CN103210904B

CN103210904B - 一种川芎种质的离体保存方法及川芎离体保存培养基

Info

Publication number: CN103210904B
Application number: CN201210475218.3A
Authority: CN
Inventors: 蒋桂华; 马逾英; 张俊; 唐琳; 梅兰菊; 朱玲玲; 陈佳妮
Original assignee: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2012-11-21
Filing date: 2012-11-21
Publication date: 2014-12-17
Anticipated expiration: 2032-11-21
Also published as: CN103210904A

Abstract

本发明公开了一种川芎种质的离体保存方法，它包括如下步骤：（1）取川芎茎尖，消毒灭菌；（2）将步骤（1）处理后的川芎茎尖接种于川芎离体保存培养基中保存，保存条件为：温度4~25℃，光照强度600~1500lx，光照时间10~14h/d；所述保存培养基以1/2MS培养基为基础培养基，添加20~30g/L蔗糖，或者以MS培养基为基础培养基，添加20~60g/L蔗糖。本发明还公开了一种川芎种质的离体保存培养基。本发明川芎种质的离体保存方法操作方便，操作简单，保存效果优良。

Description

一种川芎种质的离体保存方法及川芎离体保存培养基

发明内容

本发明属于栽培领域，涉及一种川芎种质的离体保存方法及川芎离体保存培养基。

背景技术

川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的根茎，为我国的传统中药，也是著名的川产道地药材，具有近两千年的栽培和使用历史。历代医家均作为治头痛、活血行气、祛风止痛药使用。2005版《中国药典》一部中收载的成方制剂和单味制剂共564种，其中使用川芎的有85种，约占药典收载中成药的15%。在2010年版《中国药典》收载的1039个成方制剂和单味制剂中，含川芎的有155个，占所载成方制剂总数的14.92%。两版药典使用川芎的收载处方增加了82.35%，说明川芎使用量和需求量在不断提高。现代临床上主要用于治疗心脑血管系统的疾病，效果显著，如“速效救心丸”等。川芎除供药用外，还用于保健品、美容化妆品、饲料添加剂、烟用香料添加剂及天然防腐剂等，国内外市场需求量大。

川芎是无性繁殖，生产上用膨大的地上茎节（苓种或芎苓子）作为繁殖材料。长期以来，川芎种植基本处于自发状态，苓种繁育仍然停留在自繁自用，缺乏统一的生产技术规程和科学的组织管理，且没有苓种分级标准和检验规程，导致川芎苓种质量良莠不齐，使产区川芎药材的产量和质量受到极大影响。经过上千年的栽种，加上缺乏选种育种，存在一定程度的种质退化。

蒋桂华等，“川芎种质资源的调查收集与保存研究”，中草药，2008年4月第39卷第4期与高农等，“川芎苓子繁育技术”，药用植物·特种经济动植物2004年第10期均报道了的川芎种质的保存方法，但均为传统的田间保存方法，存在耗费人力物力，容易损失，成本高，保存效果不佳等缺点。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明提供了一种川芎种质的离体保存方法其离体保存培养基。

本发明川芎种质的离体保存方法，它包括如下步骤：

（1）取川芎茎尖，消毒灭菌；

（2）将步骤（1）处理后的川芎茎尖接种于川芎离体保存培养基中保存，保存条件为：温度4~25℃，光照强度600~1500lx，光照时间10~14h/d；所述保存培养基以1/2MS培养基为基础培养基，添加20~30g/L蔗糖，或者以MS培养基为基础培养基，添加20~60g/L蔗糖。

其中，所述步骤（1）包括如下步骤：

1）消毒：取川芎茎尖，用消毒粉消毒其表面；

2）灭菌：取步骤1）处理后的川芎茎尖，用70%乙醇灭菌30s，再用HgCl₂灭菌2~5min，或者先用70%乙醇灭菌15s，再用HgCl₂灭菌5min。

其中，步骤（2）所述保存培养基以1/2MS培养基为基础培养基，添加20g/L蔗糖，或者以MS培养基为基础培养基，添加40g/L蔗糖。

其中，步骤（2）所述保存培养基中含有植物生长抑制剂。

植物生长抑制剂：是抑制或破坏植物顶端分生组织的分裂与膨大的一类化学物质，它能延缓细胞分裂和伸长，达到控制部分生长、刺激花芽分化、延缓衰老等目的。

所述植物生长抑制剂为多效唑、矮壮素、烯效唑或者青鲜素。

优选地，所述多效唑的浓度不低于0.5mg/L；所述矮壮素的浓度为0~40mg/L。进一步优选地，所述多效唑的浓度为0.5mg/L；所述矮壮素的浓度为40mg/L。

其中，步骤（2）所述保存条件为：温度为25℃，光照强度为800lx，光照时间为12h/d。

本发明川芎离体保存培养基，它以1/2MS培养基为基础培养基，添加20~30g/L蔗糖，或者以MS培养基为基础培养基，添加20~60g/L蔗糖。

其中，所述保存培养基以1/2MS培养基为基础培养基，添加20g/L蔗糖，或者以MS培养基为基础培养基，添加40g/L蔗糖。

其中，所述保存培养基中还添加有植物生长抑制剂。所述植物生长抑制剂为多效唑、矮壮素、烯效唑或者青鲜素。

本发明保存方法实现了离体保存川芎种质，操作方便，成本低廉，可以保证川芎的遗传稳定性，从而保留优质的川芎资源，具有良好的市场应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗存活率柱状图（1月）

图2不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗株高柱状图（1月）

图3不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗存活率柱状图（2月）

图4不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗株高柱状图（2月）

图5不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗存活率柱状图（3月）

图6不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗株高柱状图（3月）

图7不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗存活率柱状图（4月）

图8不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗株高柱状图（4月）

图9不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗存活率柱状图（5月）

图10不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗株高柱状图（5月）

图11不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗存活率柱状图（6月）

图12 不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗存活率柱状图（6月）（不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗株高（6月））

图13不同培养基和蔗糖浓度在不同保存时间对试管苗存活率的影响

图14不同培养基和蔗糖浓度在不同保存时间对试管苗株高的影响

图15不同浓度PP₃₃₃对川芎试管苗存活率的影响

图16不同浓度PP₃₃₃对川芎试管苗株高的影响

图17不同浓度CCC对川芎试管苗存活率的影响

图18不同浓度CCC对川芎试管苗株高的影响

图19川芎再生苗（4号）

图20 SOD图谱，从左到右：川芎再生苗CK2 CK1（11号）

图21 POD-VC图谱，从左到右：CK1 CK2川芎再生苗（14号）

图22 POD-愈创木酚图谱，从左到右：CK1 CK2川芎再生苗（4号）

图23 CAT图谱（经典法），从左到右：CK1 CK2川芎再生苗（11号）

图24 CAT图谱（高锰酸钾法），从左到右：CK1 CK2川芎再生苗（14号）

具体实施方式

缩略语：PP₃₃₃：多效唑；CCC：矮壮素。

实验材料：消毒粉、洗洁精、PP₃₃₃、CCC、MS培养基、1/2MS培养基，均为市售品。

实施例1外植体的筛选实验

1、实验方法

分别选择川芎茎节、顶端幼嫩茎尖作为外植体在MS培养基中离体培养。

茎尖：用去污粉浸泡，清水冲洗20min，在无菌操作台上用70%酒精消毒60s，升汞消毒7min30s。

茎节：用去污粉浸泡，清水冲洗20min，在无菌操作台上用70%酒精消毒70s，升汞消毒8min。

2、实验结果

两周内，大多数茎节褐化并产生霉菌，而茎尖仅有少部分褐化死亡，污染较少，说明川芎的茎尖可以作为离体保存的外植体，而茎节不适合作为离体保存的外植体。

实验说明，本发明保存方法中，使用川芎茎尖作为川芎种质进行保存是有效的。

实施例2消毒灭菌方法的选择

1、实验方法

取川芎茎尖作为外植体，按照表1，对外植体外表面消毒灭菌方法进行考察：

表1川芎茎尖灭菌方法对比

考察指标：方法灭菌后，接种到MS培养基中，观察川芎试管苗是否有生霉或褐化现象。

2、实验结果

实验结果如表2~4所示：

表2外表面消毒试剂的筛选

由表2可知，消毒粉灭菌后，川芎试管苗未出现无生霉褐化，洗洁精灭菌后，川芎试管苗生霉率为40%，说明消毒粉可以有效地对川芎茎尖进行灭菌，而洗洁精不适用。

表3外表面消毒方法的筛选

用毛刷蘸取粉末状消毒粉刷茎尖外表面，再用清水冲

用消毒粉液浸泡10min后，再用清水冲洗

洗20min，70%酒精消毒30s，升汞消毒5分钟	20min，70%酒精消毒30s，升汞消毒5分钟
		无生霉褐化	生霉60%

由表3可知，用毛刷蘸取消毒粉仔细刷茎尖外表面后，川芎试管苗未出现无生霉褐化，消毒粉液浸泡10min后，川芎试管苗生霉率为60%，说明毛刷蘸取消毒粉仔细刷茎尖外表面的方式可以有效地对川芎茎尖进行消毒，而消毒粉液浸泡的方式则不适用。

表4灭菌试剂的筛选

由表4可知，70%乙醇灭菌30s+HgCl₂灭菌2~5min的组合，或者70%乙醇灭菌15s+HgCl₂灭菌5min的组合，既可以较好的灭菌，生霉率低于20%，也能保证茎尖不出现褐化而死亡，其中，70%乙醇灭菌15s+HgCl₂灭菌5min的组合最优。

实验说明，用本发明消毒灭菌方法既可以较好的消毒灭菌，也能保证茎尖不出现褐化而死亡。

实施例3离体保存培养基的筛选实验

1、实验方法

设计培养基基本成分（MS、1/2MS），附加浓度为20、30、60g/L蔗糖共3个实验处理，每试验处理接种5瓶，每瓶接种3个实施例2处理后的川芎茎尖。

编号如下：1号:MS+蔗糖20g/L；2号:MS+蔗糖30g/L；3号:MS+蔗糖60g/L；4号:1/2MS+蔗糖20g/L；5号:1/2MS+蔗糖30g/L；6号:1/2MS+蔗糖60g/L,以2号处理为对照，下同。

培养温度为25±2℃，光照强度为1000~1500lx，光照时间每天12h，连续培养6个月。每个月观察川芎试管苗的存活率和平均株高。

2、试验结果

实验结果见表5~表10、图1~图12。

表5不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗存活率及株高（1月）

注：同列内相同字母表示在0.05水平上差异不显著。下同。

表6不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗存活率及株高（2月）

注：同列内相同字母表示在0.05水平上差异不显著，ab表示与标示为a和标示为b的差异均不显著，下同。

表7不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗存活率及株高（3月）

表8不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗存活率及株高（4月）

表9不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗存活率及株高（5月）

表10不同培养基基本成分和不同蔗糖浓度保存试管苗存活率及株高（6月）

将不同培养基和蔗糖浓度保存试管苗1~6个月的各组对比试验数据做成折线图分析，结果见图13、14。

根据表5~10，图1~图14的数据可以得知，6号不适合用于川芎离体保存，1~5号可用于川芎离体培养，综合试管苗的存活率和株高，以2号：MS+蔗糖30g/L和4号1/2MS+蔗糖20g/L的效果最优。

实验说明，在本发明培养基上，川芎茎尖的存活率高，株高低，在本发明优选的培养基上，存活率更高，株高更低。

实施例4生长抑制剂PP₃₃₃保存试验

1、实验方法

以MS+蔗糖30g/L为基本培养基，添加不同浓度PP₃₃₃，以不添加为CK对照。每试验处理接种5瓶，每瓶接种3段川芎茎尖，于低温4±2°C与800lx弱光照的条件下进行培养，每个月记录观察一次，观察生长情况及保存的存活率。

编号如下：7号:MS+蔗糖30g/L；8号:MS+蔗糖30g/L+PPP₃₃₃0.1mg/L；9号:MS+蔗糖30g/L+PPP₃₃₃0.2mg/L；10号:MS+蔗糖30g/L+PPP₃₃₃0.5mg/L。

2、实验结果

试验结果见表11、表12，图15、图16。

表11不同PP₃₃₃蔗糖浓度保存试管苗存活率

表12不同PP₃₃₃蔗糖浓度保存试管苗株高

从表11~12及图15~16可以看出：

1、与未加PP₃₃₃的对照组相比，添加0.1~0.2mg/L的PP₃₃₃，植株的株高更高，存活率更低，添加0.5mg/L的PP₃₃₃，植株的株高更低，存活率显著更高；

2、随着PP₃₃₃浓度的增加，植株株高有降低的趋势，同时存活率也逐渐升高。

实验说明，在本发明培养基中添加0.5mg/L的PP₃₃₃，能降低植株株高，提高存活率。

实施例5矮壮素CCC的保存实验

1、实验方法

试管苗MS+蔗糖30g/L的基本固体培养基中，添加不同浓度CCC，以不添加为CK对照。每试验处理接种5瓶，每瓶接种3段川芎茎尖，培养温度为25±2℃，光照强度为1000~1500lx，光照时间每天12h，连续培养6个月。每个月观察以上指标。编号如下：11号：MS+蔗糖30g/L+CCC 10mg/L；12号：MS+蔗糖30g/L+CCC 20mg/L；13号：MS+蔗糖30g/L+CCC 30mg/L；14号：MS+蔗糖30g/L+CCC 40mg/L；以2号处理（MS+蔗糖30g/L）作为空白对照。试验结果见表13、表14，图17、图18。

表13不同浓度CCC保存的川芎试管苗株高

表14不同浓度CCC保存的川芎试管苗存活率

从表13~14及图17~18可以看出：与未使用矮壮素的对照组相比，添加10~40mg/L的矮壮素可以提高植株存活率，不能抑制川芎植株生长，其中添加40mg/L的矮壮素，植株存活率最高，川芎植株株高最低。

实验说明，在本发明培养基中添加矮壮素，能降低植株株高，提高存活率。

实施例6温度和光照对试管苗的影响试验

1、实验方法

以MS+蔗糖30g/L为固体培养基，设计4个温度和光照处理，每个处理设置5瓶，每瓶接种5段川芎茎尖，于常规条件下培养2天，然后分别在下述4个处理中进行培养。观察半年，分别于1、3、6个月观察记录其保存存活率和生长分化情况。

2、实验结果

试验结果见表15。

表15温度和光照对川芎试管苗保存的影响

由表15可知，川芎试管苗在光照条件下才能正常生长，黑暗条件不适宜川芎试管苗的生长。4℃低温条件在前3个月能提高试管苗存活率，但对试管苗生长的延缓作用不明显。延长到6月，低温条件下的川芎试管苗存活率大幅降低，全部死亡。

实验说明，在本发明保存条件下，川芎试管苗可以存活，株高低，在本发明优选的保存条件下，川芎试管苗存活时间长，株高更低。

实验例1本发明川芎种质的各性能检测

1、实验材料

以上经过限制生长离体保存（14号：MS+蔗糖30g/L+CCC 40mg/L，1000~1500lx，每天光照12h；11号：MS+蔗糖30g/L+CCC 10mg/L，1000~1500lx，每天光照12h；4号：1/2MS+蔗糖20g/L，1000~1500lx，每天光照12h）；恢复生长成活1个月后的川芎再生苗；CK1：没有经过离体保存的川芎试管苗（MS+蔗糖30g/L，1000~1500lx，每天光照12h）；CK2：大田生长的川芎苗。

2、实验方法

（1）恢复生长实验

对以上保存了6个月的试管存活苗，14号（9株）、11号（7株）、4号（5株），放在温室中揭去封口膜炼苗2~3d，取出小苗，流水洗净培养基，移栽到花盆中，置于半荫处；或上面用烧杯翻盖加以保护，适当浇水。

（2）种质遗传稳定性的检测

①形态特征比较：观察川芎再生苗和大田生长的川芎苗在叶色、叶型、株高、直径等外部形态特征是否有差异。

②遗传比较（同工酶检测，同工酶是基因表达的直接产物之一，能够反映出保存材料的遗传稳定性）：将恢复生长的再生植株和CK1、CK2提取过氧化物酶同工酶、酯酶同工酶和过氧化氢酶，进行电泳，比较各组电泳条带的差异。

样品的制备：提取液PB磷酸缓冲溶液（PH 7.0），液氮研磨，按照0.2g川芎苗加1ml酶提取液比例提取，12000rmp，5min。

电泳：PAGE，分离胶（8%），浓缩胶（5%），SOD和POD同工酶160V电泳1小时；CAT同工酶160V电泳两个小时或200V一个半小时。

染色：

a．SOD（酯酶同工酶）

MTT溶液（0.1g MTT,50ml PB（PH 7.5，微热加速溶解）用黑色塑料袋包裹，30℃浸泡20min，用冷蒸馏水清洗2-3次。然后用核黄素溶液（100ml蒸馏水，0.4ml TEMED，0.5mg核黄素）50ml在30℃光照下染色，20min，染两次。清洗后观察、扫描。

b．POD（过氧化物酶同工酶）

愈创木酚-联苯胺法：0.2mol/L醋酸钠溶液，5mmol/L硫酸锰溶液，10%冰醋酸为溶剂的2%联苯胺溶液（60℃微热促溶），10%冰醋酸为溶剂的5%愈创木酚，2%双氧水，按照20:2:5:8:5体积染色前加在一起，混匀，室温下染色30min。

Vc--联苯胺法：Vc溶液（70.5mg，60ml蒸馏水），联苯胺溶液（0.444g联苯胺，16ml蒸馏水，4ml冰醋酸，微热促溶），双氧水溶液（0.4ml 30%双氧水，20ml蒸馏水）染色前混合均匀，室温下15~20min。

c．CAT（过氧化氢酶）

经典传统方法：0.03%双氧水浸泡20min，用冷却蒸馏水清洗2-3次，然后用反应液（2%氯化铁：2%铁氰化钾=1:7的体积比，染色前混合均匀）室温下染色。

高锰酸钾法：0.3%双氧水浸泡20min，然后用0.2%高锰酸钾溶液室温下浸泡。

3、结果与分析：

（1）恢复生长实验中，移栽成活率达90%以上。

（2）种质遗传稳定性

①形态特征观察对比结果表明，经过本发明方法保存后的川芎种质能恢复生长为正常植株，并且外部特征与大田川芎没有明显差异。见图19。

②同工酶检测：酯酶同工酶、过氧化物酶同工酶和过氧化氢酶电泳谱带见图20~24，限制生长离体保存的再生植株与CK1、CK2比较，电泳条带无差异，图谱中没有特异性谱带出现。

实验说明，本发明保存方法保存效果良好，并且，与未经保存的川芎试管苗的外观特性和遗传特性一致，不会造成川芎种质变异，可以有效保存川芎种质的遗传特性。

综上，本发明保存方法可以有效保存川芎种质，操作简便，成本低廉，应用前景良好。

Claims

1.一种川芎种质的离体保存方法，其特征在于：它包括如下步骤：

（1）取川芎茎尖，消毒灭菌；

（2）将步骤（1）处理后的川芎茎尖接种于川芎离体保存培养基中保存，保存条件为：温度4~25℃，光照强度600~1500lx，光照时间10~14h/d；所述保存培养基以1/2MS培养基为基础培养基，添加20~30g/L蔗糖，或者以MS培养基为基础培养基，添加20~60g/L蔗糖；所述步骤（1）包括如下步骤：

1）消毒：取川芎茎尖，用消毒粉消毒其表面；

2）灭菌：取步骤1）处理后的川芎茎尖，用70%乙醇灭菌30s，再用HgCl₂灭菌2~5min，或者先用70%乙醇灭菌15s，再用HgCl₂灭菌5min；

所述保存培养基还添加有植物生长抑制剂；所述植物生长抑制剂为多效唑、矮壮素、烯效唑或者青鲜素；所述多效唑的浓度不低于0.5mg/L；所述矮壮素的浓度为0~40mg/L。

2.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于：步骤（2）所述保存培养基以1/2MS培养基为基础培养基，添加20g/L蔗糖，或者以MS培养基为基础培养基，添加40g/L蔗糖。

3.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于：所述多效唑的浓度为0.5mg/L；所述矮壮素的浓度为40mg/L。

4.根据权利要求1所述的保存方法，其特征在于：步骤（2）所述保存条件：温度为25℃，光照强度为800lx，光照时间为12h/d。