CN103224906B - 一种妊娠期高血压疾病小鼠模型的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种妊娠期高血压疾病小鼠模型的建立方法。该妊娠期高血压疾病小鼠模型的建立方法通过从小鼠胎盘中提取合体滋养细胞微绒毛膜，并将其通过尾静脉注射回输入同种品系的孕鼠体内，构建妊娠期高血压疾病小鼠模型。本发明建立的妊娠期高血压疾病小鼠模型具有血压升高、子痫抽搐、心肾损害等妊娠期高血压疾病特征性症状和体征改变，这些现象与人类子痫前期、子痫等妊娠期高血压疾病的症状和病理过程相符，可用于以研究子痫前期、子痫等妊娠期高血压疾病的发生、发展机制以及开发对抗药物为目地的医学基础和临床研究。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，特别是涉及一种妊娠期高血压疾病小鼠模型的建立方法。
背景技术
以子痫前期（preeclampsia，PE）、子痫（eclampsia）为代表的妊娠期高血压疾病是严重威胁孕产妇和胎儿健康的重要产科疾病，其发病机制至今未明。母体血液循环的合体滋养细胞微绒毛膜（syncytiotrophoblast microvillousmembrane，STBM）因可作用于外周血管，导致血管内皮细胞失功能而被认为是子痫前期、子痫等发病的重要因素。
基于医学研究的伦理要求和妊娠过程的特殊性质，目前尚无法通过临床试验来研究合体滋养细胞微绒毛膜在人类妊娠期高血压疾病中的具体作用及其机制。同时，由于没有以合体滋养细胞微绒毛膜为研究靶点的动物模型，相应的动物实验和体内研究也无法开展。这局限了对子痫前期、子痫等妊娠期高血压疾病的进一步研究。
因此，建立基于STBM的妊娠期高血压疾病动物模型，对深入研究人类子痫的病因、发生发展机制和治疗具有非常重要的意义。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种妊娠期高血压疾病小鼠模型的建立方法。本发明建立的妊娠期高血压疾病小鼠模型具有子痫前期、子痫的特征性症状和体征改变，可用于研究人类妊娠期高血压疾病的病因、发生发展机制和治疗。
为实现上述目的，本发明采取如下措施：
本发明所述妊娠期高血压疾病小鼠模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将新鲜C57BL/6小鼠胎盘采用冰PBS缓冲液洗净后剪碎成胎盘碎片；取胎盘碎片放置在0.1～0.2mol/L的NaCl溶液中，2～6℃振荡过夜，其中所述NaCl溶液中添加了1～2%的青-链霉素；取上清，差速离心：1000g，10min，弃沉淀；10000g，10min，弃沉淀；100000g，60min，弃上清，得合体滋养细胞微绒毛膜富集沉淀；将合体滋养细胞微绒毛膜富集沉淀以2～6℃的PBS缓冲液洗涤，再以2～6℃的PBS缓冲液重悬，其中所述重悬步骤中PBS缓冲液中含3～7%的蔗糖，保存于-20℃备用，得合体滋养细胞微绒毛膜混悬液；
（2）将上述步骤（1）所得的合体滋养细胞微绒毛膜混悬液通过尾静脉注射回输入同种品系的孕鼠体内。
优选地，在上述妊娠期高血压疾病小鼠模型的建立方法中，所述步骤（1）中的C57BL/6小鼠为8～12周龄，妊娠16～20天，体重25～30g。
优选地，在上述妊娠期高血压疾病小鼠模型的建立方法中，所述步骤（1）中的胎盘碎片大小为1～2mm3。
优选地，在上述妊娠期高血压疾病小鼠模型的建立方法中，所述步骤（1）中胎盘碎片质量和NaCl溶液体积之比为1g︰40～60ml。
优选地，在上述妊娠期高血压疾病小鼠模型的建立方法中，所述步骤（2）中每只小鼠注射合体滋养细胞微绒毛膜混悬液中总蛋白含量为0.03～0.04mg。
优选地，在上述妊娠期高血压疾病小鼠模型的建立方法中，所述步骤（2）中孕鼠为雌性C57BL/6小鼠，小鼠年龄为8～12周龄，孕8～20天，体重19～30g。
在上述妊娠期高血压疾病小鼠模型的建立方法中，孕鼠注射合体滋养细胞微绒毛膜混悬液后，本发明通过血压监测、病理检查等方法监测其血压、肾脏、心肌病理改变等相关指标变化，并观察其有无子痫抽搐的出现，以判断模型是否构建成功。
本发明建立的妊娠期高血压疾病小鼠模型，具有血压升高、心肾损害、子痫抽搐等妊娠高血压和子痫特征性症状和体征改变，这些现象与人类妊娠期高血压疾病的症状和病理过程相符，可用于以研究子痫前期、子痫等妊娠期高血压疾病的发生发展机制以及开发对抗子痫药物为目的的医学基础和临床研究。
附图说明
图1妊娠第18天雌性C57BL/6小鼠胎盘。
图2剪碎的胎盘碎片置于0.15mol/L NaCl溶液中。
图3合体滋养细胞微绒毛膜蛋白的含量检测。
图4合体滋养细胞微绒毛膜组织多肽抗原含量检测。
图5扫描电子显微镜下的C57BL/6小鼠合体滋养细胞微绒毛膜。
图6回输合体滋养细胞微绒毛膜（STBM）后C57BL/6小鼠血压测定值变化。
图7回输合体滋养细胞微绒毛膜（STBM）后C57BL/6小鼠肾脏、心脏组织病理变化。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的发明内容作进一步的详细描述。应理解，本发明的实施例只用于说明本发明而非限制本发明，在不脱离本发明技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出的各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。
实施例1妊娠期高血压疾病小鼠模型的建立方法
主要试剂：C57BL/6小鼠（第三军医大学大坪医院动物实验中心），青-链霉素溶液（GIBCO Invitrogen Life Technologies），Improved-lowry蛋白定量试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司），小鼠组织多肽抗原ELISA试剂盒（上海卢尚生物有限公司）。
主要仪器：超速冷冻离心机（BECKMAN公司），电子天平，酶标仪（Labsystems Multiskan MS），小动物无创血压仪（GENEI SOFTRON公司），扫描电子显微镜（Hatchi S-3400NⅡ）。
（1）合体滋养细胞微绒毛膜的获取和鉴定
将新鲜雌性C57BL/6小鼠胎盘（图1所示）采用冰PBS缓冲液洗去残留血液，无菌纱布吸干表面水分，以眼科剪将胎盘剪碎为1～2mm3的胎盘碎片，其中所述C57BL/6小鼠为8～12周龄，妊娠16～20天，体重25～30g；称取2g胎盘碎片放入80～120ml0.1～0.2mol/L的NaCl溶液中（图2所示），其中NaCl溶液中添加了1～2%的青-链霉素，2～6℃振荡过夜，取上清离心，离心方法为：1000g，10min，弃沉淀；10000g，10min，弃沉淀；100000g，60min，弃上清，得到合体滋养细胞微绒毛膜富集沉淀。将合体滋养细胞微绒毛膜富集沉淀以1ml2～6℃的PBS缓冲液洗涤，并以1.2ml2～6℃的PBS缓冲液（5%蔗糖）重悬，得到合体滋养细胞微绒毛膜混悬液，保存于-20℃备用。
使用Improved-lowry蛋白定量试剂盒，按照说明书严格操作测定所得合体滋养细胞微绒毛膜总蛋白的含量，测定结果如图3所示，总蛋白含量为（0.69±0.12）mg/ml；以组织多肽抗原为标记，使用小鼠组织多肽抗原ELISA试剂盒，按说明书严格操作测定所得合体滋养细胞微绒毛膜组织中多肽抗原（tissue polypeptide antigen,TPA）的含量，测定结果如图4所示，组织多肽抗原含量为（61.49±9.78）ng/ml。如果总蛋白定量偏高而组织多肽抗原定量偏低，则所得合体滋养细胞微绒毛膜纯度差，反之纯度较好；由上述测定结果可知，本发明方法提取、富集的合体滋养细胞微绒毛膜纯度相对较好，且稳定性好，可重复性强。
扫描电子显微镜观察：取0.2ml所得合体滋养细胞微绒毛膜混悬液，加入等体积的2.5%戊二醛，固定四小时后滴到直径约1cm×1cm的云母片上，自然风干，镀金，上机观察，结果如图5所示，由图可见所得合体滋养细胞微绒毛膜为直径约200～500nm的囊泡状结构。
由上述实验结果可知，本发明制备的小鼠合体滋养细胞微绒毛膜产量大、浓度高，与人合体滋养细胞微绒毛膜在形态和蛋白标记物方面高度相似。
（2）妊娠期高血压疾病小鼠模型的建立和鉴定
取实施例1制备的合体滋养细胞微绒毛膜混悬液，以2～6℃的PBS缓冲液调整浓度并配制成总蛋白浓度为0.15mg/ml和0.2mg/ml的合体滋养细胞微绒毛膜混悬液。
取8～12周龄雌性C57BL/6小鼠，体重19～23g，小鼠在孕8～13天的范围内较好，本实施例取孕10天，分为3组，每组6只；将200μl总蛋白浓度为0.15mg/ml的合体滋养细胞微绒毛膜混悬液，隔日经尾静脉回输孕鼠体内，作为实验组，同时以分别注射回输等体积的PBS缓冲液和生理盐水组为对照组。持续无创检测孕鼠血压，6次/日；每组取3只小鼠于孕19天处死后取肾脏和心脏行组织病理检查。在回输第5天，实验组孕鼠无论收缩压及舒张压均显著高于对照组，如图6所示，P<0.05。孕19天处死后取肾脏和心脏行组织病理检查发现：实验组肾脏病理呈子痫疾病表现，肾小球基底膜增厚，系膜细胞增生，肾小管上皮广泛浊肿、空泡样变性；心肌组织病理则呈为肌纤维肥大、间质水肿、点状坏死等妊娠期高血压性心脏病表现，如图7所示。
取8～12周龄雌性C57BL/6小鼠，体重25～30g，小鼠在孕18～20天的范围内较好，最好为孕19天，分为3组，每组3只；将200μl总蛋白浓度为0.2mg/ml的合体滋养细胞微绒毛膜混悬液，经尾静脉回输孕鼠体内，作为实验组，同时以分别注射回输等体积的PBS缓冲液和生理盐水组为对照组。实验组发生于2～5分钟后发生类似子痫抽搐样症状，全身及四肢肌强直，四肢屈曲，趾部蜷曲，迅速发生强烈抽动，持续时间约2-5min，后抽搐停止，肌肉松弛，呼吸运动微弱，持续约5-10分钟后孕鼠死亡。而对照组均未出现抽搐及其他异常表现。
Claims (5)
1. 一种妊娠期高血压疾病小鼠模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将新鲜C57BL/6小鼠胎盘采用冰PBS缓冲液洗净后剪碎成胎盘碎片；取胎盘碎片放置在0.1~0.2 mol/L的 NaCl溶液中，2~6℃振荡过夜，其中所述NaCl溶液中添加了1~2%的青-链霉素；取上清，差速离心：1000g，10min，弃沉淀；10000g，10min，弃沉淀；100000g，60min，弃上清，得合体滋养细胞微绒毛膜富集沉淀；将合体滋养细胞微绒毛膜富集沉淀以2~6℃的PBS缓冲液洗涤，再以2~6℃的PBS缓冲液重悬，其中所述重悬步骤中PBS缓冲液中含3-7%的蔗糖，保存于-20℃备用，得合体滋养细胞微绒毛膜混悬液；
（2）将上述步骤（1）所得的合体滋养细胞微绒毛膜混悬液通过尾静脉注射回输入同种品系的孕鼠体内；每只小鼠注射合体滋养细胞微绒毛膜混悬液中总蛋白含量为0.03~0.04mg。
2. 根据权利要求1所述的一种妊娠期高血压疾病小鼠模型的建立方法，其特征在于：所述步骤（1）中的C57BL/6小鼠为8~12周龄，妊娠16~20天，体重25~30g。
3. 根据权利要求1所述的一种妊娠期高血压疾病小鼠模型的建立方法，其特征在于：所述步骤（1）中的胎盘碎片大小为1~2 mm-----3。
4. 根据权利要求1所述的一种妊娠期高血压疾病小鼠模型的建立方法，其特征在于：所述步骤（1）中胎盘碎片质量和NaCl溶液体积之比为1g︰40~60ml。
5. 根据权利要求1所述的一种妊娠期高血压疾病小鼠模型的建立方法，其特征在于：所述步骤（2）中孕鼠为雌性C57BL/6小鼠，小鼠年龄为8~12周龄，孕8~20天，体重19~30g。
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