CN103211831B - 黄酮碳苷类化合物在制备cox-2抑制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了黄酮碳苷类化合物(I)：在制备COX-2抑制剂中的应用；其中，R₁＝H、MeO或β-D-glu；R₂＝H、β-D-glu或β-D-glu-(2→1)-α-L-rha。

Description

黄酮碳苷类化合物在制备COX-2抑制剂中的应用

技术领域

本发明属于中药制药领域，具体涉及黄酮碳苷类化合物在制备COX-2抑制剂中的应用。

背景技术

2010年版中国药典新收录的药材广东紫珠，主要被用于妇科炎症疾病的治疗，如抗宫炎片、抗宫炎颗粒、宫复康胶囊等都是以广东紫珠为主药的复方制剂，在临床上发挥了很好的疗效，据统计，宫颈炎约占妇产科门诊总数的40-50％，居妇科疾病之首，因此，加强对广东紫珠的深入开发具有普遍意义。广东紫珠为马鞭草科植物广东紫珠(Callicarpakwangtungensis Chun.)的干燥茎枝及叶。主产于萍乡、安义、宜春、安远、井冈山、安福等地。异名：止血柴、紫珠草、紫珠、金刀菜、万年青、珍珠风、臭常山、老鸦饭、金刀柴。它具有收敛止血，清热解毒的功效，用于咯血、便血、肺胃出血、崩漏、肺热咳嗽、咽喉肿痛、烧伤、热毒疮疡、外伤出血。药理实验表明，广东紫珠总黄酮部位具有抗炎、镇痛的功效。

黄酮碳苷类化合物是一类比较特殊的化合物，其糖基以C-C键直接连在苷元的碳原子上。近年来，随着分离技术的进步，从天然植物中直接分离得到并鉴定的黄酮碳苷化合物数量猛增，而且其药理作用及临床应用的报道逐渐增多，其生物合成也逐渐引起人们的关注。文献报道其药理作用主要有扩血管降压作用、保肝、抗甲状腺作用、抗菌、抗病毒及抗氧化活性等。

环氧化酶(cyclooxygenase，COX)又称前列腺素(pros-taglandins，PG)内过氧化合成酶，为一种膜结合蛋白，是机体催化花生四烯酸转变为前列腺素的限速酶。目前研究表明，COX至少存在两种异构体，即COX-1和COX-2。COX-2为诱导酶，于1989年被Simmons等发现，静息状态下正常组织中无表达或弱表达，当受到细胞内外各种因素刺激时则迅速合成，表达增强。

CN 1689615A记载了将一组中药组合——大蓟、小蓟、广东紫珠、荷叶、栀子。洪燕龙.妇炎康泡腾片的制剂工艺，质量标准和广东紫珠化学成分的研究.北京：北京中医药大学，2004.该文利用体内试验验证了广东紫珠总黄酮具有抗炎活性。但所述文献均不涉及黄酮碳苷类化合物的抗COX-2活性的描述。

发明内容

为了寻找疗效更好、不良反应更小的抗炎新药，本发明人对传统医药中用于治疗炎症的植物类药进行了广泛深入的研究，从广东紫珠中分离得到3个黄酮碳苷类化合物，同时考察了化合物对COX-2表达的抑制活性。

因此，本发明的目的在于提供黄酮碳苷类化合物(I)：

在制备COX-2抑制剂中的应用；

其中，R₁＝H、MeO或β-D-glu；R₂＝H、β-D-glu或α-L-rha-(1→2)-β-D-glu。

本发明所述COX-2抑制剂用于预防或治疗宫颈炎疾病。

根据本发明一个优选的实施方式，R₁＝β-D-glu且R₂＝H，此时该黄酮碳苷类化合物(I)命名为化合物1，其化学名称为5，7，3′，4′-四羟基-8-C-β-D-葡萄糖黄酮碳苷，结构式如下：

根据本发明另一个优选的实施方式，R₁＝H且R₂＝α-L-rha-(1→2)-β-D-glu，此时该黄酮碳苷类化合物(I)命名为化合物2，其化学名称为5，7，3′，4′-四羟基-6-C-[α-L-鼠李糖-(1→2)]-β-D-葡萄糖黄酮碳苷，结构式如下：

根据本发明又一个优选的实施方式，R₁＝MeO且R₂＝β-D-glu，此时该黄酮碳苷类化合物(I)命名为化合物3，其化学名称为5，7，3′，4′-四羟基-8-甲氧基-6-C-β-D-葡萄糖黄酮碳苷，结构式如下：

上述化合物可从广东紫珠中提取得到，具体制备方法可参考下面具体实施方式。

本发明所述由广东紫珠中提取得到的黄酮碳苷类化合物(I)可按常规的药物制备方法，添加常规的赋形剂或药学上可接受的载体，可制得各种剂型的药物组合物。其应用方式为：在各单一活性成分或有两个以上活性成分的混合物加入相关的赋形剂，制成片剂、胶囊、软胶囊、液体制剂、颗粒剂、煎膏剂、丸剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、栓剂、注射剂。其中的赋形剂包括粘合剂，如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素等；崩解剂，如羧甲基纤维素钠、低取代羟丙纤维素等；稀释剂，如淀粉、糖粉、糊精、微晶纤维素、甘露醇、乳糖、大豆油等，润滑剂，如硬脂酸镁、滑石粉；甜味剂，如蔗糖、果糖、天冬甜素等；稳定剂，如羧甲基纤维素钠、环糊精等；防腐剂，如对羟基苯甲酸乙酯、苯甲酸钠等。

本发明所用的试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于公开了由广东紫珠提取得到的黄酮碳苷类化合物(I)具有明显的抑制环氧化酶-2的作用，可有效防治宫颈炎，阴道炎疾病。

附图说明

图1为实施例1制得的化合物1的¹HNMR谱；

图2为实施例1制得的化合物1的¹³CNMR谱；

图3为实施例1制得的化合物1的DEPT谱；

图4为实施例1制得的化合物1的¹H-¹H cosy谱；

图5为实施例1制得的化合物1的HSQC谱；

图6为实施例1制得的化合物1的HMBC谱；

图7为实施例1制得的化合物1的ESI-MS谱；

图8为实施例1制得的化合物2的¹HNMR谱；

图9为实施例1制得的化合物2的¹³CNMR部分放大谱；

图10为实施例1制得的化合物2的DEPT谱；

图11为实施例1制得的化合物2的¹H-¹H cosy谱；

图12为实施例1制得的化合物2的HMQC谱；

图13为实施例1制得的化合物2的HMBC谱；

图14为实施例1制得的化合物3的¹HNMR谱；

图15为实施例1制得的化合物3的¹³CNMR谱；

图16为实施例1制得的化合物3的HMQC谱；

图17为实施例1制得的化合物3的HMBC谱。

具体实施方式

下面用具体实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。除非特别说明，说明书中的单位以质量计。

仪器及试剂

核磁共振仪：Bruker DRX 400(德国)，TMS内标；FTIR-8201 PC型红外分光光度计(日本岛津)；WATERS ZQ2000质谱仪(美国)；中低压柱色谱仪(日本YMC公司)。

硅胶(200～300，300～400目)，薄层色谱分析预制板和制备预制板均为青岛海洋化工厂生产；Sephadex LH-20(Pharmacia Bioteck)；C18填料(日本YMC公司)。所用试剂均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

实施例1：5，7，3′4′-四羟基-8-C-β-D-葡萄糖黄酮碳苷、5，7，3′4′-四羟基-6-C-[α-L-鼠李糖-(1→2)]-β-D-葡萄糖黄酮碳苷、5，7，3′4′-四羟基-8-甲氧基-6-C-β-D-葡萄糖黄酮碳苷的制备

1)提取：取广东紫珠药材，粉碎(过24目筛)，加60％乙醇回流提取，醇用量为药材量的12(v/m)倍，提取3次，每次2小时，将提取液过滤后合并，干燥，得广东紫珠干浸膏。浸膏混悬于4倍量水中，上清液上AB-8大孔吸附树脂，静态吸附2小时，用3倍树脂体积的水除杂，后用80％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩即得纯化的广东紫珠总黄酮部位。

2)萃取：得到的广东紫珠总黄酮部位浸膏混悬于4倍量水中，以此用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取(萃取完全为止，每次用量为混悬液体积的2-3倍量)，各萃取液减压浓缩分别得氯仿部位、乙酸乙酯部位及正丁醇部位。

3)柱层析：将萃取得到的乙酸乙酯部位拌硅胶上柱，进行硅胶(300-400目)柱层析(15倍于样品质量的硅胶，120cm*6cm的柱子)，分别用石油醚∶乙酸乙酯(15∶1→8∶1→6∶1→4∶1→2∶1→1∶1)、乙酸乙酯、乙酸乙酯∶甲醇(50∶1→30∶1→15∶1→8∶1→6∶1→4∶1→2∶1→1∶1)梯度洗脱，每个梯度所用混合溶剂量为8倍柱体积，分别得到15个部分，收集石油醚∶乙酸乙酯(8∶1)(v/v)洗下流份，减压浓缩得洗脱部位II；乙酸乙酯洗下流份减压浓缩得洗脱部位VII。

4)纯化：将上述步骤所得的洗脱部位II进行sephadexLH-20凝胶柱层析(24cm*2cm的柱子)，用40％甲醇洗脱，15ml试管收集，每管10ml，薄层色谱跟踪合并，合并9-14试管，减压浓缩得5，7，3′，4′-四羟基-8-甲氧基-6-C-β-D-葡萄糖黄酮碳苷(化合物3)。合并17-28试管，减压浓缩得纯化部位，将该纯化部位进一步进行硅胶(300-400目)柱层析(15倍于样品质量的硅胶，20cm*2cm的柱子)，分别用石油醚∶乙酸乙酯(15∶1→8∶1→6∶1→4∶1)梯度洗脱，每个梯度所用混合溶剂量为5倍柱体积，15ml试管收集，每管5ml，TLC跟踪合并，其29-41试管减压浓缩得5，7，3′，4′-四羟基-8-C-β-D-葡萄糖黄酮碳苷(化合物1)。

将上述步骤所得的洗脱部位VII用少量甲醇溶解，少量聚酰胺(100-200目)拌样炒干，上聚酰胺柱(50cm*4cm的柱子)，用水、20％甲醇、40％甲醇、60％甲醇、80％甲醇依次洗脱，50ml三角瓶收集，每瓶25ml，收集20％甲醇洗脱部位，减压浓缩，用40％甲醇溶解，上sephadexLH-20柱(24cm*2cm的柱子)，用40％甲醇洗脱，15ml试管收集，每管10ml，TLC跟踪合并，合并7-17试管，减压浓缩得5，7，3′，4′-四羟基-6-C-[α-L-鼠李糖-(1→2)]-β-D-葡萄糖黄酮碳苷(化合物2)。

化合物1H谱和C谱数据：

浅黄色无定形粉末，易溶于甲醇、水。ESI-MS(m/z)：[M-H]^-447，确定化合物分子量为448。¹HNMR(400MHz，MeOD.)δ：6.52(1H，s，H-3)，6.46(1H，s，H-6)，7.38(1H，brs，H-2′)，6.89(1H，d，J＝8.0Hz，H-5′)，7.36(1H，d，J＝8.0Hz，H-6′)，4.90(1H，d，J＝10Hz，Glu-1)，4.15(1H，m，J＝8.0Hz，Glu-2)，3.49(1H，m，Glu-3)，3.50(1H，m，Glu-4)，3.42(1H，d，J＝4.4Hz，Glu-5)，3.89(1H，d，J＝8.0Hz，Glu-6)，3.75(1H，m，Glu-6)；¹³CNMR(100MHz，MeOD)δ：166.3(C-2)，103.9(C-3)，183.9(C-4)，158.7(C-5)，95.2(C-6)，164.9(C-7)，109.1(C-8)，162.0(C-9)，105.2(C-10)，123.5(C-1′)，114.2(C-2′)，147.0(C-3′)，151.0(C-4′)，116.8(C-5′)，120.3(C-6′)，75.3(Glu C-1)，72.6(GluC-2)，80.1(Glu C-3)，71.8(Glu C-4)，82.6(Glu C-5)，62.8(Glu C-6)。

化合物2H谱和C谱数据：

浅黄色无定形粉末，易溶于甲醇、水。ESI-MS(m/z)：[M-H]^-593，确定化合物分子量为594。¹HNMR(400MHz，MeOD.)δ：6.54(1H，s，H-3)，6.26(1H，s，H-8)，7.56(1H，d，J＝2.0Hz，H-2′)，6.92(1H，d，J＝8.4Hz，H-5′)，7.53(1H，q，J＝2.0、8.4Hz，H-6′)，5.02(1H，d，J＝10.0Hz，Glu-1)，4.25(1H，t，J＝8.4Hz，Glu-2)，5.09(1H，d，J＝1.2Hz，Rha-1)，0.65(3H，q，J＝5.2Hz，Rha-6)；¹³CNMR(100MHz，MeOD)δ：166.7(C-2)，103.6(C-3)，184.3(C-4)，157.9(C-5)，105.6(C-6)，164.5(C-7)，100.0(C-8)，162.9(C-9)，106.3(C-10)，124.2(C-1′)，115.1(C-2′)，147.0(C-3′)，150.9(C-4′)，116.8(C-5′)，120.9(C-6′)，73.7(Glu C-1)，78.0(Glu C-2)，81.7(Glu C-3)，72.4(Glu C-4)，82.9(Glu C-5)，63.4(Glu C-6)，102.5(Rha C-1)，72.4(Rha C-2)，72.0(Rha C-3)，73.5(RhaC-4)，69.8(Rha C-5)，18.0(Rha C-6)。

化合物3H谱和C谱数据：

浅黄色无定形粉末，易溶于甲醇、丙酮。ESI-MS(m/z)：[M-H]^-477，确定化合物分子量为478。¹HNMR(400MHz，MeOD.)δ：6.45(1H，s，H-3)，7.45(1H，d，J＝2.0Hz，H-2′)，6.80(1H，d，J＝8.2Hz，H-5′)，7.42(1H，q，J＝2.0、8.2Hz，H-6′)，3.80(3H，s，8-OCH₃)，4.89(1H，d，J＝9.6Hz，Glu-1)，3.83(1H，t，J＝9.6Hz，Glu-2)，3.72(1H，m，Glu-3)，3.90(1H，m，Glu-6)，3.97(1H，m，Glu-6)；¹³CNMR(100MHz，MeOD)δ：167.5(C-2)，103.4(C-3)，184.6(C-4)，153.6(C-5)，116.7(C-6)，163.0(C-7)，132.4(C-8)，153.7(C-9)，104.2(C-10)，124.5(C-1′)，114.9(C-2′)，147.0(C-3′)，151.3(C-4′)，116.8(C-5′)，120.9(C-6′)，75.7(Glu C-1)，72.8(Glu C-2)，80.1(Glu C-3)，72.5(Glu C-4)，82.9(Glu C-5)，63.2(Glu C-6)。

实施例2、本发明黄酮碳苷类化合物(I)的COX-2抑制活性

前列腺素PGE₂为已经证实的炎症因子，而环氧化酶-2(COX-2)是影响PGE₂合成的限速酶，因此选用COX-2酶抑制作用做为化合物的抗炎筛选模型，具体实验方法及数据如下。

测定方法参考文献为：Hee Kee Kim，Bong Sun Cheon，Young Ha Kim，et al.Effects of Naturally Occurring Flavonoids on Nitric Oxide Productionin the Macrop- hage Cell Line RAW264.7 and Their Structure-ActivityRelationships.Biochemical Pharmacology，1999，58：759-765。

1.仪器

酶标仪Labsystems，wellscan，MK.2

倒置显微镜37XB/37×BTV，上海光学仪器六厂

离心机KA-1000 上海飞鸽

双人超净工作台，苏州净化

CO₂培养箱，PHARMA SCIENTIFIC

可调式移液器(芬兰，5-40ul，40-200ul，200-1000ul)

2.试剂和材料

RAW264.7细胞，上海生物化学和细胞生物学研究所

胎牛血清，杭州四季青生物科技公司

DMEM培养基，Gibco公司；1×10⁵U.L^-1青霉素，100mg.L^-1链霉素；无菌过滤，4℃保存。

磷酸缓冲液(PBS)：NaCl 8g，KCl 0.2g，NaH₂PO₄1.15g，KH₂PO₄0.2g，溶于1L双蒸水，121℃高压消毒20min，4℃保存。

细胞刮刀，Gibco公司

PGE₂ ELISA检测试剂盒，Cayman化学公司

对照品，吲哚美辛批号：080401 Sigma公司

3.实验方法

10％ DMEM培养液的配置

取Gibco高糖DMEM培养基一份，加1.5g碳酸氢钠，溶解，于超净工作台上用0.45μm的纤维素膜过滤，加入10％体积分数的FBS，加入1％体积分数的双抗，摇匀。取少量营养液样品，于37℃，5％CO₂，饱和湿度培养2天，无细菌生长者，即可使用。

RAW264.7细胞的培养：

①将细胞从液氮中取出，在37℃水浴中迅速解冻，细胞在无菌操作台中移入10ml无菌离心管中加6ml DMEM细胞培养基，1000转/分离心5分钟。弃去上清液，沉淀中加入5-6ml DMEM细胞培养基，滴管吹打使其悬浮后移入细胞培养瓶中，置37℃细胞培养箱内。②次日，自培养箱中取出细胞，弃去细胞瓶中DMEM细胞培养基，加入5-6ml DMEM细胞培养基，置37℃细胞培养箱内。③隔日，自培养箱中取出细胞，弃去细胞瓶中DMEM细胞培养基，加入PBS(pH7.4)2-3ml晃动清洗，倒掉PBS溶液后再重复一次清洗。，用25cm的细胞刮刀轻轻刮下细胞，晃动均匀，分别移入2个干净培养瓶中，加入DMEM细胞培养基5-6ml吹打均匀，置于37℃细胞培养箱内。④隔日，重复③步骤。在整个培养过程中，贴壁细胞不允许生长过密，悬浮细胞始终保持对数生长期。

样品制备：

用DMSO溶解后，加入PBS配成1000μg/ml的溶液或均匀的混悬液，然后用PBS稀释。

对照品制备：

用DMSO溶解后，加入PBS配成1000μg/ml的溶液或均匀的混悬液，然后用PBS稀释。

将稀释好的样品加入平底96孔板中，每孔10μl，每点作两个平行测试。将DMSO相应作梯度稀释后加入板中，作为对照。

COX-2活性测试：

取生长状态良好，处于对数生长期的RAW264.7细胞，用细胞刮刀轻轻刮下细胞，加适量DMEM培养液，轻轻吹打，使细胞混匀，计数，用DMEM培养液调整细胞浓度为5×10⁵个/ml。96孔细胞培养板中，分别加入细胞培养液，LPS和待测化合物。37℃温孵24h后，用ELISA的方法，测定上清液中PGE₂的含量。见下表1。

表1、PGE₂测试体系

PGE₂的测定：

PGE₂采用ELISA的方法进行测定，按照试剂盒说明的方法进行操作。

4.测定供试品和对照品的抑制率

结果见下表2。

表2、PGE₂活性测试结果

由上表可见，本发明的黄酮碳苷类化合物(I)有较强的COX-2抑制活性，且在测试浓度为50μg/ml时，抑制活性均相当于对照品吲哚美辛。可为宫颈炎、阴道炎疾病的预防或治疗提供一种新途径，同时可以开发为新的环氧化酶抑制剂。

Claims (1)

1.黄酮碳苷类化合物(I）：

在制备用于预防或治疗宫颈炎疾病的药物中的应用；

其中，R₁＝MeO和R₂＝β-D-glu。