB含量的测定方法。
Description
技术领域
本发明涉及测试分析领域，具体地涉及一种利用高校液相色谱测定脑膜炎球菌多糖中CTAB含量的方法。
背景技术
CTAB，全称为十六烷基三甲基溴化铵，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在多糖纯化过程中，CTAB作为螯合剂使复合糖得以沉淀。然而CTAB具有一定的刺激性，可因吸入、咽下或皮肤吸收而使人体受到危害。近年来，在生物制品申报过程中，国家规定应明确CTAB等有机物质残留量以降低制品风险。因此准确测定脑膜炎多糖原液中CTAB的残留量对疫苗生产有着重要影响，对疫苗产品质量控制具有重要的意义。
目前，国内外尚无文献报道脑膜炎球菌多糖原液及脑膜炎球菌多糖疫苗中CTAB残留量的测定方法，因此如何对脑膜炎球菌多糖疫苗中的CTAB进行检测尚不确定。
发明内容
本发明目的是提供一种快速而准确的脑膜炎球菌多糖原液中CTAB含量的测定方法。
为实现本发明目的，提供的测定方法包括以下步骤：
取CTAB标准溶液和脑膜炎球菌多糖溶液样品，分别上样于高效凝胶色谱柱，根据色谱图计算脑膜炎球菌多糖溶液样品中CTAB的浓度。
具体地，包括以下步骤：
（1）制取CTAB标准溶液作为样1，其浓度标记为C1；（2）取待检的脑膜炎球菌多糖溶液，作为样2；（3）样1、样2分别上样于高效凝胶色谱柱；（4）记录色谱图并进行积分计算；（5）根据公式计算样2中CTAB的浓度。
其中，凝胶色谱柱为TSKgel G5000色谱柱。其原理是根据样品分子大小不同进行分离，CTAB与肺炎多糖分子大小间存在差异，可被有效分离。
其中，流动相为（0.8-0.9%）NaCl溶液。
其中，上样体积分别为20-100μl；洗脱流速为0.4-0.6ml/min。
其中，在检测波长为214nm下记录色谱图。
其中，所述脑膜炎球菌为A群脑膜炎球菌、C群脑膜炎球菌、Y群脑膜炎球菌、W135群脑膜炎球菌中的任意一种。
其中，根据色谱图进行积分计算，利用以下公式计算脑膜炎球菌多糖溶液样品中CTAB的浓度：
将CTAB标准溶液作为样1，其浓度标记为C1；将待检的脑膜炎球菌多糖溶液样品，作为样2；
根据公式（Ⅰ）计算样2中CTAB的浓度：
C2=（S2÷S1）×C1，其中，S2为样2对应的峰面积，S1为样1对应的峰面积；
根据公式（Ⅱ）计算样2中CTAB的百分含量：
F=（C2÷C0）×100%，其中，C0为待检脑膜炎球菌多糖溶液样品中的多糖浓度。
在本发明优选的实施方案中，检测脑膜炎球菌多糖中CTAB含量的具体步骤为：
（1）精密制取CTAB标准溶液作为样1，其浓度标记为C1；
（2）取待检的脑膜炎球菌多糖溶液，作为样2；
（3）充分平衡色谱柱后，将样1上样于凝胶色谱柱进行洗脱，记录色谱图：洗脱峰开始所对应时间标记为t1，洗脱峰结束所对应时间标记为t2；
（4）对样1色谱图进行积分，积分窗口为从t1到t2，得到样1对应的峰面积为S1；
（5）将样2上样于高效凝胶色谱柱进行洗脱；
（6）对样2色谱图进行积分，积分窗口为从t1到t2，得到样2对应的峰面积为S2；
（7）根据公式（Ⅰ）：
C2=（S2÷S1）×C1 （Ⅰ）
计算样2中CTAB的浓度；
（8）测定待检脑膜炎球菌多糖溶液中的多糖浓度，标记为C0；
（9）根据公式（Ⅱ）：
F=（C2÷C0）×100% （Ⅱ）
计算样2中CTAB的百分含量。
本发明根据CTAB分子与脑膜炎多糖分子间大小存在差异，利用二者在凝胶层析时的保留时间不同，采用高效液相色谱法将CTAB与脑膜炎球菌多糖分离，利用已知浓度的CTAB作为标准对照，从而准确测定脑膜炎球菌多糖原液中CTAB含量。
本发明的有益效果为：本发明提供了一种准确、重复性好、快速、便捷的脑膜炎球菌多糖原液中CTAB含量的测定方法，当CTAB浓度在6.25-100μg/ml时，线性相关系数r大于0.9990，变异系数CV小于3%，平均回收率在98%以上，从而建立了评价脑膜炎球菌多糖原液质量的新方法。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1检测方法的考察
1.1线性关系考察
精密称取CTAB10mg，用0.85%NaCl溶解并定容至10ml，作为对照品贮备液（浓度为1mg/ml）。精密吸取CTAB对照品贮备液10ml，定容至100ml容量瓶，作为对照品工作液（浓度为100μg/ml）。将对照品工作液依次稀释至浓度100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml，吸取不同浓度的对照品溶液，依次进样20μl，记录色谱图。以峰面积（Y）为纵坐标，对照品溶液X（μg/ml）为横坐标进行线性回归，得其回归方程。结果见表1。
表1 线性关系试验结果
| 线性方程 | R值 |
| Y1=32446X1+33572 | R1=0.9991 |
| Y2=29931X2+105550 | R2=0.9990 |
| Y3=31349X3-94998 | R3=0.9995 |
结果表明，峰面积与浓度之间线性关系良好。
1.2检测限与定量限
以信噪比为3倍时（样品主峰高约为基线噪音的3倍）的溶液浓度作为样品的检出限，以信噪比为10倍时的溶液浓度作为样品的定量限，计算结果得CTAB的检测限为0.06μg/ml，定量限为0.20μg/ml。
1.3精密度试验
取浓度为6.25μg/ml的CTAB对照品溶液，连续进样5次，记录其峰面积，并计算其变异系数CV（%），结果见表2。
表2 含量重复性测定试验结果
结果表明，此方法的精密性良好。
1.4准确度试验
以Y群原液做稀释液，配制CTAB浓度100μg/ml，进样20μl，平行操作2次，记录色谱图。以100μg/mlCTAB作为对照品，计算回收率。结果见表3。
表3 Y群原液回收率
结论：当CTAB浓度在6.25-100μg/ml时，该方法线性相关系数r大于0.9990，变异系数CV小于3%，平均回收率在98%以上。本检测方法适用于脑膜炎多糖原液中CTAB含量的检测，具有良好的线性、精密度及准确度。
实施例2A群脑膜炎球菌中CTAB含量的测定
精密制取100μg/ml（C1）CTAB标准溶液作为样1；
取待检的A群脑膜炎球菌多糖溶液，加标CTAB浓度为100μg/ml，作为样2；
将样1上样于充分平衡的高效凝胶色谱柱TSKgel G5000色谱柱，上样体积为20μl，0.9%NaCl溶液洗脱，洗脱流速为0.5ml/min，于波长214nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为21.450min，峰结束对应时间为24.492min。
对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间21.450min到峰结束对应时间24.492min，得到样1对应的峰面积为3289049；
将样2上样于充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为20μl，洗脱流速为0.5ml/min，于波长214nm记录色谱图；
对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间21.450min到峰结束对应时间24.492min，得到样2对应的峰面积为3230746；
根据公式（1）计算A群脑膜炎球菌多糖CTAB的浓度C2=（S2÷S1）×C1=（3230746÷3289049）×100=98.23μg/ml；测定待检A群脑膜炎球菌多糖的糖浓度为9.8mg/ml（C0）；
根据公式（2）计算A群脑膜炎球菌多糖CTAB的百分含量F=（C2÷C0）×100%=（98.23/9800）×100%=1.00%。
通过该实验测得样品回收率为98.23%。
实施例3C群脑膜炎球菌中CTAB含量的测定
精密制取100μg/ml（C1）CTAB标准溶液作为样1；
取待检的C群脑膜炎球菌多糖溶液，作为样2；
将样1上样于充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为20μl，0.8%NaCl溶液洗脱，洗脱流速为0.4ml/min，于波长214nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为26.397min，峰结束对应时间为29.499min。
对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间26.397min到峰结束对应时间29.499min，得到样1对应的峰面积为3240747；
将样2上样于充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为20μl，洗脱流速为0.4ml/min，于波长214nm记录色谱图；
对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间26.397min到峰结束对应时间29.499min，得到样2对应的峰面积为6976；
根据公式（1）计算C群脑膜炎球菌多糖CTAB的浓度C2=（S2÷S1）×C1=（6976÷3240747）×100=0.22μg/ml；
测定待检C群脑膜炎球菌多糖的糖浓度为10.3mg/ml（C0）；
根据公式（2）计算C群脑膜炎球菌多糖CTAB的百分含量F=（C2÷C0）×100%=（0.22/10300）×100%=0.0021%。通过该实验测得样品回收率为98.12%。
实施例4Y群脑膜炎球菌中CTAB含量的测定
精密制取100μg/ml（C1）CTAB标准溶液作为样1；
取待检的Y群脑膜炎球菌多糖溶液，作为样2；
将样1上样于充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为20μl，0.85%NaCl溶液洗脱，洗脱流速为0.6ml/min，于波长214nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为17.382min，峰结束对应时间为20.489min。
对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间17.382min到峰结束对应时间20.489min，得到样1对应的峰面积为3301241；
将样2上样于充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为20μl，洗脱流速为0.6ml/min，于波长214nm记录色谱图；
对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间17.382min到峰结束对应时间20.489min，得到样2对应的峰面积为5158；
根据公式（1）计算Y群脑膜炎球菌多糖CTAB的浓度C2=（S2÷S1）×C1=（5158÷3301241）×100=0.16μg/ml；
测定待检Y群脑膜炎球菌多糖的糖浓度为10.5mg/ml（C0）；
根据公式（2）计算Y群脑膜炎球菌多糖CTAB的百分含量F=（C2÷C0）×100%=（0.16/10500）×100%=0.0015%
通过该实验测得样品回收率为98.36%。
实施例5W135群脑膜炎球菌中CTAB含量的测定
精密制取100μg/ml（C1）CTAB标准溶液作为样1；
取待检的W135群脑膜炎球菌多糖溶液，作为样2；
将样1上样于充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为100μl，0.85%NaCl溶液洗脱，洗脱流速为0.5ml/min，于波长214nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为21.315min，峰结束对应时间为24.427min。
对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间21.315min到峰结束对应时间24.427min，得到样1对应的峰面积为3321734；
将样2上样于充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为100μl，洗脱流速为0.5ml/min，于波长214nm记录色谱图；
对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间21.315min到峰结束对应时间24.427min，得到样2对应的峰面积为7825；
根据公式（1）计算W135群脑膜炎球菌多糖CTAB的浓度C2=（S2÷S1）×C1=（39125÷16608670）×100=0.24μg/ml；
测定待检W135群脑膜炎球菌多糖的糖浓度为9.6mg/ml（C0）；
根据公式（2）计算W135群脑膜炎球菌多糖CTAB的百分含量F=（C2÷C0）×100%=（0.24/9600）×100%=0.0025%
通过该实验测得样品回收率为98.56%。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种脑膜炎球菌多糖中十六烷基三甲基溴化铵含量的测定方法，包括以下步骤：取CTAB标准溶液和脑膜炎球菌多糖溶液样品，分别上样于高效凝胶色谱柱，根据色谱图计算脑膜炎球菌多糖溶液样品中CTAB的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述凝胶色谱柱为TSKgel G5000色谱柱。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，流动相为0.8-0.9%NaCl溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上样体积为20-100μl。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，洗脱流速为0.4-0.6ml/min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱图在检测波长为214nm下记录。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脑膜炎球菌为A群脑膜炎球菌、C群脑膜炎球菌、Y群脑膜炎球菌、W135群脑膜炎球菌中的任意一种。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，根据色谱图进行积分计算，利用以下公式计算脑膜炎球菌多糖溶液样品中CTAB的浓度：
将CTAB标准溶液作为样1，其浓度标记为C1；将待检的脑膜炎球菌多糖溶液样品，作为样2；
根据公式（Ⅰ）计算样2中CTAB的浓度：
C2=（S2÷S1）×C1，其中，S2为样2对应的峰面积，S1为样1对应的峰面积；
根据公式（Ⅱ）计算样2中CTAB的百分含量：
F=（C2÷C0）×100%，其中，C0为待检脑膜炎球菌多糖溶液样品中的多糖浓度。
9.权利要求1-8任一项所述方法在检测脑膜炎球菌多糖中CTAB含量中的应用。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101256174A (zh) * | 2008-02-02 | 2008-09-03 | 深圳市华测检测技术股份有限公司 | 烷基季铵盐类阳离子表面活性剂的检测方法 |
| CN101274909A (zh) * | 2007-03-27 | 2008-10-01 | 中国科学院化学研究所 | 溴化1-[3-(4-马来酰亚胺基苯氧基)丙基]三甲铵及其制备方法与应用 |
| CN101311718A (zh) * | 2008-05-15 | 2008-11-26 | 深圳市华测检测技术股份有限公司 | 一种用液相色谱-串联质谱联用技术测定烷基季铵盐类阳离子表面活性剂的方法 |
| CN102087256A (zh) * | 2010-12-06 | 2011-06-08 | 岳阳昌德化工实业有限公司 | 一种直链烷基季铵盐的气相色谱分析方法 |
| CN102128909A (zh) * | 2010-12-20 | 2011-07-20 | 中国兽医药品监察所 | 一种分离鉴别消毒剂中扎化、单链和双链季铵盐的方法 |
| CN102338783A (zh) * | 2010-07-21 | 2012-02-01 | 博兴华润油脂化学有限公司 | 一种酯胺类季铵盐碳链组成的气相色谱分析方法 |
-
2013
- 2013-04-18 CN CN201310136134.1A patent/CN103245738B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101274909A (zh) * | 2007-03-27 | 2008-10-01 | 中国科学院化学研究所 | 溴化1-[3-(4-马来酰亚胺基苯氧基)丙基]三甲铵及其制备方法与应用 |
| CN101256174A (zh) * | 2008-02-02 | 2008-09-03 | 深圳市华测检测技术股份有限公司 | 烷基季铵盐类阳离子表面活性剂的检测方法 |
| CN101311718A (zh) * | 2008-05-15 | 2008-11-26 | 深圳市华测检测技术股份有限公司 | 一种用液相色谱-串联质谱联用技术测定烷基季铵盐类阳离子表面活性剂的方法 |
| CN102338783A (zh) * | 2010-07-21 | 2012-02-01 | 博兴华润油脂化学有限公司 | 一种酯胺类季铵盐碳链组成的气相色谱分析方法 |
| CN102087256A (zh) * | 2010-12-06 | 2011-06-08 | 岳阳昌德化工实业有限公司 | 一种直链烷基季铵盐的气相色谱分析方法 |
| CN102128909A (zh) * | 2010-12-20 | 2011-07-20 | 中国兽医药品监察所 | 一种分离鉴别消毒剂中扎化、单链和双链季铵盐的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| WANG JINCHENG;ZHENG XIAOYU; HAO WENLI: "Synthesis of hyper-branched quaternary ammonium salt and its application into montmorillonite", 《POWDER TECHNOLOGY》, vol. 221, 10 November 2011 (2011-11-10), pages 80 - 89, XP028908798, DOI: doi:10.1016/j.powtec.2011.11.006 * |
| 陈英: "一种高分子表面活性剂的制备及性能研究", 《安庆师范学院学报》, vol. 13, no. 3, 31 August 2007 (2007-08-31), pages 1 - 9 * |
Also Published As
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