CN103242268A

CN103242268A - 一种从红豆杉枝叶初分离10-去乙酰基巴卡亭ⅲ的方法

Info

Publication number: CN103242268A
Application number: CN2012103808660A
Authority: CN
Inventors: 李贺然; 史志冉; 李永霞; 王炳义; 杜志红; 富雪洋; 胡文; 刘顺; 郝杰
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2012-10-10
Filing date: 2012-10-10
Publication date: 2013-08-14

Abstract

本发明公开了一种从红豆杉枝叶初分离10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的方法，包括以下步骤：用50%甲醇提取红豆杉枝叶，充分提取出10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ，提取液用大孔吸附树脂吸附，先用30%乙醇进行淋洗除去杂质，再用50%乙醇洗脱得到目标产物，浓缩后得到富集10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的产物。采用本发明技术方案，所用原料为可再生的红豆杉枝叶，充分利用了红豆杉资源，既做到了不破坏生态资源，又能高效提取到红豆杉中的10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ，而且该方法用大孔树脂吸附，操作简单易行，减少了有机溶剂的使用量，降低了成本，有利于大规模工业生产。

Description

一种从红豆杉枝叶初分离10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的方法

技术领域

本发明涉及一种红豆杉植物成分的提取方法，具体的涉及一种从红豆杉枝叶初分离10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的方法。

背景技术

10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ（10-DABⅢ）是半合成抗癌药物紫杉醇（Taxol）和多西紫杉醇（docetaxel）的前体原料。紫杉醇最早从太平洋红豆杉树皮中提取出来的一种天然抗癌药物，多西紫杉醇是人工合成的新化合物。紫杉醇或多西紫杉醇能与肿瘤微管蛋白结合，并促进其聚合、抑制癌细胞有丝分裂，阻止癌细胞的增殖，它们有较广的抗癌谱，对顺铂、多柔比星等耐药肿瘤细胞株有效，临床上已用于肺癌、乳腺癌、头颈癌卵巢癌的治疗，其疗效好，副作用小。近年来研究表明，紫杉醇或多西紫杉醇对治疗其他疾病也有一定的潜力，如恶性黑色素瘤、类风湿性关节炎和早老性痴呆。紫杉醇被认为是迄今人类发现的疗效最好的抗癌药，随着紫杉醇和多西紫杉醇在临床上的应用，其原料得需求量也日益增加，野生红豆杉资源遭到了毁灭性的破坏，人工种植的红豆杉虽然成为解决紫杉醇原料短缺的重要途径，但是采用传统的方法，从红豆杉树皮中提取紫杉醇，资源耗费太大，而且人工种植周期长，仍然不能解决紫杉醇的原料问题。

但是在许多红豆杉属的植物中，存在许多含量比紫杉醇高的紫衫烷类物质，它们结构相似，可以通过生物或者化学转化的手段转变成紫杉醇与多西紫杉醇，如10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ。

10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ存在于多种紫衫属植物中，含量约为0.0052%-0.1185%，在传统的提取紫杉醇的生产工艺中常被当做废物丢弃掉，既浪费资源又污染环境。通过研究可以利用10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ半合成紫杉醇与多西紫杉醇，因此寻找一种简便快捷，成本低的从红豆杉中富集10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的方法，是世界范围内的一个研究热点。

中国专利公开号 CN 1660827A公开了一种提取10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的方法，利用大孔树脂 S-8、AB-8、X-5、D4020、NKA-9或D3520对10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ进行吸附。中国专利公开号 CN 101230053A 公开，利用D101-1和D101型号的大孔树脂对10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ进行吸附。中国专利公开号 CN101235022A公开，利用AB-8型号大孔吸附树脂对10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ进行吸附。我们通过大量实验，对各种树脂进行筛选，发现MW-1树脂比以上所提到的树脂对10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的吸附效果更好，增加了10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ得提取效率，节约成本耗能较少，可连续大规模进行10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ提取生产。

发明内容

为克服现有技术中的不足，本发明提供一种从红豆杉枝叶初分离10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的方法。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种从红豆杉枝叶初分离10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的方法，包括以下步骤：

经干燥粉碎后的红豆杉枝叶，于50℃下用50%甲醇提取4次各2 h，浓缩液的滤液经过MW-1 树脂动态吸附，用30%乙醇进行淋洗除去杂质，再用50%乙醇洗脱得到目标产物，从而达到对10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的初步富集。

进一步的，所述10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ为中等极性物质，通过于50℃下用50%甲醇提取4次各2 h，可以将红豆杉中所述10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ 充分提出，而将其他极性的紫衫烷类物质留在植物固形物中，可作为后期提取紫杉醇等得原料，通过重复多次提取，使得提取溶剂与植物细胞充分的接触，使所述10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ迅速彻底的转移至提取溶剂中，使效率提高。

进一步的，所用大孔树脂为 MW-1 型号大孔树脂，所述树脂对10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ具有特异性吸附，上样流速 1 mL/min，温度为35℃，采用梯度洗脱的方法：3 BV 的30%乙醇洗脱出去极性大的杂质，然后用9 BV 50% 乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，经过富集后所述10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ 的含量可以提高 8.76 倍以上。

进一步的，所用工艺用于红豆杉枝叶，包括欧洲红豆杉、南方红豆杉、中国红豆杉、东北红豆杉、西藏红豆杉或曼地亚红豆。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明以红豆杉可再生枝叶为原料，不破坏植物资源，实现了对红豆杉资源的高效充分的利用；采用50%乙醇多次对植物原料的提取，使原料中的10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ被充分提取，回收率高；采用的MW-1型号大孔树脂富集方法，比以往专利中的树脂吸附效果好，可以充分对植物资源中的10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ进行特异性吸附，可以提高效率，更有效的提高洗脱馏分中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的含量；优化了洗脱程序和洗溶液，可以使用相对较简单的方法和相对较低浓度的洗脱溶液达到理想的分离和富集效果，并且重复性好，简单易行，可以实现大规模的工厂化生产。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。

附图说明

图1为在检测波长为228nm下用20%乙醇洗脱时的谱图；

图2为在检测波长为228nm下用30%乙醇洗脱时的谱图；

图3为在检测波长为228nm下用40%乙醇洗脱时的谱图；

图4为在检测波长为228nm下用50%乙醇洗脱时的谱图；

图5为在检测波长为228nm下用60%乙醇洗脱时的谱图；

图6为在检测波长为228nm下用70%乙醇洗脱时的谱图；

图7为在检测波长为228nm下用80%乙醇洗脱时的谱图；

图8为在检测波长为228nm下用90%乙醇洗脱时的谱图；

图9为在检测波长为228nm下用100%乙醇洗脱时的谱图。

具体实施方式

下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。

试验用红豆杉枝叶提取液的制备：采集红豆杉枝叶干燥粉碎后，称取15kg ，加入 75 L 50%甲醇水溶液，50℃下提取2小时，然后重复3次，合并浓缩提取液并且过滤。用HPLC检测上述滤液中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ，其含量为 0.3856 mg/mL，百分含量为0.30%。

实施例1：

110 mL红豆杉枝叶提取液加入到装有10 g MW-1树脂的玻璃柱中，进行动态吸附，上样溶液为11 BV，上样溶液中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ为：0.3856 mg/mL，流速为1 ml/min，温度为35℃，采用梯度洗脱的方法：3 BV的30%乙醇洗脱出去极性大的杂质，然后9 BV 50% 乙醇洗脱，收集馏分，浓缩至干，经MW-1树脂富集后，10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的含量从 0.30%提到到2.63%，提高了8.76倍。

实施例2：

44 L红豆杉枝叶提取液加入到装有400 g MW-1树脂的玻璃柱中，进行动态吸附，上样溶液为11 BV，上样溶液中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ为：0.3856 mg/mL，流速为1 ml/min，温度为35℃，采用梯度洗脱的方法：3 BV的30%乙醇洗脱出去极性大的杂质，然后9 BV 50% 乙醇洗脱，收集馏分，浓缩至干，经MW-1树脂富集后，10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的含量从 0.30%提到到2.89%，提高了9.63倍。

标准品：10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的标准品购自中国食品药品检定所，结果定量检测分析采用以下表条件：

实施例3：大孔树脂法纯化红豆杉提取物

3.1红豆杉的提取

采集红豆杉枝叶干燥粉碎后，称取15kg ，加入 75 L 50%甲醇水溶液，50℃下提取2小时，然后重复3次，合并浓缩提取液并且过滤。

3.2大孔树脂纯化工艺的优化

将红豆杉提取物上MW-1型大孔树脂进行四次平行实验,依次用水,20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%,100%乙醇洗脱,洗脱液旋蒸至干,用少量甲醇超声溶解,用吸管吸出,存放入小瓶中，挥干称重。发现30%乙醇中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ含量几乎为零，50%乙醇洗脱物中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ含量最高。因此工艺优化为：采用梯度洗脱的方法，先用3 BV的30%乙醇洗脱出去极性大的杂质，然后9 BV 50% 乙醇洗脱，收集馏分，浓缩至干。

3.3小试放大实验

取MW-1大孔树脂7㎏装柱，经预处理后水洗至中性，柱体积为7L。取刺五加提取液77L上样，分别用水、30%、50%乙醇洗脱，各洗脱部位经分析检测，10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的含量从 0.30%提到到2.63%，提高了8.76倍。

4.红豆杉提取物的定量分析

标曲的绘制：精密称取10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ30.06 mg于50ml容量瓶中，甲醇定容，后分别移取10.5，6.6，4，3，2，1，0.3，0.08 ml于25ml容量瓶中，甲醇定容后，分别进样10μl，注入色谱仪记录色谱图，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，求得回归方程：y=16051x+22.692 (R²=0.9997)。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种从红豆杉枝叶初分离10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的从红豆杉枝叶初分离10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的方法，其特征在于：所述10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ为中等极性物质，通过于50℃下用50%甲醇提取4次各2 h，可以将红豆杉中所述10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ 充分提出，而将其他极性的紫衫烷类物质留在植物固形物中，可作为后期提取紫杉醇等得原料，通过重复多次提取，使得提取溶剂与植物细胞充分的接触，使所述10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ迅速彻底的转移至提取溶剂中，使效率提高。

3.根据权利要求1、2所述的制备有序一维有机纳米线阵列的方法，其特征在于：所用大孔树脂为 MW-1 型号大孔树脂，所述树脂对10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ具有特异性吸附，上样流速 1 mL/min，温度为35℃，采用梯度洗脱的方法：3 BV 的30%乙醇洗脱出去极性大的杂质，然后用9 BV 50% 乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，经过富集后所述10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ 的含量可以提高 8.76 倍以上。

4.根据权利要求1所述的制备有序一维有机纳米线阵列的方法，其特征在于：所用工艺用于红豆杉枝叶，包括欧洲红豆杉、南方红豆杉、中国红豆杉、东北红豆杉、西藏红豆杉或曼地亚红豆。