CN103211086B - 一种仿生微生态猪饲料的制作方法 - Google Patents
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Abstract
抗生素饲料的使用会对人体和环境造成不良后果，本发明提供一种不含抗生素的纯天然仿生微生态猪饲料的制作方法，仿照小猪(以中国优良猪种陆川母系与欧洲、美国外系公猪进行三元杂交的小猪)体内有益菌种类和比例配制混合菌后加入到普通饲料成分中发酵而成。通过本发明方法制作的仿生微生态猪饲料气味醇香，可吸收因子含量高，饲料成分更容易被猪吸收；有益菌的大量繁殖会形成优势菌群，以及好氧菌造成的缺氧环境均能抑制其他有害微生物的生长，防止饲料霉变，延长保质期。同时，有益菌大量增殖和代谢，生成多种有益代谢产物，可吸收营养因子含量丰富，更有利于猪吸收和利用；该饲料可部分或全部替代抗生素饲料进行保健养殖。
Description
技术领域
本发明涉及一种仿生微生态猪饲料的制作方法，属于养殖技术领域。
背景技术
随着经济社会的发展以及人们生活水平的提高，安全、绿色无公害禽畜产品越来越受到人们的欢迎。而目前饲用抗生素的使用不仅造成了饲养动物抗病能力的减弱、肉、蛋和奶等农畜产品质量下降，若抗生素使用不当，还会在禽畜中蓄积抗生素，通过食物链进入人体内，对人体健康构成严重的威胁。越来越严格的抗生素残留检测给我国肉类出口造成了巨大的损失，寻找一种不含抗生素的绿色安全饲料对我国养殖业的可持续发展以及人类食品安全至关重要。
众所周知，有益菌是微生态的调节剂，具有促进动物对营养素的吸收、提高免疫力、抑制肠道病源和腐败微生物的生长等作用。寡果糖是有益菌的养料、高效双歧杆菌增殖因子，利用寡果糖使有益菌大量繁殖、发酵而成的饲料同时具有保质期长，气味醇香以及容易被猪吸收等特点而具有广阔前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种不含抗生素的纯天然仿生微生态猪饲料的制作方法，该方法仿照小猪（以中国优良猪种陆川母系与欧洲、美国外系公猪进行三元杂交所产的小猪）体内有益菌种类和数量，通过筛选和培养猪体内的有益菌，仿照在猪体内的原有比例加入到普通饲料成分中发酵而制成仿生微生态猪饲料。通过该方法制成的饲料因其有益菌比例与猪体内相似，成分更容易被猪吸收和利用。
本发明解决技术问题采用的技术方案是：
一种仿生微生态猪饲料的制作方法，包括如下步骤：
1、从小猪体内筛选分离目的有益菌，获得有益菌比例并保存纯菌种；
2、将上述分离保存的有益菌进行活化和扩大培养；
3、将扩大培养后的纯有益菌进行混合；
4、将混合菌与果寡糖一起加入到普通饲料成分中密封进行发酵。
进一步的，混合菌、果寡糖和普通饲料成分重量百分含量分别为：
果寡糖 1-5%，
混合有益菌 1-10%，
余量为普通饲料成分；
其中，混合有益菌包含乳杆菌、双歧杆菌、丁酸梭菌、嗜热链球菌和酵母菌；普通饲料成分为玉米、豆粕、麸皮中的一种或多种的混合物，所述玉米、豆粕和麸皮经粉碎并过0.6毫米筛网。
仍进一步的，所述方法按如下重量比混合有益菌：
更进一步的，普通饲料成分中还可添加葡萄糖、复方中草药和氨基酸添加剂进行发酵，其中各物质占本发明饲料总重量的百分比为：
葡萄糖 5-10％，
复方中草药 1-5％，
氨基酸添加剂 0.1-5％；
其中，所述的氨基酸添加剂包含赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、精氨酸、谷氨酸；复方中草药包含黄芪、陈皮、甘草、板蓝根和山楂。
更进一步的，所述方法发酵时间为48-72小时，发酵温度为30-50℃。
更进一步的，所述小猪为中国优良猪种陆川母系与欧洲、美国外系公猪进行三元杂交所产的小猪。
猪体内五种主要有益菌的分离和培养：
1、猪消化道乳杆菌的分离、纯化：
样品采集：挑选33日龄健康断奶仔猪(以中国优良猪种陆川母系与欧洲、美国外系公猪进行三元杂交所产的小猪)1头，心脏放血法处死，开膛暴露整个消化道，从胃底部起逐段两端结扎。分胃、十二指肠前段、十二指肠中段、十二指肠后段、空肠前段、空肠中段、空肠后段、回肠、盲肠前段、盲肠中段、盲肠后段、升结肠前段、升结肠中段、升结肠后段、降结肠、直肠等16个样品。立即进行乳杆菌的分离。
分离：无菌操作取消化道各部位适量内容物和肠壁粘膜刮取物于盛有2mL灭菌生理盐水的小瓶内，振荡摇匀。用铂耳蘸取少量混悬液划线接种到新鲜MRS平板上，将平板放入二氧化碳培养箱中培养。培养条件：5％二氧化碳，37℃(如无特殊说明，下文涉及的乳杆菌培养条件与此相同)；培养时间：36h。
纯化：挑取36h培养平板上不同形态的单菌落（每个样品挑取10个，不足10个者重复取样）进行MRS平板划线纯化，连续纯化2-3次。最后一次纯化时根据不同部位选取部分形态不同的菌落，作好标记，用作初步筛选试验的菌株。另外将所有菌株用液体MRS扩大培养后加1/4体积甘油于-80℃保存备用。
MRS培养基成分：蛋白胨0.5g，牛肉膏0.5g，酵母膏0.5g，吐温800.05mL，葡萄糖1g，蒸馏水100mL，加入1.6%溴甲酚紫溶液约0.14mL。
2、仔猪粪便中双歧杆菌的分离
采集不同年龄阶段的从就近猪场取健康陆川母猪与外系公猪的乳猪的粪便，将它们一次排出的新鲜的粪便分别收集到预先准备好的干净塑料袋中，并迅速排出袋中的空气。采样后迅速分离培养。
3、仔猪粪便中酵母菌的分离
从就近猪场取健康陆川母猪与外系公猪的仔猪粪便，液氮冷冻后，运回，于低温冰箱(-85℃)保存。
取仔猪粪便稀释适当倍数，接种于麦芽汁琼脂培养基或酵母菌富集培养基，于28℃培养24h后观察。挑选酵母菌株于麦芽汁培养基留种。
3.1麦芽汁培养基成分
麦芽汁粉20g，葡萄糖粉10g，水1000mL。
3.2麦芽汁琼脂培养基成分
麦芽汁粉20g，葡萄糖粉10g，琼脂20g，水1000mL。
方法：取仔猪粪便稀释适当倍数，接种于麦芽汁琼脂培养基，于28℃培养24h后观察。挑选酵母菌株于麦芽汁培养基留种。
4、仔猪粪便中嗜热链球菌的分离
4.1分离培养基
BCG牛乳培养基成分：
（A）溶液：脱脂乳粉20g，水1000mL，加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液0.2mL。80℃灭菌20min；
（B）溶液：酵母膏2g，水100mL，琼脂4g，121℃湿热灭菌20min。
以无菌操作趁热将（A）（B）溶液混合均匀后倒8个平板。
4.2实验方法
嗜热链球菌分离与纯化
将新鲜酸奶采用稀释平板涂布法进行平板涂布分离。挑取培养基上的黄色菌落（菌落周围培养基变成黄色），采用划线法进行分离纯化，获得纯菌种。
菌种的革兰氏染色和形态观察
将分离的纯菌种搁在BCG牛乳培养基上，40℃培养28h，用无菌接种环取一环菌均匀涂布在滴有无菌水的载玻片上，自然风干。固定后进行革兰氏染色。染色后用显微镜油镜进行观察。
5、在猪粪便中丁酸梭菌的分离筛选
5.1培养基
（1）梭菌增殖培养基（RCM培养基）：酵母浸膏3g、牛肉浸膏10g、胰蛋白胨10g、葡萄糖5g、可溶性淀粉1g、氯化钠5g、三水合乙酸钠3g、半胱氨酸盐0.15g、琼脂15g（配固体培养基时用）、蒸馏水1000mL；调节pH至7.1，121℃下灭菌20min。
（2）梭菌选择性培养基（TSN培养基）：胰蛋白胨15g、酵母浸粉10g、亚硫酸钠1g、枸橼酸铁0.5g、新生霉素0.02g、多粘菌素0.05g、琼脂0.5g（配固体培养基时用），蒸馏水1000mL，pH7.2，121℃灭菌20min。
（3）种子培养基：葡萄糖24.4g，酵母浸膏20.8g，胰蛋白胨10g，(NH4)2SO41g、玉米浆3.7g、NaHCO31.24g，MnSO40.2g，MgSO40.2g，CaCl20.002g和琼脂20g（配固体培养基用），蒸馏水1000mL，初始pH为8.55，121℃灭菌20min。
（4）发酵培养基：葡萄糖20g，豆饼粉提取液4g，(NH4)2SO41g，NaHCO31.24g，玉米浆3.7g，MnSO40.2g，MgSO40.2g，CaCl20.002g和琼脂20g（配固体培养基用），蒸馏水1000mL，初始pH为7.3，121℃灭菌20min。
5.2分离培养方法
本实验中，运用常规厌氧培养方法来进行厌氧菌液体培养、分离和稀释平板计数。丁酸梭菌的分离：1、取猪场猪粪样品10g，加入到90mL无菌水中，80℃水浴10min，杀死非芽孢菌，转入梭菌增殖液体培养基，37℃厌氧培养48h。2、将上述培养液置于80℃水浴10min，转入梭菌选择性液体培养基，37℃厌氧选择性富集培养48h。3、梯度稀释培养液，涂布梭菌选择性培养基平板，置入厌氧培养罐，37℃培养48h。4、影印好氧和厌氧培养，除去好氧和兼性厌氧菌，得到严格厌氧菌。5、选取培养特征、菌落形态和显微形态均符合丁酸梭菌培养特征的菌株进行生理生化鉴定和16SrDNA序列分析鉴定。
将上述分离保存的有益菌用如下培养基分别进行活化和扩大培养：
表1有益菌的培养基种类
| 菌种 | 培养基种类 |
| 乳杆菌 | MRS培养基 |
| 双歧杆菌 | TPY培养基 |
| 丁酸梭菌 | RCM培养基 |
| 嗜热链球菌 | BCG牛乳培养基 |
| 酵母菌 | 麦芽汁培养基 |
其中，将菌种培养至浓度为1.0×108个/mL以上时，将各种菌按下列重量百分含量混合：
表2混合有益菌的重量百分含量
| 菌种名称 | 重量百分含量 |
| 乳杆菌 | 40-60% |
| 双歧杆菌 | 20-30% |
| 丁酸梭菌 | 5-15% |
| 嗜热链球菌 | 2-8% |
| 酵母菌 | 1-7% |
将混合菌与其他成分混合，装入特种单向透气膜的密封食品级塑料袋中于30-50℃下发酵48-72h即可制得本发明的饲料。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：由于该方法利用猪体内的有益菌进行密封发酵，好氧有益菌、兼性厌氧与专性厌氧有益菌制作仿生态饲料，其中，好氧菌大量增殖、代谢，造成缺氧环境，接着兼性厌氧菌和专性厌氧菌增殖并代谢，最后三者会达到平衡状态，有益菌的大量繁殖会形成优势菌群，以及好氧菌造成的缺氧环境均能抑制其他有害微生物的生长，防止饲料霉变，使饲料保质期可延长1-2个月。同时，该法仿照猪体内有益菌比例将其加入饲料中，有益菌大量增殖和代谢，生成多种有益代谢产物，可吸收营养因子含量丰富，更有利于猪吸收和利用。
附图说明
图1为双歧杆菌的分离保存流程图。
具体实施方式
实施例1
1、取出生3-7天的健康陆川母猪与外系公猪的仔猪粪便或者消化道，于无菌操作台内接种入灭过菌的固体MRS培养基培养48h；将菌液稀释后涂布到灭过菌的固体平板培养基上，于 38℃恒温培养箱中培养48h；对筛选培养基上长出的单菌落进行复筛，以获得纯化的目的菌；将筛选出的目的菌进行培养，然后将其加入普通饲料成分中进行发酵，观察比较发酵效果；筛选出发酵效果好的目的菌进行保存。
2、将上述分离保存的有益菌分别进行活化和扩大培养。
3、将菌种培养至浓度为1.0×108个/mL以上时，将各种菌按下列重量百分含量混合：
表3混合有益菌重量百分含量
| 菌种名称 | 菌液重量百分含量 |
| 乳杆菌 | 56% |
| 双歧杆菌 | 32% |
| 丁酸梭菌 | 8% |
| 嗜热链球菌 | 3% |
| 酵母菌 | 1% |
4、将混合菌与其他成分按如下比例混合：
果寡糖 5%，
混合有益菌 5%，
玉米： 40%，
豆粕： 20%，
麸皮： 30%。
混合之后密封于30-50℃下发酵48h即可饲用。
实施例2：
1、取出生3-7天的健康陆川母猪与外系公猪的仔猪粪便或者消化道，于无菌操作台内接种入灭过菌的固体MRS培养基培养48h；将菌液稀释后涂布到灭过菌的固体平板培养基上，于38℃恒温培养箱中培养48h；对筛选培养基上长出的单菌落进行复筛，以获得纯化的目的菌；将筛选出的目的菌进行培养，然后将其加入普通饲料成分中进行发酵，观察比较发酵效果；筛选出发酵效果好的目的菌进行保存。
2、将上述分离保存的有益菌分别进行活化和扩大培养。
3、将菌种培养至浓度为1.0×108个/mL以上时，将各种菌按下列重量百分含量混合：
表4混合有益菌重量百分含量
| 菌种名称 | 菌液重量百分含量 |
| 乳杆菌 | 48% |
| 双歧杆菌 | 33% |
| 丁酸梭菌 | 10% |
| 嗜热链球菌 | 6% |
| 酵母菌 | 3% |
4、将混合菌与其他成分按如下重量比例混合：
玉米： 40%，
豆粕： 20%，
麸皮： 21%，
葡萄糖： 5%，
果寡糖： 5%，
氨基酸添加剂： 2%，
混合有益菌： 6%，
复方中草药： 1%。
混合之后密封于30-50℃下发酵56h即可饲用。
为了验证通过本发明方法制作的饲料对猪生长的影响，进行了如下试验：
试验选取猪场健康且体重基本一致的断奶仔猪99头，采用单因素实验设计，设2个处理，每个处理设4个重复，每个重复12-13头猪，对照组饲用普通饲料，实验组饲用本发明饲料，实验期为43天。
在实验开始日（断奶日）、实验结束日空腹分别称重、结料，并以处理为单位计算，统计各阶段实验中猪日增重、生长速度和饲料增重比。
每天观察猪排便状况，并记录腹泻天数，腹泻的判断以采集粪样含水量超过70%、不成形为准，腹泻频率=Σ（腹泻仔猪头数×仔猪腹泻天数）/（试验仔猪头数×正试期天数）×100%。同时记录粪便情况。
实验结果分析
表5本发明饲料对断奶仔猪的生产性能和免疫机能的影响
| 项目 | 实验组 | 对照组 |
| 仔猪头数 | 49 | 50 |
| 平均头日增重（Kg） | 0.51 | 0.42 |
| 腹泻率 | 1.32% | 4.9% |
| 生病治疗总头次 | 4 | 7 |
| 料重比（总耗料/总增重） | 1.78 | 2.00 |
如表5所示，实验组比对照组日增重高21.4%，而料重比降低了11%，说明本发明饲料可吸收营养因子高，饲料成分更容易被猪吸收。同时，从本实验观察结果可知，对照组腹泻率是实验组的3.7倍，实验组无黄痢拉稀现象，对照组陆续有拉稀现象出现，时间持续长，随着气温升高，后期不断出现黄痢，猪群消瘦，甚至死亡，说明本发明饲料能够提高猪的免疫力，有效防止疾病的发生。
Claims (5)
1.一种仿生微生态猪饲料的制作方法，包括如下步骤：
1)从小猪体内筛选分离目的有益菌，获得有益菌比例并保存纯菌种；
2)将上述分离保存的有益菌进行活化和扩大培养；
3)将扩大培养后的纯有益菌进行混合；
4)将混合菌与果寡糖一起加入到普通饲料成分中密封进行发酵，发酵时间为48-72小时，发酵温度为30-50℃；
其中，所述混合菌中有益菌的种类和混合比例为：
所述混合菌、果寡糖和普通饲料成分重量百分含量分别为：
果寡糖 1-5％，
混合有益菌 1-10％，
余量为普通饲料成分；
所述普通饲料成分为玉米、豆粕、麸皮中的一种或多种的混合物。
2.根据权利要求1所述的一种仿生微生态猪饲料的制作方法，其特征在于：所述普通饲料成分经粉碎并过0.6毫米筛网。
3.根据权利要求1或2所述的一种仿生微生态猪饲料的制作方法，其特征在于：所述方法还可添加葡萄糖，复方中草药，氨基酸添加剂到普通饲料成分中进行发酵，其中各物质重量占所述仿生微生态猪饲料的总重量的百分比为：
葡萄糖 5-10％，
复方中草药 1-5％，
氨基酸添加剂 0.1-5％；
其中，所述的氨基酸添加剂包含赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、精氨酸、谷氨酸；复方中草药包含黄芪、陈皮、甘草、板蓝根和山楂。
4.根据权利要求3所述的一种仿生微生态猪饲料的制作方法，其特征在于：所述方法中混合菌液、果寡糖、葡萄糖、复方中草药、氨基酸添加剂与普通饲料成分混合后进行发酵，发酵时间为48-72小时，发酵温度为30-50℃。
5.根据权利要求1所述的一种仿生微生态猪饲料的制作方法，其特征在于：所述小猪为中国优良猪种陆川母系与欧洲、美国外系公猪进行三元杂交所产的小猪。
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