CN103232416A - 一种分离纯化10-去乙酰紫杉醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公布了一种分离纯化10-去乙酰紫杉醇的方法，其特征在于将含10-去乙酰紫杉醇的原料，在有机溶剂反应体系中与弱极性或非极性羟基保护剂反应，反应后的产物进行正相硅胶柱层析，采用三元梯度洗脱的方法分离获得高纯度C(2′)位羟基保护的10-DAP，再去掉羟基保护基即得。整个方法操作简单，温和可控且效率高，适于规模化制备纯度大于99%的10-DAP。

Description

一种分离纯化10-去乙酰紫杉醇的方法

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种从紫杉烷混合物中分离制备高纯度医药中间体10-去乙酰紫杉醇的方法，尤其涉及10-去乙酰紫杉醇和其类似物10-去乙酰紫杉醇C的分离。

背景技术

紫杉醇被认为是上世纪天然药物研发领域最重大的发现之一，其先后被美国 FDA批准用于治疗乳腺癌、卵巢癌以及非小细胞肺癌等实体癌的一线治疗(Lancet，2000，355,1176)。目前紫杉醇的制备工艺主要有三种：1）直接提取，2）植物细胞培养，3）半合成。其中半合成主要以10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰紫杉醇（10-Deacetyl-Paclitaxel，10-DAP）为原料，尤其是以10-DAP为原料的半合成工艺具有合成路线短、收率高、工艺简单易操作等特点。10-DAP有两个主要来源：1）红豆杉属植物直接提取天然的10-DAP；2）木糖酶转化多种红豆杉中富含的7-木糖-10-去乙酰紫杉醇进而获得10-DAP。但以上两种方法都难以直接获得高纯度的10-DAP进而用于紫杉醇的半合成，主要是因为红豆杉属植物次生代谢路径复杂，天然提取物中化学成分繁多，同时含有多种分子结构和理化性质与10-DAP的类似物，如10-去乙酰三尖杉宁碱及10-去乙酰紫杉醇C等，极大的影响了10-DAP的分离与纯化。由于这些类似物具有相同的母核及类似的侧链，结构上的唯一区别是侧链 3'-酰胺上的取代基不同（如图1所示）。结构的相似也决定了其具有相似的物理化学性质和色谱保留行为，所以借助传统分离工艺很难将这三种化合物分离。10-去乙酰紫杉醇和10-去乙酰三尖杉宁碱的分离，可借鉴紫杉醇和三尖杉宁碱的分离手段，如利用氧化、臭氧化、溴化等方法对三尖杉宁碱侧链中不饱和双键的特性对其衍生后再进行分离。但是由于10-去乙酰紫杉醇C结构上无双键难以实现选择性化学修饰，对于10-去乙酰紫衫醇和其类似物10-去乙酰紫杉醇C一直没有高效的分离方法。目前直接分离10-去乙酰紫衫醇和其类似物10-去乙酰紫杉醇C的方法，主要是利用精细色谱技术进行分离，具体包括：1) 反相色谱分离(J.Liq.Chromatogr.1993，16，3263)，这大大增加了生产成本 ；2) 制备性 TLC 、HPLC以及 HPLC与 HSCCC( 高速逆流色谱)相结合的方法分离。以上两种方法由于反相填料造价昂贵、处理量小、同时紫杉烷类化合物在含水溶剂中溶解度低，易析出等因素导致无法实现规模化生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种从紫杉烷混合物中分离纯化10-DAP 的方法，通过此方法可获得高纯度10-DAP。整个工艺操作简单，温和可控且收率高，适于规模化制备高纯度10-去乙酰紫杉醇。

本发明提供的一种从紫杉烷中分离纯化10-DAP的方法，具体为：天然提取或经木糖酶水解10-去乙酰-7-木糖紫杉醇（DAXP）等方法获得的含10-DAP的紫杉烷混合物为原料，在有机溶剂反应体系中与弱极性或非极性羟基保护剂反应，高选择性地单一保护紫杉烷混合物C(2′)位羟基，产物进行正相硅胶柱层析，采用三元梯度洗脱的方法分离获得高纯度C(2′)位羟基保护的10-DAP，再去掉羟基保护基，即可得到高纯度的10-DAP。

上述方法中，所述的反应体系选择易溶解原料的非质子性溶剂，包括氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺中的任意一种，优选N,N-二甲基甲酰胺或二氯甲烷。

上述方法中，所述的羟基保护剂选自三甲基氯硅烷、三乙基氯硅烷、叔丁基二甲基氯硅烷、叔丁基二苯基氯硅烷等硅试剂或者氯甲酸苄酯等非极性保护基中的任意一种。

上述方法中，所述的反应温度为-20~ 80 ^oC，反应时间为1~15小时。

上述方法中，所述的正相硅胶柱层析，分离柱选用普通玻璃柱或金属柱，固定相选择硅胶，硅胶粒径选用200-400目；样品与固定相质量比为 1 : 10 ~1 : 40。

上述方法中，所述的正相硅胶柱层析，三元流动相分别选择非极性、中等极性及高极性溶剂。其中非极性溶剂选择石油醚、环己烷、正己烷中的一种；中等极性溶剂选择乙酸乙醋、丙酮、氯仿中的一种；高极性溶剂选择甲醇、乙醇或异丙醇中的一种；梯度范围为100：10：1 ~ 20：10：1（体积比）。

本发明针对以提取天然紫杉烷为原料制备高纯度紫杉醇中所涉及的10-去乙酰紫杉醇C的去除难题。通过采用硅烷等小极性基团对10-去乙酰紫杉烷C(2’)羟基进行高效，高选择性的单一保护，增加了10-去乙酰三尖杉宁碱、10-去乙酰紫杉醇和10-去乙酰紫杉醇C间的分离度。采用三元梯度洗脱实现了常规、廉价的硅胶柱分离去除10-去乙酰紫杉醇C获得高纯度DAP的目的。整个方法操作简单，温和可控且效率高，适于规模化制备纯度大于99%的10-DAP。

附图说明

图1. 紫杉醇、10-去乙酰紫杉醇及其类似物的化学结构式；

图2. 10-去乙酰紫杉烷混合物C(2’)位羟基由叔丁基二甲基硅烷（TBS）保护及分离路线图；

图3. 柱层析前后的10-去乙酰紫杉醇C(2’)位羟基由叔丁基二甲基硅烷（TBS）保护产物的LC-UV谱图；

图4.  10-去乙酰紫杉醇C(2’)位羟基由叔丁基二甲基硅烷（TBS）保护产物正负离子模式下ESI-MS分析谱图，m/z 948为 [M+Na]⁺；m/z 924为 [M-H]^-；m/z 970为 [M+HCOOH]^-；

图5. 10-去乙酰紫杉醇终产品的LC-UV谱图；

图6. 10-去乙酰紫杉醇负离子模式下ESI-MS分析谱图；m/z 810 为[M-H]^-；m/z 856为[M+HCOOH]--^- 。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步地说明，但不构成对本发明的限制。在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1

称取10-去乙酰紫杉烷样品（含10-去乙酰紫杉醇70.16%，10-去乙酰三尖杉宁碱16.56，10-去乙酰紫杉醇C 6.59%）1.6g溶于8ml N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，并在冰水浴中搅拌溶清。加入咪唑850 mg，叔丁基二甲基氯硅烷（TBSCl）900 mg，缓慢升至25^oC反应6~8h，TLC检测反应结束。加入NH₄Cl水溶液和乙酸乙酯提取，有机相减压（10mm Hg）蒸干，二氯甲烷溶解上硅胶柱。硅胶粒径300~400目；样品与固定相质量比为1：20。石油醚/丙酮/甲醇（60：10：1，体积比）进行梯度洗脱。收集得到2’-叔丁基二甲基硅基-10-去乙酰紫杉醇 1.2g ，纯度98.65%，收率92.8%；2’-叔丁基二甲基硅基-10-去乙酰紫杉醇C 90 mg。

将所得2’-叔丁基二甲基硅基-10-去乙酰紫杉醇1.2g 溶于10 ml 2%HCl 甲醇中，25 ^oC反应2 h，TLC检测反应结束。加入水和乙酸乙酯提取，有机相减压（10mm Hg）蒸干，甲醇水结晶得10-去乙酰紫杉醇980 mg，纯度99.6%，收率95%。

实施例2 

称取10-去乙酰紫杉烷样品（含10-去乙酰紫杉醇70.16%，10-去乙酰三尖杉宁碱16.56，10-去乙酰紫杉醇C 6.59%）1.2 g溶于8 ml二氯甲烷（DCM）中，并在冰水浴中搅拌溶清。加入三乙胺（TEA ）2 ml，三乙基氯硅烷（TESCl） 0.64ml，并在80^oC反应1h，TLC检测反应结束。加入NH₄Cl水溶液和乙酸乙酯提取，有机相减压（10mm Hg）蒸干，二氯甲烷溶解上硅胶柱。硅胶粒径300~400目；样品与固定相质量比为1：25。环己烷/乙酸乙醋/乙醇（70：10：1，体积比）进行梯度洗脱。收集得到2’-三乙基硅基-10-去乙酰紫杉醇 750 mg，纯度97.96%，收率75.6%。

将所得2’-三乙基硅基-10-去乙酰紫杉醇750 mg溶于7 ml 1%HCl甲醇中，25 ^oC反应45 min，TLC检测反应结束。加入水和乙酸乙酯提取，有机相减压（10mm Hg）蒸干，甲醇水结晶得10-去乙酰紫杉醇570 mg ，纯度99.3%，收率90%。

实施例3

称取10-去乙酰紫杉烷样品（含10-去乙酰紫杉醇70.16%，10-去乙酰三尖杉宁碱16.56，10-去乙酰紫杉醇C 6.59%）1.2g溶于8ml乙酸乙酯中，并在冰水浴中搅拌溶清。加入咪唑800 mg，叔丁基二苯基氯硅烷（TBDPSCl） 1.4g，在20 ^oC反应12~15h，TLC检测反应结束。加入NH₄Cl水溶液和乙酸乙酯提取，有机相减压（10mm Hg）蒸干，二氯甲烷溶解上硅胶柱。硅胶粒径300~400目；样品与固定相质量比为1：30。正己烷/氯仿/异丙醇（80：10：1，体积比）进行梯度洗脱。收集得到2’-叔丁基二苯基硅基-10-去乙酰紫杉醇 1.0g ，纯度98.15%，收率90%。

将所得溶于2’-叔丁基二苯基硅基-10-去乙酰紫杉醇1g 溶于10 ml 2% HF甲醇溶液中，25 ^oC反应4 h，TLC检测反应结束。加入水和乙酸乙酯提取，有机相减压（10mm Hg）蒸干，甲醇水结晶得10-去乙酰紫杉醇680 mg，纯度99.5%，收率91%。

实施例4

称取10-去乙酰紫杉烷样品（含10-去乙酰紫杉醇70.16%，10-去乙酰三尖杉宁碱16.56，10-去乙酰紫杉醇C 6.59%）1.2 g溶于8 ml 氯仿中，并在冰水浴中搅拌溶清。加入三乙胺（TEA ）2 ml，三甲基氯硅烷（TMSCl） 0.8 ml，并在 0 ^oC 以下反应2~4h，TLC检测反应结束。加入NH4Cl水溶液和乙酸乙酯提取，有机相减压（10mm Hg）蒸干，二氯甲烷溶解上硅胶柱。硅胶粒径300~400目；样品与固定相质量比为1：25。石油醚/丙酮/甲醇（100：10：1，体积比）进行梯度洗脱。收集得到2’7-二三甲基硅基--10-去乙酰紫杉醇 940 mg，纯度97.76%，收率85.6%。

将所得2’7-二三甲基硅基-10-去乙酰紫杉醇940 mg溶于10 ml 1%HCl甲醇中，25 ^oC反应1h，TLC检测反应结束。加入水和乙酸乙酯提取，有机相减压（10mm Hg）蒸干，甲醇水结晶得10-去乙酰紫杉醇700 mg ，纯度99.1%，收率96%。

实施例5

称取10-去乙酰紫杉烷样品（含10-去乙酰紫杉醇70.16%，10-去乙酰三尖杉宁碱16.56，10-去乙酰紫杉醇C 6.59%）1.0g溶于8 ml四氢呋喃（THF）中，并在冰水浴中搅拌溶清。加入Na₂CO₃ 400 mg，氯甲酸苄酯 0.5 ml，并在-20 ^oC 下反应6~8 h，TLC检测反应结束。加入水溶液和乙酸乙酯提取，有机相NaHCO₃饱和溶液洗三遍后,有机相减压（10mm Hg）蒸干，二氯甲烷溶解上硅胶柱。硅胶粒径300~400目；样品与固定相质量比为1：40。石油醚/丙酮/甲醇（20：10：1，体积比）进行梯度洗脱。收集得到2-苄氧羰基-10-去乙酰紫杉醇 680 mg，纯度96.46%，收率80.5%。

将所得2-苄氧羰基-10-去乙酰紫杉醇 680 mg溶于20 ml甲醇中，加入10% Pd/C 70mg,通入H₂ 在25 ^oC反应8~10h，TLC检测反应结束。反应液过滤，滤液减压（10mm Hg）蒸干后，甲醇水结晶两次得10-去乙酰紫杉醇400 mg ，纯度99.4%，收率76%。

Claims (8)

1.一种分离纯化10-去乙酰紫杉醇的方法，其特征在于：将含10-去乙酰紫杉醇的原料，在有机溶剂反应体系中与弱极性或非极性羟基保护剂反应，产物进行正相硅胶柱层析，采用三元梯度洗脱的方法分离获得高纯度C(2′)位羟基保护的10-DAP，再去掉羟基保护基即得，其中：

所述的反应体系选自氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺中的任意一种；

所述的羟基保护剂选自三甲基氯硅烷、三乙基氯硅烷、叔丁基二甲基氯硅烷、叔丁基二苯基氯硅烷、氯甲酸苄酯中的任意一种；

所述反应的温度为-20 ~ 80 ^oC，反应时间为1~15 小时；

所述的正相硅胶柱层析，分离柱选用普通玻璃柱或金属柱，固定相选择硅胶，硅胶粒径选用200-400目，样品与固定相质量比为 1 : 10 ~1 : 40，三元流动相分别选择非极性、中等极性及高极性溶剂，所述非极性溶剂、中等极性溶剂、高极性溶剂体积比为100：10：1 ~ 20：10：1。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述三元流动相中非极性溶剂为石油醚、环己烷、正己烷中的一种，中等极性溶剂为乙酸乙醋、丙酮、氯仿中的一种，高极性溶剂为甲醇、乙醇或异丙醇中的一种。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的反应体系为N,N-二甲基甲酰胺或二氯甲烷。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述反应的温度为0 ~ 25 ^oC。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述反应的时间为4~8小时。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述硅胶粒径为300~400目。

7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述样品与固定相质量比为1 : 20 ~1 : 30。

8.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述梯度范围非极性：中等极性：高极性为60：10：1 ~ 80：10：1。

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