CN103205386B

CN103205386B - 一种紫金牛叶杆菌

Info

Publication number: CN103205386B
Application number: CN201310140931.7A
Authority: CN
Inventors: 李松棠; 王婷婷; 陈宏宇; 张方元; 单煜巽
Original assignee: AEGIS PETROLEUM TECHNOLOGY (SHANGHAI) CO LTD
Current assignee: AEGIS PETROLEUM TECHNOLOGY (SHANGHAI) CO LTD; An Jieshi Environmental Protection Shanghai Co ltd
Priority date: 2012-07-27
Filing date: 2012-07-27
Publication date: 2014-06-18
Anticipated expiration: 2032-07-27
Also published as: CN103205386A

Abstract

本发明提供了一种紫金牛叶杆菌，保藏号为CGMCC No：5783。将保藏号为CGMCC No：5782的枝孢霉菌和本发明的菌株分别放入两个培养基中进行摇床培养，然后再向装有上述特定培养基的两个反应器中按体积百分比5%～15%的接种量分别接种上述两个菌种，连续培养8～48h，得到液体菌液，然后将培养好的液体菌液进行复配，得到微生物复合菌剂。通过微生物在压裂液返排液中的生长繁殖和驯化，使微生物不断适应油田废水的生长环境，最终达到降解压裂液返排液化学需氧量的目的，本发明能够有效的用于压裂液返排液中高分子、有机物的降解，降解率高，水质清澈，降低了对水体环境和土壤环境的二次污染。

Description

一种紫金牛叶杆菌

本申请是申请号为“201210264645.7”、申请日为“2012年07月27日”、发明名称为“一种处理油田压裂返排液的微生物复合菌剂及其制备方法”的分案申请。

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及微生物及其复合菌剂，具体来说是一种处理油田压裂返排液的微生物复合菌剂及其制备方法。

背景技术：

通常油田提高油气井增产的主要措施是采用油气井的压裂液作业，然而在压裂作业的过程中，会产生大量的油田压裂返排液，压裂液返排液组成比较复杂。由于压裂液含有大量的高分子有机化合物，导致压裂液COD值浓度较高，处理技术难度较大。

目前，国内针对油田压裂返排液的处理方法主要有以下几点：

1)焚烧：主要是通过高温氧化将高浓度有机废液进行分解，使有机物转化成水和二氧化碳等无机产物，此方法对环境条件要求较高，耗能较大，应用起来较为困难。

2)储备池：在采油作业后，将压裂液储存在废液池中，此方法虽然能够暂时将废液进行搁置，却无法从根本上对压裂液进行处理，且由于敞口放置，同时也存在着二次污染的问题。

3)回注：目前大部分油田都采用回注法将作业废水从注水站打入底层，该方法可节约成本，并避免造成二次污染。

在油田压裂返排液处理中，环境微生物技术是最具有发展前景的技术，也是未来环境治理的主导技术，微生物处理技术具有低运行成本、应用范围广等优点。与物理化学方法相比，生物处理法可通过在特定环境下对微生物进行筛选纯化，选育出能够适应特定环境下的微生物菌株，通过驯化培养，使微生物对生存环境适应性不断提高，最终实现对压裂液返排液中高分子有机污染物的生物降解处理。

通过中国专利数据库检索，并没有发现用微生物复合菌剂对油田压裂液返排液进生物降解的类似处理方法。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种处理油田压裂返排液的微生物复合菌剂，所述的这种处理油田压裂返排液的微生物复合菌剂要解决现有技术中的处理油田压裂返排液的方法降解困难、同时伴随二次污染的技术问题。

本发明提供了一种枝孢霉菌，其分类命名为Cladosporium sp.，保藏号为CGMCC No：5782。

本发明还提供了一种紫金牛叶杆菌，其分类命名为Phyllobacteriummyrsinacearum，保藏号为CGMCC No：5783。

本发明还提供了一种处理油田压裂返排液的微生物复合菌剂，所述的复合菌剂中含有胍胶、KH₂PO₄、K₂HPO₄、MgSO₄、CaCl₂、NaCl和水，在1L所述的水中，含有0.1g～5g的胍胶、0.05g～1g的KH₂PO₄、0.05g～2g的K₂HPO₄、0.01g～0.1g的MgSO₄、0.01g～0.5g的CaCl₂和0.01g～0.2g的NaCl，在所述的菌剂中，还加入有保藏号为CGMCC No：5782和CGMCC No：5783的菌株，所述的CGMCC No：5782的菌株的接种体积为1L水的2.50%～12.5%，所述的CGMCCNo：5783的菌株的接种体积为1L水的0.833%～7.5%。

本发明还提供了一种制备上述处理油田压裂返排液的微生物复合菌剂的方法，其中，将保藏号为CGMCC No：5782的枝孢霉菌菌株和保藏号为CGMCC No：5783的紫金牛叶杆菌菌株分别放入两个培养基中进行摇床培养，所述的培养基由水组成，每升水中含有0.1g～5g的胍胶、0.05g～1g的KH₂PO₄、0.05g～2g的K₂HPO₄、0.01g～0.1g的MgSO₄、0.01g～0.5g的CaCl₂和0.01g～0.2g的NaCl，培养时间为3～10天，培养温度为5～30℃，然后再向装有上述培养基的两个反应器中按照体积百分比5%～15%的接种量分别接种上述两个菌种，连续培养8～48h，得到液体菌液，然后将含有枝孢霉菌的液体菌液和含有紫金牛叶杆菌的液体菌液按照体积比为1～5:1的比例进行复配，得到微生物复合菌剂。

本发明还提供了一种培养基，由水组成，每升水中含有0.1g～5g的胍胶、0.05g～1g的KH₂PO₄、0.05g～2g的K₂HPO₄、0.01g～0.1g的MgSO₄、0.01g～0.5g的CaCl₂和0.01g～0.2g的NaCl。

本发明中的枝孢霉菌，其分类命名为Cladosporium sp.，属于真菌界、半知菌亚门、丝孢纲、丛梗孢目、暗色孢科、枝孢属。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号（中科院微生物研究所），保藏日期为2012年2月21号，保藏号为CGMCC No：5782。

本发明中的紫金牛叶杆菌，其分类命名为Phyllobacteriummyrsinacearum，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号（中科院微生物研究所），保藏日期为2012年2月21号，保藏号为CGMCC No：5783。

本发明的枝孢霉菌和紫金牛叶杆菌是以压裂返排液中对COD影响最大的胍胶为食物，通过振荡培养，能够将压裂返排液中的胍胶以食物的形式进行消耗，降低压裂返排液中的胍胶的含量，从而降低了压裂返排液的COD值。

本发明和已有技术相比较，其效果是积极和明显的。本发明的微生物菌剂及其制备方法是利用现在微生物技术，针对压裂液返排液中的高分子有机成分，选育出具有高效降解能力的微生物复合菌群，通过微生物在压裂液返排液中的生长繁殖和驯化，使微生物不断适应油田废水的生长环境，最终达到降解压裂液返排液化学需氧量的目的，本发明能够有效的用于压裂液返排液中高分子、有机物的降解，降解率高，水质清澈，降低了对水体环境和土壤环境的二次污染，具有较好的应用前景。

附图说明：

图1中A是枝孢霉IS383区的PCR产物电泳图谱，B是是标准marker。

图2是紫金牛叶杆菌S1197区的PCR产物电泳图谱，B是是标准marker。

具体实施方式：

下面实施例采用的设备主要是：PCR反应扩增仪（加拿大BBI公司）；3730测序列分析仪(美国ABI公司)；SW-CJ-1D洁净工作台（江苏苏洁净化设备厂）；DK-8D型电热恒温水槽（上海森信实验仪器有限公司）；DYY-8型稳压稳流电泳仪（上海琪特分析仪器有限公司）；YXJ-2离心机（湘仪离心机仪器有限公司）H6-1微型电泳槽（上海精益有机玻璃制品仪器厂）；凝胶成像系统（GeneGenius公司）；U-3010紫外-可见分光光度计(Hitachi公司)；移液器（范围100-1000μl，20-200μl，0.5-10μl）（加拿大BBI公司）。

实施例1：枝孢霉菌和紫金牛叶杆菌的分离纯化

以油田压裂液返排液为取样源，按照逐级稀释要求将压裂液返排液以10^-1～10^-10进行稀释，涂布于含有3%高分子有机化合物胍胶的固体培养基上，与温度30℃条件下培养5天。

在上述平板上挑取单菌落经过平板划线分离纯化后得到两株具有优良性状的菌株EB1和EB2。

实施例2菌株EB1的测序和鉴定

一、基因组提取及电泳检测

（一）、基因组提取过程：按照上海生工生物工程技术服务有限公司的SK1375真菌基因组DNA抽提试剂盒说明书描述的方法进行提取。

抽提步骤如下描述：

1.取50-100mg新鲜真菌或20mg干燥子实体或菌丝，液氮中充分研磨成粉末。依次加入700μl65℃预热的FPCB Solution和7μl β-巯基乙醇，充分混匀，65°C温浴25min，间或混匀。

2.12,000rpm离心10min，将上清转移至干净的1.5ml离心管中，加入700μl氯仿，充分混匀，12,000rpm离心5min。

3.吸取上清至一干净的1.5ml离心管中，加入40μl RNase A（20mg/ml），充分混匀，室温放置10min。

4.依次加入1/2体积BD Buffer和1/2体积无水乙醇，充分混匀。

5.将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加至吸附柱中，静置2min，10,000rpm离心1min，倒掉收集管中废液。

6.将吸附柱放回收集管中，加入500μl PW Solution，10,000rpm离心1min，倒掉收集管中废液。

7.将吸附柱放回收集管中，加入500μl Wash Solution，10,000rpm离心1min，倒掉收集管中废液。

8.将吸附柱放回收集管中，10,000rpm离心2min。

9.将吸附柱放入干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入50μl预热（60℃）的Elution Buffer，静置5min，10,000rpm离心1min，将所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。

（二）、将得到的DNA进行PCR扩增

1．PCR体系建立（50ul）：

2.PCR程序设定

预变性98℃5mim;

循环95℃35S,55℃35S,72℃40s,35个循环，

延伸8min

3.PCR产物电泳图谱如图1A所示。

4.DNA琼脂糖切胶纯化

由PCR产物电泳结果切割DNA目的条带，纯化方式按照上海生工生物工程技术服务有限公司的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒描述方法进行操作。

（1）从琼脂糖凝胶中回收DNA

a)通过琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，然后用干净的手术刀割下含需回收DNA的琼脂块，放入1.5ml离心管中。

b)称量凝胶的重量，以1mg=1ul换算凝胶的体积。

c)按照凝胶浓度，按下表提供的参数加入相应比例的Binding Buffer II

凝胶浓度	Binding Buffer II
		小于或等于1%	3个胶体积
小于或等于1.5%	4个胶体积
		小于或等于2%	5个胶体积
大于2%	6个胶体积

d)置于50-60℃水浴中10分钟，使胶彻底融化，加热融胶时，每2分钟混匀一次。

e)将融化的胶溶液转移到套放在2-ml收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2分钟。12000rpm室温离心1分钟。

f)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，加入500ul Wash Solution，12000rpm室温离心1分钟。

g)重复步骤6一次。

h)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，12000rpm室温离心2分钟。

i)将UNIQ-10柱放入一根新的1.5-ml收集管中，在柱子膜中央加入40ulElution Buffer放置5分钟。

j)12000rpm室温离心1分钟，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或者保存于-20℃备用。

5.DNA测序

（1）测序采用的引物序列如下描述：

ITS1 5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’

ITS4 5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’

使用测序仪器ABI3730Xl进行测序，所得序列如SEQ ID NO：3所示。

（2）菌株形态

EB1菌株：其培养特征为耗氧细菌，生长温度为15-35℃，最佳pH为5.5-8.5.在胍胶琼脂培养基上培养48h后长出黑色菌落。EB1菌落周围呈现不规则的丝状分布，菌体呈现黑褐色，周边有大量的分支菌丝，有些菌丝深入到培养基内部吸取营养。

（3）菌种鉴定

采用16sRNA方法鉴定菌种。对比数据库可知EB1为新的枝孢霉菌。

具体比对如下：

所得序列使用PRIMER3软件进行网上比对，并辅以人工校对，确定序列的可靠性。得到的序列在NCBI上BLAST，使用数据库为GenBank+EMBL+DDBJ+PDB。

鉴定为新的枝孢霉菌，其分类命名为Cladosporium sp.，属于真菌界、半知菌亚门、丝孢纲、丛梗孢目、暗色孢科、枝孢属。保藏号为CGMCC No：5782。

实施例3菌株EB2的测序和鉴定

一、基因组提取及电泳检测

（一）、基因组提取过程：按照上海生工生物工程技术服务有限公司的SK1201-UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书描述的方法进行提取。

抽提步骤如下描述：

操作步骤：

1、使用前将水浴锅调整到56℃、70℃，并将洗脱液Elution buffer置于60℃水浴中；

2、取过夜培养细菌细胞（至多2*109个），加入离心管中，10000rpm室温离心30秒，收集菌体，尽量吸去上清；

3、加入180ul溶液digestion buffer，重悬菌液，加入20ul蛋白酶K溶液（10mg/ml），混匀，56℃30分钟细胞完全裂解；

4、加入200ul溶液BD，充分颠倒混匀，70℃水浴10分钟；

5、加入200ul无水乙醇，充分颠倒混匀；

6、将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2分钟，再12000rpm室温离心3分钟，倒掉滤液；

7、向吸附柱中加入500ul溶液PW，10000rmp室温离心1分钟，倒掉滤液。

8、向吸附柱中加入500ul漂洗液Wash buffer，10000rmp室温离心1分钟，倒掉滤液。

9、将吸附柱重新放回收集管中，于12000rmp，室温离心2分钟，离去残留的漂洗液Wash buffer;

10、取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入50ul预热（60℃）的洗脱液Elution buffer，静置3分钟，10000rmp室温离心1分钟，收集DNA溶液，提取的基因组DNA可立即进行下游分子实验或者-20℃保存。

（二）、PCR反应

1．PCR体系建立（50ul）：

2.PCR程序设定

预变性98℃5mim;

循环95℃35S,55℃35S,72℃1min30s,35个循环，

延伸8min

3.PCR产物电泳图谱如图2B描述。

4.DNA琼脂糖切胶纯化

由PCR产物电泳结果切割DNA目的条带，纯化方式同实施例2中DNA琼脂糖切胶纯化描述。

5.DNA测序

（1）测序的引物如下描述：

7f (5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3')

1540r (5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')

使用测序仪器ABI3730Xl进行测序，所得序列如SEQ ID NO：6所示。

（2）菌株形态

菌株EB2：其培养特征为耗氧细菌，生长温度为15-35℃，最佳pH为5.5-8.5.在胍胶琼脂培养基上培养48h后长出乳白色菌落（EB2）。EB2菌落呈光滑隆起状，菌体粘稠度高，显微镜下呈杆状分布。

（3）菌种鉴定

采用16sRNA方法鉴定菌种。对比数据库可知EB2为新的紫金牛叶杆菌。

具体比对如下：

鉴定为新的一种紫金牛叶杆菌，其分类命名为Phyllobacteriummyrsinacearum，保藏号为CGMCC No：5783。

实施例4一种处理油田压裂返排液的微生物复合菌剂的制备方法

将保藏号为CGMCC No：5782和保藏号为CGMCC No：5783的菌株分别放入两个培养基中进行摇床培养，所述的培养基由水组成，每升水中含有0.1g～5g的胍胶、0.05g～1g的KH₂PO₄，0.05g～2g的K₂HPO₄，0.01g～0.1g的MgSO₄，0.01g～0.5g的CaCl₂，0.01g～0.2g的NaCl，培养时间为3～10天，培养温度为5～30℃，然后再向装有上述培养基的两个反应器中按照体积百分比5%～15%的接种量分别接种上述两个菌种，连续培养8～48h，得到液体菌液，然后将含有枝孢霉菌的液体菌液和含有紫金牛叶杆菌的液体菌液按照体积比为1～5:1的比例进行复配，得到微生物复合菌剂。

优选的，将培养好的液体菌液按照枝孢霉菌和紫金牛叶杆菌体积比为2:1的混合比例进行复配，得到微生物复合菌剂（表一采用的混合菌）。

实施例5：本发明的微生物复合菌剂对油田压裂返排液高分子、有机物的处理效果

按照体积比为15～20%的施加量将复配得到的微生物复合菌剂加入到油田压裂液中，混合均匀后在30℃温度下摇床振荡24h，24h后每隔12h测定压裂液中的化学需氧量。

试验情况如下：

对照组1：压裂液返排液原液，编号为1。

对照组2：压裂液返排液原液+摇床振荡24h，编号为2。

处理组1：压裂液返排液原液+微生物复合菌剂+摇床振荡24h，编号为3(分别有3组)。

处理组2：压裂液返排液原液+微生物复合菌剂+摇床振荡48h，编号为4(分别有3组)。

通过编号1和2，找出振荡前后压裂液返排液化学需氧量的变化趋势，排除振荡对压裂液返排液COD值的影响。

通过编号2和3，找出振荡24h条件下，微生物复合菌剂对压裂液返排液化学需氧量的影响，测定微生物复合菌剂对高分子有机化合物的降解率。

通过编号3和4，确定振荡时间对微生物复合菌剂降解率的影响，测定随着时间的变化微生物复合菌剂对高分子有机化合物的降解率。

表1微生物复合菌剂对压裂液返排液化学需氧量的降解率

Claims

1.一种紫金牛叶杆菌在处理油田压裂返排液中的用途，其保藏号为CGMCC No：5783。