CN103224545B

CN103224545B - 一种具有神经保护作用的含硫化合物及其用途

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Publication number: CN103224545B
Application number: CN201310181381.3A
Authority: CN
Inventors: 郑宗平; 王明福; 巢剑非
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2013-05-15
Filing date: 2013-05-15
Publication date: 2014-09-17
Anticipated expiration: 2033-05-15
Also published as: CN103224545A

Abstract

本发明提供了来源于菠萝果实的一类具有神经保护作用的含硫化合物及其制备与用途，属于医药领域。本发明通过各种分离手段，从菠萝果实中分得一类具神经保护作用的含硫化合物质。该类化合物具有结构式（I）。细胞实验表明，本类型化合物对神经细胞有较好的保护作用，可以预防或治疗各种因素引起神经细胞衰退或损伤导致的帕金森、阿尔采末、亨廷顿、药物滥用、抑郁症以及脑卒中疾病。

Description

一种具有神经保护作用的含硫化合物及其用途

技术领域

本发明涉及一种从菠萝果实中分离制备一类具神经保护作用的化合物的方法，以及该类化合物及其衍生物在制备用于预防和治疗各种原因引起的神经细胞衰退或损伤的药物中的应用，属于医药领域。

背景技术

菠萝，又称凤梨，为凤梨科植物凤梨Ananas comosus(L.)Merr.的果实。菠萝分布于许多热带和亚热带地区，在我国南风许多地区如福建、广东、海南、广西等有种植。菠萝汁由于香气宜人、可口并富含维生素C和B1而广受欢迎；菠萝的果实或汁，由于以上益处而广泛应用于食物中，如披萨、蛋糕、冰淇淋等。在中国大陆地区、香港以及世界各地的华人集聚区，菠萝也常被用于各种食品中提升食品的风味。此外，国内外学者对菠萝果实成分的研究表明菠萝成分具有抗氧化、抗褐变、抑制酪氨酸酶、抗炎以及抗血小板集聚的作用。其中，含硫物质是菠萝果实中极具特征的一类化合物。到目前为止，仅发现其中六种含硫物质，其中三种为我们首次分离得到，我们发现这六种含硫物质（包括已被发现的三种）具有酪氨酸酶抑制作用，但抑制活性均不强。作为后续的研究，最近我们发现此类化合物具有新的生物活性功能，即具有神经细胞保护作用，可以用于预防或治疗各种原因引起的神经细胞衰退或损伤引起的帕金森、阿尔采末、亨廷顿、药物滥用、抑郁症以及脑卒中疾病。

发明内容

本发明的目的是提供一类具神经保护作用的化合物。

具体地说，本发明提供了一类具神经保护作用的含硫化合物及其衍生物的制备方法及其应用。

所述具有神经保护作用的含硫化合物的结构通式如式（I）所示：

其中，R₁、R₂为羟基、氢原子或不同氨基酸基团；R₃-R₇为氢原子、羟基或甲氧基。

所述具有神经保护作用的含硫化合物中，R₁、R₂选择氨基酸基团时，优选半胱氨酸或谷胱甘肽；尤其优选具有以下5种结构的含硫化合物(含硫化合物1、2、3、5和6)。

所述具有神经保护作用的含硫化合物可用于制备具有保护神经细胞能力的功能性或药物成分。

所述具有神经保护作用的含硫化合物，可用于制备具有预防或治疗由各种原因引起的神经细胞衰退或损伤引起的帕金森、阿尔采末、亨廷顿、药物滥用、抑郁症以及脑卒中疾病的功能的药物。

所述具有神经保护作用的含硫化合物作为功能性成分使用时，可单独使用，也可与其它药剂学上接受的辅料混合，按照药剂学上记载的制剂的制备方法制成制剂。

本发明的有益之处是：提供的五种菠萝果实中提取的具有神经保护作用的一类含硫物质，可在预防或治疗由各种原因引起的神经细胞衰退或损伤引起的帕金森、阿尔采末、亨廷顿、药物滥用、抑郁症以及脑卒中疾病的应用。

附图说明

图1化合物N-L-γ-glutamyl-S-coniferyl-L-cysteine的氢谱

图2化合物N-L-γ-glutamyl-S-coniferyl-L-cysteine的碳谱

图3化合物S-p-hydroxycinnamylglutathione的氢谱

图4化合物S-p-hydroxycinnamylglutathione的碳谱

图5化合物N-[N-L-γ-glutamyl-S-[3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propenyl]-L-cysteinyl]-glycine的氢谱

图6化合物N-[N-L-γ-glutamyl-S-[3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propenyl]-L-cysteinyl]-glycine的碳谱

图7化合物1、2、3、5及6对由6-OHDA引起的SH-SY5Y细胞释放LDH的神经保护作用

图8化合物1和2对由6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞中Caspase-3活性的影响

具体实施方式

实施例1N-L-γ-glutamyl-S-coniferyl-L-cysteine和N-[N-L-γ-glutamyl-S-[3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propenyl]-L-cysteinyl]-glycine的制备

(1)取菠萝果实15kg，切成小块，用榨汁机绞碎，然后用10L的95%乙醇各提取3次，乙醇提取部分纱布过滤，然后2000r/min离心，在45℃减压回收溶剂至干，称重；然后加适量去离子水，与Amberlite XAD-16按2:1（干燥物比）的比例拌样，再上Amberlite XAD-16大孔树脂柱层析，以不同浓度乙醇洗脱（H₂O/EtOH，v/v，1/0、9/1、4/1、7/3、3/2、1/1、2/3、3/7及0/1），各洗脱6个柱体积，分别得到9（Fr.1-9）个组分。其中，组分Fr.4（H₂O/EtOH，7/3）经MCI柱层析，以不同浓度甲醇/水（v/v,10/90、20/80,30/70,40/60,50/50,60/40,100/0）各2000mL洗脱，从中分离得到7个组分（Fr.1'-7'）；组分Fr.4'用Sephadex LH-20柱层析，以2000mL甲醇/水（v/v，1:1）洗脱，从中分离得到4个组分（Fr.1''-4''），组分Fr.4''再由制备HPLC分离。

(2)制备液相色谱分离条件

仪器：Waters600制备液相色谱仪配2487双波长检测器。

色谱柱：Phenomenex Luna C18(2)柱(250×21.2mm,5μm)。

流动相：CH₃CN-H₂O（v/v，17/83）；检测波长：254nm。

分别收集24.7、29.9min的色谱峰，回收溶剂，得N-L-γ-glutamyl-S-coniferyl-L-cysteine和N-[N-L-γ-glutamyl-S-[3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propenyl]-L-cysteinyl]-glycine。

(3)N-L-γ-glutamyl-S-coniferyl-L-cysteine的核磁共振数据及质谱数据如下：

¹H NMR（500MHz，DMSO-d₆）:δ7.01（1H,d,J=1.6Hz,H-2），6.72（1H,d,J=8.1Hz,H-5），6.79（1H,dd,J=8.1,1.6Hz,H-6），6.37（1H,d,J=15.8Hz,H-7），6.02（1H,d t,J=15.8,7.5Hz,H-8），3.30（2H,d,J=7.3Hz,H-9），2.88（1H,dd,J=13.8,4.8Hz,H-10a），2.70（1H,dd,J=13.8,8.5Hz,H-10b），4.38（1H,m,H-11），2.32（2H,t,J=7.2Hz,H-4'），1.91（2H,m,H-5'），3.36（1H,t,J=6.3Hz,H-6'），3.78（3H,s,OMe），8.21（1H,s,NH），8.46，8.44（2H,br s,OH）。¹³C NMR（125MHz，DMSO-d₆）:δ128.0（C-1），109.6（C-2），147.7（C-3），146.4（C-4），115.4（C-5），119.6（C-6），132.2（C-7），122.4（C-8），33.8（C-9），31.9（C-10），52.2（C-11），171.8（C-12），172.4（C-3'），31.7（C-4'），27.1（C-5'），53.3（C-6'），169.8（C-7'），55.5（C-OMe）。HR-ESI-MS:m/z411.4565[M-H]^-。结构解析表明该化合物为N-L-γ-glutamyl-S-coniferyl-L-cysteine。

N-[N-L-γ-glutamyl-S-[3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propenyl]-L-cysteinyl]-glycine的核磁共振数据及质谱数据如下：

¹H NMR（500MHz，DMSO-d₆）:δ7.00（1H,br s,H-2），6.71（1H,d,J=8.1Hz,H-5），6.79（1H,br d,J=8.1Hz,H-6），6.39（1H,d,J=15.6Hz,H-7），6.02（1H,d t,J=15.6,7.5Hz,H-8），3.29（2H,d,J=6.9Hz,H-9），2.87（1H,dd,J=12.5,4.6Hz,H-10a），2.62（1H,dd,J=12.5,9.7Hz,H-10b），4.46（1H,m,H-11），3.36（2H,br s,H-2'）2.35（2H,m,H-4'），1.93（2H,m,H-5'），3.67（1H,br s,H-6'），3.78（3H,s,OMe），8.21（1H,s,NH），8.46，8.44（2H,br s,OH）。¹³C NMR（125MHz，DMSO-d₆）:δ128.1（C-1），109.7（C-2），147.7（C-3），146.4（C-4），115.4（C-5），119.6（C-6），132.1（C-7），122.6（C-8），33.7（C-9），32.5（C-10），52.5（C-11），170.6（C-12），171.9（C-1'），41.6（C-2'），171.9（C-3'），31.5（C-4'），26.9（C-5'），53.2（C-6'），170.6（C-7'），55.6（OMe）。ESI-MS:m/z468.2[M-H]^-。结构解析表明该化合物为N-[N-L-γ-glutamyl-S-[3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propenyl]-L-cysteinyl]-glycine。

实施例2N-L-γ-glutamyl-S-sinapyl-L-cysteine和S-sinapylglutathione的制备

(1)菠萝提取、大孔树脂分段、MCI和Sephadex LH-20分离同实施例1。所不同的是组分Fr.2''再由制备HPLC分离。

(2)制备液相色谱分离条件

仪器：Waters600制备液相色谱仪配2487双波长检测器。

色谱柱：Phenomenex Luna C18(2)柱(250×21.2mm,5μm)。

流动相：CH₃CN-H₂O（v/v，17/83）；检测波长：254nm。分别收集23.7、28.3min的色谱峰，回收溶剂，得N-L-γ-glutamyl-S-sinapyl-L-cysteine和S-sinapylglutathione。

(3)N-L-γ-glutamyl-S-sinapyl-L-cysteine的核磁共振数据及质谱数据如下：

¹H NMR（500MHz，DMSO-d₆）:δ6.69（1H,s,H-2,6），6.37（1H,d,J=15.5Hz,H-7），6.07（1H,d t,J=15.5,7.6Hz,H-8），3.31（2H,d,J=6.9Hz,H-9），2.88（1H,dd,J=13.6,4.6Hz,H-10a），2.70（1H,dd,J=13.6,8.7Hz,H-10b），4.39（1H,m,H-11），2.33（2H,t,J=7.2Hz,H-4'），1.89（2H,m,H-5'），3.31（1H,t,J=6.3Hz,H-6'），3.77（6H,s,OMe），8.50，8.48（2H,br s,OH）。¹³C NMR（125MHz，DMSO-d₆）:δ126.9（C-1），103.9（C-2,6），148.0（C-3,5），135.4（C-4），132.4（C-7），122.9（C-8），33.8（C-9），31.9（C-10），52.2（C-11），169.6（C-12），172.2（C-3'），31.8（C-4'），27.1（C-5'），53.3（C-6'），171.9（C-7'），55.9（OMe）。ESI-MS:m/z441.3[M-H]^-。结构解析表明该化合物为N-L-γ-glutamyl-S-sinapyl-L-cysteine。

S-sinapylglutathione的核磁共振数据及质谱数据如下：

¹H NMR（500MHz，DMSO-d₆）:δ6.93（2H,s,H-2,6），6.39（1H,d,J=15.7Hz,H-7），6.08（1H,d t,J=15.7,7.5Hz,H-8），3.30（2H,d,J=7.3Hz,H-9），2.88（1H,dd,J=13.6,4.6Hz,H-10a），2.62（1H,dd,J=13.6,9.6Hz,H-10b），4.49（1H,m,H-11），3.71（2H,s,H-2'）2.34（2H,m,H-4'），1.92（2H,m,H-5'），3.71（1H,t,J=5.9Hz,H-6'），3.77（6H,s,OMe），8.66，8.46，8.44（3H,br s,OH）。¹³C NMR（125MHz，DMSO-d₆）:δ127.0（C-1），103.9（C-2,6），148.0（C-3,5），135.4（C-4），132.3（C-7），123.0（C-8），33.7（C-9），32.0（C-10），52.3（C-11），170.1（C-12），170.7（C-1'），41.1（C-2'），171.8（C-3'），31.5（C-4'），26.9（C-5'），53.1（C-6'），170.8（C-7'），55.9（OMe）。ESI-MS:m/z498.2[M-H]^-。结构解析表明该化合物为S-sinapylglutathione。

实施例3S-sinapyl-L-cysteine的制备

(1)菠萝提取、大孔树脂分段、MCI和Sephadex LH-20分离同实施例1。所不同的是组分Fr.3''再由制备HPLC分离。

(2)制备液相色谱分离条件

仪器：Waters600制备液相色谱仪配于2487双波长检测器。

色谱柱：Phenomenex Luna C18(2)柱(250×21.2mm,5μm)。

流动相：CH₃CN-H₂O（v/v,15/85）；检测波长：254nm。收集21.3min的色谱峰，回收溶剂，得S-sinapyl-L-cysteine。

(3)S-sinapyl-L-cysteine的核磁共振数据及质谱数据如下：

¹H NMR（500MHz，DMSO-d₆）:δ6.80（2H,s,H-2,6），6.40（1H,d,J=15.6Hz,H-7），6.10（1H,d t,J=15.6,7.3Hz,H-8），3.32（2H,d,J=7.8Hz,H-9），3.00（1H,dd,J=14.1,3.5Hz,H-10a），2.70（1H,dd,J=14.1,8.3Hz,H-10b），3.72（1H,m,H-11），3.77（6H,s,OMe）。¹³C NMR（125MHz，DMSO-d₆）:δ127.0（C-1），103.9（C-2,6），148.1（C-3,5），135.5（C-4），132.4（C-7），123.1（C-8），33.6（C-9），32.1（C-10），52.2（C-11），168.9（C-12），56.0（OMe）。ESI-MS:m/z313.3[M-H]^-。结构解析表明该化合物为S-sinapyl-L-cysteine。

实施例4S-p-hydroxycinnamylglutathione的制备

(1)菠萝提取、大孔树脂分段同实施例1。所不同的是组分Fr.2用MCI柱层析分成7个组分（Fr.1'''-7'''），组分Fr.2'''用Sephadex LH-20柱层析，再由制备HPLC分离。

(2)制备液相色谱分离条件

仪器：Waters600制备液相色谱仪配于2487双波长检测器。

色谱柱：Phenomenex Luna C18(2)柱(250×21.2mm,5μm)。

流动相：CH₃CN-H₂O（v/v,10/90）；检测波长：254nm。收集25.4min的色谱峰，回收溶剂，得S-p-hydroxycinnamylglutathione。

(3)S-p-hydroxycinnamylglutathione的核磁共振数据及质谱数据如下：

¹H NMR（500MHz，DMSO-d₆）:δ7.23（2H,d,J=8.5Hz,H-2,6），6.71（2H,d,J=8.1Hz,H-3,5），6.39（1H,d,J=15.7Hz,H-7），5.97（1H,d t,J=15.7,7.6Hz,H-8），3.28（2H,d,J=7.3Hz,H-9），2.86（1H,dd,J=13.6,4.4Hz,H-10a），2.62（1H,dd,J=13.6,9.2Hz,H-10b），4.47（1H,m,H-11），3.75(2H,m,H-2')，2.33（2H,t,J=7.2Hz,H-4'），1.92（2H,m,H-5'），3.38（1H,t,J=5.9Hz,H-6'），8.21（1H,s,NH），8.53，8.41（2H,br s,OH）。¹³C NMR（125MHz，DMSO-d₆）:δ127.5（C-1），127.4（C-2,6），115.4（C-3,5），157.1（C-4），131.8（C-7），122.2（C-8），33.6（C-9），32.4（C-10），52.4（C-11），170.6（C-12），171.0（C-1'），41.3（C-2'），171.8（C-3'），31.4（C-4'），26.8（C-5'），53.1（C-6'），170.3（C-7'）。HR-ESI-MS:m/z438.4813[M-H]^-。结构解析表明该化合物为S-p-hydroxycinnamylglutathione。

实施例5乳酸脱氢酶（LDH）和Caspase-3活性评价

10%完全培养基（MEM）：10%热灭活胎牛血清，2mMol/L L-谷氨酸酰胺，50μg/mL青霉素和50mg/mL链酶素。

处理液：3%热灭活胎牛血清，1%L-谷氨酸酰胺（2mM），50μg/mL青霉素和50mg/mL链酶素。

化合物原液：先用DMSO分别配制新鲜的5个待测化合物的100mM溶液，测试时再用细胞培养液稀释成需要的不同浓度的溶液。

(1)细胞培养和处理

将SH-SY5Y细胞接种到装有10%完全培养基的96孔板中，于37℃、5%二氧化碳、饱和湿度的培养箱中培养，待细胞生长至80%融合时进行传代。对LDH和Caspase-3进行活性评价时，将细胞培养至细胞密度为每个96孔板含3×10⁵个细胞。

(2)分组和给药

①6-OHDA组（对照组）：取上述培养好的SH-SY5Y细胞，用同体积处理液更换原10%完全培养基，然后加入终浓度为25μM的6-OHDA处理24h。

②化合物预处理组（实验组）：取上述培养好的SH-SY5Y细胞，将化合物原液稀释至0、25、50、100及200μM，处理30min后，取上述混合液加入25μM的6-OHDA处理24h。

(3)乳酸脱氢酶（LDH）活性评价

收集96孔板上经过上述两组处理24h后的细胞培养液各46μL，与等体积的LDH反应试剂混合，在暗处反应30min，用Labsystem在492nm处测定吸光度的变化，结果表示为实验组相对于对照组在492nm处吸光度的倍数。

(4)Caspase-3活性评价

Caspase-3活性评价用于反映经处理后的细胞凋亡状态。收集步骤（2）中处理24h后的两组细胞，在冰浴情况下放入Cocktail的细胞裂解液中。于4℃、20000r/min离心30min后，弃上清获得细胞总蛋白，细胞总蛋白的浓度由蛋白测定试剂盒（Bio-Rad）测定。从每个样品（经过5个化合物处理后的）取等量的蛋白（60μg）与Caspase-3基板（Ac-DEVD-pNA）在37℃水浴中避光培养2h。将从基板刮下的黄色物质（对硝基苯胺）于405nm处测定吸光度，结果表示为实验组相对于对照组在405nm处吸光度的倍数。

结果表明，在LDH评价中，如图7所示，化合物1(N-L-γ-glutamyl-S-coniferyl-L-cysteine)、2(S-p-hydroxycinnamyl-glutathione)、3(N-[N-L-γ-glutamyl-S-[3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propenyl]-L-cysteinyl]-glycine)、5(S-sinapylglutathione)和6(S-sinapyl-L-cysteine)可以显著降低LDH的释放，并呈剂量依赖关系，化合物3浓度为200μM时对LDH活性的降低效果最好，为对照组的2.1倍；在Caspase-3评价中，如图8所示，化合物1（200μM）和化合物2（100和200μM）可以显著降低Caspase-3的活性，分别为对照组的2.5倍和1.3倍。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种具有神经细胞保护作用的含硫化合物的应用，其特征在于，所述化合物的结构式如式(1)、(2)、(3)、(5)或(6)所示：

用于制备具有神经细胞保护作用的药物，所述神经保护作用是降低6-OHDA对神经细胞的损害。

2.一种具有神经细胞保护作用的含硫化合物的应用，其特征在于，所述化合物的结构式如式(1)或(2)所示：

用于制备具有神经细胞保护作用的药物，所述神经保护作用是降低Caspase-3的活性。