CN103201625A - 调节涉及黑素生成的肾上腺素受体基因表达的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于确定受试试剂对于改变有色皮肤的外观有效的筛选方法的实施例。所述筛选方法可以包括下列步骤：使细胞、细胞培养物、或大量细胞与所述受试试剂接触，其中所述细胞、细胞培养物、或大量细胞包含ADRβ1受体；以及基于所述受试试剂与所述ADRβ1受体的结合相互作用，确定所述受试试剂是否是适合用于改变有色皮肤的外观的有效的ADRβ1受体拮抗剂，其中当所述受试试剂具有小于约1000ppm的半数抑制浓度时，所述受试试剂被认为是有效的ADRβ1受体拮抗剂。

Description

调节涉及黑素生成的肾上腺素受体基因表达的筛选方法

技术领域

本发明涉及基因的组和基因组转录表达谱来源的生物标记，还涉及用于确定和评价从转录上调控涉及黑素合成（黑素生成）的基因，尤其是肾上腺素受体基因，和调节人类皮肤中的老年斑的方法。

背景技术

皮肤老化是由内在因素（例如，实足年龄老化的天然过程的效应）和外在因素（例如，环境毒素/污染物和吸烟）共同驱动的多因子的过程。

皮肤具体包括角质细胞、黑素细胞和神经细胞、成纤维细胞、朗格汉斯细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等等，参见图1，角质细胞和黑素细胞存在于表皮中。黑素细胞位于表皮的基底层，并且它们组成了黑素生成的位点。由于它们与角质细胞紧密接触，黑素细胞将新合成的黑素以黑素体的形式转移至角质细胞，从而赋予皮肤颜色。尽管黑素细胞实际上产生色素反应，角质细胞生产了肾上腺素——一种被报道触发黑素细胞生产色素的儿茶酚胺。通过儿茶酚胺（例如肾上腺素）触发黑素被称为儿茶酚胺生物合成，这将被描述于下文中。因此，这两种细胞类型共生地一起作用，以调节色素沉着。角质细胞中分布的黑素的类型和量决定了皮肤的基本颜色。

参见图2，黑素生成，或黑素合成，是以L-酪氨酸氨基酸的羟基化开始的生物学现象，L-酪氨酸产生自L-二羟苯基-丙氨酸（L-多巴）的形成，其继而通过特异性黑素细胞相关的酶酪氨酸酶的作用被转化为多巴-色素。连续的还原和氧化反应导致多巴-色素至黑素的转化。酪氨酸酶的生产及其活性部分地决定了生产的黑素的量。转移至角质细胞的黑素的量和类型，就它们的部分而言决定了人类皮肤的视觉上色素沉着的程度。

皮肤老化或皮肤老化的外观随黑素生成而变化。皮肤老化或老年斑被视作皮肤色调的反差。如本文所用，“老年斑”一般是指与皮肤上与老化相关的斑点，并且可以包括日光性着色斑、雀斑、黄褐斑、脂溢性角化病、炎症后色素沉着过度等等。如本文所用，“色调”一般是指平滑和均匀的有色表面的视觉感知。皮肤老化影响质感和色素沉着，在面部造成反差，这种反差可以是由皱纹或者由老年斑导致的颜色变化导致的阴影的结果。在年轻的皮肤中，黑素是均匀分布的，并且黑素细胞活性低，仅限于产生组成型的色素沉着。日光中的紫外线辐射瞬时地活化黑素细胞，以产生均匀分布的黑素，如棕褐色肤色。在老化的皮肤中，一些黑素细胞可以被累积的紫外线曝露损伤，导致它们被持续地“开启”和过度生产黑素。这种过度的黑素生成能够最终造成永久性局部变色，这种局部变色具有足够表现为老年斑（雀斑）或表现为弥散性色素沉着过度的尺寸和反差。随着皮肤的更新随年龄增长而降低，极微小的黑素小点（“黑素尘埃”）能够变得被局限在表皮和角质层中，导致阴暗的外观。黑素的不均匀分布使得其自身表现为老年斑和色素沉着过度。老年斑组织中的色素沉着过度涉及下列已知的因素中的一种或多种：较高的酪氨酸酶（上文所述的一种黑素细胞的酶）活性，和较多的成熟黑素体以及黑素/黑素体在被合成后在黑素细胞或角质细胞中较高的保留比率。

一般来讲，紫外线辐射诱导的色素沉着过度被认为部分地导致了阿黑皮素原来源的肽的作用和通过提高胞内cAMP作用于黑素细胞黑皮质素-1受体的黑素细胞刺激性激素。在阿黑皮素原缺陷型小鼠和在具有无功能的黑皮质素-1受体的动物中的研究显示，它们依然能够响应于毛喉素而产生黑素，表明替代性的cAMP依赖的途径也诱导了黑素生成。

一种此类替代性的cAMP依赖的途径涉及肾上腺素受体，其在药理学上被分为两组：α和β。肾上腺素受体是鸟嘌呤核苷酸结合调控蛋白偶联的受体的原型家族，其介导激素肾上腺素和神经递质去甲肾上腺素的生理效应。有3种类型的β肾上腺素受体：ADRβ1、ADRβ2和ADRβ3，亚型的分型是基于对儿茶酚胺和特异性拮抗剂的不同药理学反应以及蛋白质序列的差异。此外，有α肾上腺素受体的多种亚型：ADRα1A、ADRα1B、ADRα1D、ADRα2A、ADRα2B和ADRα2C。

根据Schallreuter，K.U.等人，The induction of theα-1-adrenoreceptorsignal transduction system on human melanocytes，Experimental Dermatology1996；第5卷，第1期，第20-23页，人类黑素细胞不受胞外刺激时不表达α1、β1或β2肾上腺素受体。去甲肾上腺素的引入导致α1受体的时间依赖的诱导；然而，对黑素生成没有影响。与此相比，黑素细胞中的β-肾上腺素受体不被去甲肾上腺素刺激诱导，因此由黑素细胞合成的去甲肾上腺素似乎不介导色素沉着/黑素生成。

与此相反，在角质细胞中去甲肾上腺素生物合成的诱导与ADRβ2受体的升高相关。Schallreuter进行了涉及在表皮内的ADRβ2信号途径和儿茶酚胺合成网络的研究。角质细胞和黑素细胞均表达ADRβ2，并且这两种细胞类型均具有用于儿茶酚胺生物合成，具体地是去甲肾上腺素合成的酶学机制，尽管仅角质细胞是已知合成肾上腺素的。肾上腺素从角质细胞的分泌刺激了黑素细胞上的β肾上腺素受体，这使胞内cAMP升高，并从而提高了黑素生成。

Sivamani等人，An Epinephrine-Dependent Mechanism for the Control ofUV-Induced Pigmentation，Journal of Investigative Dermatology（2009），第129卷，第784-786页公开了角质细胞响应于紫外线辐射分泌肾上腺素，而肾上腺素刺激黑素细胞上的β肾上腺素受体，以提高黑素合成。因此，Sivamani确立了应激、紫外线辐射和色素沉着之间的联系。此外，Sivamani确认了Schallreuter也提供了的一般共识，即α1受体对黑素生成没有影响。

Grando，Adrenergic and Cholinergic Control in the Biology ofEpidermis：Physiological and Clinical Significance，Journal of InvestigativeDermatology，第126卷，第1948-1965页（2006）教导了表皮的肾上腺素信号控制钙稳态，并且提出色素沉着可以通过β2和α1肾上腺素受体被控制；然而，Grando的例子集中在ADRβ2与黑素生成的关系。Grando还声称黑素细胞仅表达ADRβ2受体，而ADRβ1受体被认为是缺乏的。

对负责老化的生物化学过程，例如上文所述的机制的更好的理解，已刺激了化妆品工业，并导致了新的一类有时被称为“药妆品”的美容活性物质的出现。所声称的效果，包括但不限于抗氧化剂、抗炎剂和自由基清除效果，来源于基础科学。

本发明人认识到与针对美容功能效应对已知的美容剂的评价相关联的不足，和与对实际上实现基于理论的效应以向皮肤提供真实的、可验证的抗衰老有益效果的试剂的鉴定相关联的不足。相应地，本发明人认识到对用于鉴定在减小老化相关的皮肤斑点中有效的试剂（具体地是通过调节黑素的生产）的可靠的和有效的体外方法的持续需求。尽管文献已一般地确立了ADRβ2受体和黑素生成之间的联系，但在老年斑中肾上腺素受体和黑素生成之间的联系还没有被很好地建立，并且仍然存在对鉴定更多的在老年斑中调节黑素生成的肾上腺素受体的需求。

发明内容

本发明的实施例指向用于开发调节黑素生产以减少老年斑和改善皮肤色调的试剂的基因组学和蛋白质组学技术的应用。全基因表达谱提供了用于鉴定皮肤老化过程的关键方面的有用方法，并且提供了允许本发明的皮肤技术的开发的信息。能够通过应用基因组学和蛋白质组学处理的皮肤老化的重要方面是皮肤中的老年斑或色素沉着过度的减少。使用这种转录分析方法，检测响应于化合物的对黑素合成的影响是可能的。基因微阵列是用于了解皮肤老化过程中在转录水平发生的变化的新工具。本发明人收集了基因表达数据并应用了先进的生物信息学来鉴定受老化影响的特定途径。

具体地，通过利用如下文所述的现代基因组学分析和siRNA敲除技术，本发明人发现了ADRβ1受体和ADRβ3受体与黑素生成之间的联系，并且还认识到调节ADRβ1受体和ADRβ3受体控制了老年斑中黑素的产生。为了证明这种联系，下文提供的对老年斑的基因组学分析显示了与未涉及的皮肤相比，在老年斑中ADRβ1基因的显著过表达。与此相反，尽管与未涉及的皮肤相比，ADRβ1基因在老年斑中展示了高得多的表达，来自通常与黑素合成相关的基因（例如酪氨酸酶，和酪氨酸酶相关蛋白1）的转录物没有展示在老年斑中相对于未涉及的皮肤的表达水平的任何显著变化。

基于这些具有创造性的发现，本发明提供了用于确定至少一种受试试剂对于改变有色皮肤的外观有效的筛选方法。所述方法包括使细胞、细胞培养物、或大量细胞与所述受试试剂接触，其中所述细胞、细胞培养物、或大量细胞包含ADRβ1受体；以及基于所述受试试剂与所述ADRβ1受体的结合相互作用，确定所述受试试剂是否是适合用于改变有色皮肤的外观的有效的ADRβ1受体拮抗剂，其中当所述受试试剂具有小于约1000ppm的半数抑制浓度时，所述受试试剂被认为是有效的ADRβ1受体拮抗剂。

根据进一步的实施例，本发明提供了用于确定至少一种受试试剂对于改变有色皮肤的外观有效的另外的筛选方法。所述方法包括使细胞、细胞培养物、或大量细胞与所述受试试剂接触，其中所述细胞、细胞培养物、或大量细胞包含ADRβ3受体；以及基于所述受试试剂与所述ADRβ3受体的结合相互作用，确定所述受试试剂是否是适合用于改变有色皮肤的外观的ADRβ3受体激动剂。

根据另外的实施例，附加的筛选方法指向确定作为ADRα1B受体拮抗剂或ADRα2C受体拮抗剂有效的适合用于改变有色皮肤的外观的受试试剂。

另外的实施例涉及混入了在人类皮肤中调节黑素的产生的这些试剂的美容剂。

本发明的多种实施例的特征和有益效果将从下文的描述中变得明显，这些描述包括旨在提供对本发明的广泛表示的图表和具体实施例的实施例。从这些描述和从本发明的实施，多种修正形式对于本领域的技术人员将显而易见。本发明的范围并不旨在限于所公开的具体形式，并且本发明涵盖了属于本发明的精神和范围内的全部修正形式、等同物和供选择的替代方案，如权利要求所规定的。

附图说明

当结合下列附图阅读时，可最好地理解本公开具体实施例的下列详述：

图1是黑素合成途径的示意图。

图2是黑素合成途径的另一示意图。

图3是描绘通过ADRβ1和ADRβ2受体的黑素合成途径的交叉点的示意图。

图4是描绘ADRβ1和ADRβ2受体激动剂和拮抗剂对黑素合成的影响的图示例证。

图5是描绘多巴酚丁胺对人类皮肤移植组织的影响的图示例证。

图6是关于B16黑素合成检测的siRNA敲除数据的图示例证，其中肾上腺素受体是基于%敲除度量值比较的。

图7是关于B16黑素合成检测的siRNA敲除数据的图示例证，其中肾上腺素受体是基于在肾上腺素存在的情况下的倍数变化比较的。

图8是比较性图示例证，显示了当人类受试者施用含有ADRβ1受体拮抗剂十一碳烯酰基苯丙氨酸（可以以商品名

商购获得）的护肤产品相对于不含ADRβ1受体抑制剂的护肤产品时斑点部分（%）的减少。

具体实施方式

本发明的实施例涉及通过调节肾上腺素受体使老年斑的产生最小化，具体而言是β肾上腺素受体，例如ADRβ1和ADRβ3，和α肾上腺素受体，例如ADRα2C和ADRα1B。

就β肾上腺素受体而言，对信号转导途径的审查表明，ADRβ1和ADRβ2受体共享导致提高的胞内cAMP生产的相似转导途径，这最终导致对酪氨酸酶表达的刺激。该信号转导途径与黑皮质素1受体（MC1R）的信号转导途径（已知的促色素沉着途径）相交，如图3中所示。

如上所述并且如图3中所示，ADRβ1和ADRβ2受体的触发导致提高的cAMP水平，这驱动酪氨酸酶的产生，因此与已知的驱动色素沉着的途径相交。具体地，如图所示，ADRβ1和ADRβ2受体与Gs G蛋白相交，其活化腺苷环化酶，催化环腺苷一磷酸盐（cAMP）的形成。提高的cAMP水平刺激小眼相关转录因子（MITF）的表达提高，继而在下游导致酪氨酸酶的上调。MITF帮助控制黑素细胞的发育和功能（即，控制皮肤中产生的黑素的水平）。

由于ADRβ1和ADRβ2受体共享相似的色素沉着途径，预期ADRβ1和ADRβ2基因在具有过量的黑素的老年斑中都将是过表达的；然而，实际情况并非如此。通过基因组学研究，本发明人出人意料地发现，ADRβ1基因在老年斑中是高度上调的，而ADRβ2基因在老年斑中不是高度上调的。如本文所用，高度上调意指基因在老年斑中展示了至少2的倍数变化值和小于0.05的p值。

参见下文的表2，本发明人使用Affy芯片，在具有老年斑和不具有老年斑（即，未涉及的皮肤）的活组织检查皮肤样品上进行了比较性实验基因组学研究。所述基因组学研究使用了广泛用于分子生物学和基因组学研究的技术——微阵列。微阵列包括核酸寡核苷酸的排列的系列，每种包含针对靶基因的探针。探针是靶基因（或其他靶DNA）的短的部分，其被设计为与靶cDNA或cRNA样品杂交。杂交在此后通过本领域中熟知的方法（其可以包括荧光标记的靶标）被检测和定量，以确定特定序列在样品中的相对丰度。一种阵列可以包含数以千计的探针，而“全”阵列被理解为包含针对一个物种中已知基因的整个群体的探针。一般地，探针通过连接化学反应与固体基质例如玻璃或硅芯片相连。通俗地说，当采用Affymetrix^TM品牌芯片时，这些被称为Affy芯片。此类微阵列也被称为基因芯片。本文预期了许多其他的微阵列平台或检测体系。本发明的一个实施例预期了靶向特定的基因的组的杂交寡核苷酸的特定集合，然而，这允许了，特别是，本发明的方法的实施。

在对所述眼睛中获得的活组织检查皮肤样品的统计学分析中，ADRβ2基因被发现在老年斑（例如，日光性着色斑）中与在未涉及的皮肤中相比是显著上调的，如通过老年斑对未涉及的皮肤14.5的倍数变化所展示的。同时，ADRβ2和ADRβ3的表达水平在老年斑中与在未涉及的皮肤中相比不是显著不同的。

表1

基因	倍数变化	P值
			ADRβ1	14.51	0.0441
ADRβ2	0.9	0.2952
			ADRβ3	4.7	0.9664

基于这些发现，本发明涉及基因的组，所述基因的组包括与人类皮肤中黑素的产生和调节相关的基因。所述基因的组包括ADRβ1基因以及任选地ADRβ2基因。在特定的实施例中，所述基因的组可以既包括ADRβ1基因又包括ADRβ2基因。这些受体基因在黑素细胞和角质细胞中均存在。

这些基因的量和活化以及在所述基因的组中编码的受体，与在色素沉着过度的斑点、雀斑、黄褐斑、日光性着色斑、或它们的组合中存在的黑素的量相关联。具体地，这些基因当被编码为受体蛋白质时有利于黑素的合成。在另外的实施例中，本发明还可以涉及生物标记的组，其包括本发明的基因的组的基因的一种或多种基因产物（即，所述受体蛋白质）。所述一种或多种基因产物可以包括ADRβ1受体蛋白质以及任选地ADRβ2受体蛋白质。在另外的实施例中，所述一种或多种基因产物可以包括ADRβ1受体蛋白质和ADRβ2受体蛋白质。为了分离与ADRβ1基因结合的试剂和从其编码的产物，使用了包含特异性地与核酸杂交的固定化寡核苷酸的微阵列。

使用这些微阵列，本发明还涉及用于确定试剂对于改善有色皮肤的外观是否有效的筛选方法。所述方法可以包括使细胞、细胞培养物、或大量细胞与受试试剂接触，其中所述细胞、细胞培养物、或大量细胞包含ADRβ1受体。所述受试试剂是与特异性核酸结合或杂交的一些组合物。多种寡核苷酸组合物被预期适合用作所述受试试剂。在一个实施例中，所述受试试剂是棕榈酰化的肽。在另一个实施例中，所述受试试剂选自palGQPR、palGHK、acetylGHK、acetylGQPR、去氧苯比妥、十一碳烯酰基苯丙氨酸、以及它们的组合。

所述方法还包括如果所述受试试剂是ADRβ1受体的拮抗剂，确定所述受试试剂对于改善有色皮肤的外观是否有效。在一个实施例中，如果所述受试试剂具有小于约1000ppm的半数抑制浓度（IC50），则所述受试试剂可以被鉴定为ADRβ1受体拮抗剂。在另外的实施例中，所述ADRβ1受体拮抗剂具有小于约100ppm、或小于约50ppm的半数抑制浓度。通过使用这种最大抑制浓度的度量标准，将所述ADRβ1受体拮抗剂的拮抗剂活性与该ADRβ1受体拮抗剂改善人类皮肤中色素沉着过度的斑点的外观的能力相关联是可能的。在另外的实施例中，当所述ADRβ1受体拮抗剂与ADRβ1受体结合时，可以产生发冷光的参考信号，其可以被光度计、荧光平板阅读器、或荧光计测量。

如下文的表2中所显示的，本发明人还认识到，将受试试剂从肽修饰为棕榈酰化的肽极大地提高了其作为ADRβ1抑制剂的功效。例如，当比较未修饰的GHK和GQPR与棕榈酰化的GHK和GQPR时，GHK和GQPR肽的效能是极大地提高的。如表2中所进一步显示的，对未修饰的GHK和GQPR进行修饰，以产生acetylGHK和acetylGQPR，也提高了作为ADRβ1抑制剂的功效，因此预期其他的肽的修饰也可以显示出有利于对ADRβ1受体的抑制。

表2

尽管所述方法涉及的是筛选ADRβ1受体拮抗剂，预期所述受试试剂也可以作为ADRβ2受体的拮抗剂。在针对ADRβ2受体的拮抗剂的检测中，附加的细胞、细胞培养物或大量细胞可以被使用。所述方法还可以包括使第二种细胞、第二种细胞培养物、或第二组大量细胞与所述受试试剂接触，并且如果所述受试试剂是ADRβ2受体的拮抗剂，确定所述受试试剂对于改善有色皮肤的外观是否有效。由于ADRβ1和ADRβ2具有相似的转导途径，在B16细胞中的siRNA工作暗示，ADRβ1和ADRβ2均是功能性的促色素沉着的受体；然而，老年斑中的表达谱出人意料地在调控方面区别了ADRβ1与ADRβ2，因为ADRβ1在老年斑中是显著上调的。

在另外的实施例中，针对ADRβ1受体和/或ADRβ2受体的拮抗剂可以被掺入被配制用于局部施用至皮肤的化妆品组合物。这种化妆品组合物（其可以包含本领域的普通技术人员所熟悉的附加的成分）利用这些ADRβ1受体和/或ADRβ2受体拮抗剂来改善皮肤的有色外观。

确定受试试剂适合作为ADRβ1拮抗剂、ADRβ2拮抗剂、或它们的组合，可以利用选自由B16细胞检测法或皮肤模型组成的组的黑素合成检测法。B16-F1细胞是从美国典型培养物保藏中心（American Tissue CultureCollection，ATCC）获得的鼠黑素瘤细胞，其包含用于黑素生产的合成机制并且响应于一些基准的美白/美黑试剂。下列实验描述了确定受试试剂对黑素合成的影响的一种示例性方法。

B16细胞检测实验

在本实验中，0.5mL的B16-F1细胞被添加至29.5ml的B16-F1培养基中，至2个分别的T-150烧瓶，并生长至接近（～80%）融合度。培养基B16-F1包含如下文的表1中所显示的下列组分：

表3

培养基组分
	500mL DMEM500mL DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）
50mL FBS（胎牛血清）
	5mL Pen/Strep（青霉素/链霉素）

使来自T-150烧瓶的细胞胰蛋白酶化，并用血细胞计数器计数。然后，在包含95%B16-F1培养基和5%DMSO（二甲基亚砜）的混合物中，冷冻细胞小瓶（1×10⁶细胞等分试样）并置于液氮中。在37℃水浴中加热全部的细胞培养物试剂（除胰蛋白酶之外）。

在第0天，29mL的B16-F1培养基在37℃被置于T-150烧瓶中。然后，获取冷冻细胞的小瓶，在37℃水浴中解冻，并置于所述T-150烧瓶中。搅拌烧瓶以使细胞与培养基混合，然后于37℃在包含5%CO₂的潮湿环境中孵育所述烧瓶中3天。在第3天，使来自所述烧瓶的细胞胰蛋白酶化，并测定细胞密度。在此时，以2,500细胞每孔将上述细胞分配至96孔板中。在第5天，用所述受试试剂处理细胞。在第7天，针对黑素生产和毒性对上述细胞进行检测。

参见图4的图示例证，本发明人利用B16细胞检测法来展示已知的ADRβ1和ADRβ2激动剂和拮抗剂的效应。如图所示，提高已知的ADRβ1激动剂多巴酚丁胺和已知的ADRβ2激动剂喘息定的浓度（w/v%）提高了黑素的合成（%MS或%黑素合成）。就ADRβ2激动剂喘息定的情况而言，随着喘息定的浓度提高，黑素合成极大地提高至接近300%。如上所述，ADRβ1和ADRβ2刺激导致提高的cAMP水平，其在已知的黑素生成途径中驱动酪氨酸酶的生产。此外，参见图5，本发明人确定了ADRβ1激动剂多巴酚丁胺比也与老年斑相关的旁分泌因子干细胞因子和内皮素（Endo-SCF）更多地在人类皮肤移植组织中诱导了色素沉着基因的表达。

除了认识到ADRβ1和/或ADRβ2受体的拮抗剂对于通过调节黑素生成控制人类皮肤的外观是有效的之外，本发明人还认识到，ADRβ3的激动剂也有助于通过调节黑素生成控制人类皮肤的外观。与ADRβ1和ADRβ2受体相比，本发明人发现ADRβ3受体具有不同的下游信号转导途径，并因此具有不同的与黑素生成的关系。

ADRβ3受体通过活化内皮型一氧化氮合酶刺激一氧化氮的生产。一氧化氮活化鸟苷酸环化酶和提高环鸟苷酸（cGMP）水平，并降低cAMP水平。通过降低cAMP水平，酪氨酸酶的生产被降低。由于酪氨酸酶是色素沉着途径的关键组分，降低酪氨酸酶使得黑素的生产降低，并从而减少了老年斑。

因此，本发明的另外的实施例涉及包括ADRβ3基因以及任选地ADRβ1基因和ADRβ2基因中的至少一种的基因的组。除了所述基因的组之外，本发明还可以包括生物标记的组，其包括一种或多种被编码的基因产物，所述基因产物包括ADRβ3受体蛋白质以及任选地ADRβ1和ADRβ2受体蛋白质中的至少一种。

记录了ADRβ3受体激动剂的功效的本发明的实施例涉及用于确定试剂作为ADRβ3受体激动剂有效的筛选方法。所述方法可以包括使细胞、细胞培养物、或大量细胞与受试试剂接触，其中所述细胞、细胞培养物、或大量细胞包含ADRβ3受体，并且如果所述受试试剂是ADRβ3受体的激动剂，确定所述受试试剂对于改善有色皮肤的外观有效。

如同上文所述的化妆品组合物或产品，所述ADRβ3受体的激动剂可以被掺入被配制用于局部施用至皮肤的化妆品组合物中。为了进一步控制黑素的生产，所述化妆品组合物可以包含ADRβ1受体拮抗剂、ADRβ2受体拮抗剂、或二者。这种化妆品组合物（其可以包含本领域的普通技术人员所熟悉的多种附加的成分）可以利用这些ADRβ3受体激动剂，单独地或与ADRβ1受体和/或ADRβ2受体拮抗剂一起，来改善皮肤的有色外观。ADRβ1拮抗剂与ADRβ3激动剂的组合据信协同地作用，以通过肾上腺素受体抑制黑素生成。所述ADRβ3激动剂可以包括一种或多种选自下列的化合物：ZD7114、阿米贝隆、索拉贝隆、L-796568、CL-316243、LY-368842、以及它们的组合。

本发明人还鉴定了适合用于通过使用上文所述的对B16小鼠黑素瘤细胞品系的siRNA敲除研究抑制黑素生成的基因靶标。siRNA分离在黑素生成检测中所关注的基因，以评价它们作为黑素生成调控者的功效。siRNA技术使用短的干扰RNA（siRNA），其通过转染被外源性地引入B16细胞中，以抑制个别基因的活性，导致在小鼠黑素瘤细胞品系（B16-F1）中黑素生成的上调或者下调。

参见图6，siRNA敲除数据展示了ADRβ3基因的下调以及ADRβ1和ADRβ2基因的上调。参见图7和上文的表1，siRNA抑制了ADRβ1和ADRβ2基因的基因表达，如通过显著地低于0.5的倍数变化值所展示的，而ADRβ3基因是高表达的，如通过高于2的倍数变化所显示的。由于siRNA干扰了ADRβ1和ADRβ2基因，这些基因没有被编码为与肾上腺素结合以产生黑素的受体，从而降低了色素沉着。由于siRNA干扰了ADRβ3基因，这些基因被编码为与肾上腺素结合的受体，从而提高了色素沉着。

如上文所述的并且如图6中所显示的，本发明人通过siRNA敲除数据还发现，α肾上腺素基因ADRα1B和ADRα2C强烈地与黑素生成相联系。与ADRβ1和ADRβ2基因相似，siRNA干扰了ADRα1B和ADRα2C基因，因此这些上调的基因没有被编码为与肾上腺素结合以产生黑素的受体。基于这些发现，本发明的实施例涉及包括ADRα1B基因、ADRα2C基因、或二者的基因的组。本发明的实施例还可以包括生物标记的组，其包括ADRα1B基因、ADRα2C基因、或二者的基因产物。

由于ADRα1B和ADRα2C受体的拮抗作用据信阻止了黑素生成，使用本领域的普通技术人员所熟悉的多种筛选方法筛选ADRα1B和ADRα2C的拮抗剂是有利的。在另外的实施例中，ADRα1B和/或ADRα2C可以被用于用以在老年斑中调节黑素的生产的多种化妆品或护肤配方中。在示例性实施例中，所述ADRα1B拮抗剂可以包括多沙唑嗪、哌唑嗪、或它们的组合，而所述ADRα2C拮抗剂可以包括育亨宾、螺沙群、或它们的组合。在另外的示例性实施例中，可以使用α和β受体均抑制的拮抗剂，例如，卡维地洛，其具有IC50=4ppm，和拉贝洛尔；

此外，化妆品或护肤组合物的另外的实施例可以使用α肾上腺素受体ADRα1B和/或ADRα2C的拮抗剂与ADRβ1拮抗剂或ADRβ3激动剂的组合。靶向多种肾上腺素受体提供了对黑素生成的更强的控制，尤其是当使用激动剂和拮抗剂的组合时。

如上文所述，用于调节肾上腺素受体并从而改变老年斑中的黑素生产的试剂，可以被掺入多种护肤组合物中，例如，化妆品或清洁组合物。预期了多种组合物和组分。所述护肤组合物可以包括在多种包含增稠剂、载体附加的护肤活性物质和如下文所详述的其他附加成分的其他组合物中的本发明的肾上腺素受体拮抗剂和激动剂。

在一个实施例中，所述护肤组合物是水包油乳液（例如，硅氧烷在水中的乳液），其包含按重量计约0至约10%的用于调节黑素生成的试剂。在供选择的替代实施例中，所述护肤组合物可以包含从约0至约5%、或约0至约1%的用于调节黑素生成的试剂。这些试剂可以包括ADRβ1受体拮抗剂、ADRβ3受体激动剂、ADRα1B受体拮抗剂、ADRα2C受体拮抗剂、或它们的组合。

参见图8，进行了比较实验来评价包含ADRβ1拮抗剂十一碳烯酰基苯丙氨酸（Sepiwhite）的护肤组合物的功效。在所述实验中，该研究中的人类受试者以4或8周的跨度在面部的两侧分别施用了下列三种产品中的两种：1）水包油的皮肤保湿剂（载体）；2）包含5%烟酰胺（5%N）的水包油的皮肤保湿剂，其是已知的亮肤剂；或3）包含5%烟酰胺和1%十一碳烯酰基苯丙氨酸（5%N+1%UA）的水包油的皮肤保湿剂。如图8中所显示的，具有十一碳烯酰基苯丙氨酸（ADRβ1拮抗剂）的配方展示了斑点区域部分（%）的最大的降低，其中所述斑点区域部分是在用于进行图像分析以对斑点区域定量的化装区域（所关注的区域）中获得的老年斑区域的百分比。随着研究从4周进行至8周，斑点部分（%）进一步降低，并且展示了与仅具有烟酰胺的配方相比统计学上显著的降低，从而表明包含ADRβ1拮抗剂的护肤组合物的长期施用将极大地使老年斑中的黑素生成最小化。

除了示例性的水包油乳液之外，还预期了多种附加的护肤组合物和其中的成分，如下文所述。这些组合物描述于Bissett等人，美国专利公布20060074097中，其以引用方式全文并入本文。

本发明组合物通常由常规方法制备，如本领域已知的制备局部用组合物的方法。上述方法通常涉及在一个或多个步骤中将成分混合至相对均匀的状态，可进行或不进行加热、冷却、施加真空等。优选制备所述的组合物以优化活性物质的稳定性（物理稳定性、化学稳定性、光稳定性）和/或递送。这种最优化可包括合适的pH值（例如，小于7）、排除可与活性剂复合并因此负面影响稳定性或递送的物质（例如排除杂质铁）、使用预防复合物形成的方法（例如合适的分散剂或双层包装）、使用合适的光稳定性方法（例如混入防晒油/防晒霜、使用不透明的包装）等等。

本文预期了施用所述组合物的多种方案。在一个优选的实施例中，所述组合物长期涂敷于皮肤。“长期局部应用”是指在受试者的一生中，长期持续地局部应用组合物，优选时间为至少约一个星期，更优选至少约一个月，甚至更优选至少约三个月，甚至更优选至少约六个月，还甚至更优选至少约一年。尽管有益效果在各种不同的最大使用期（例如五、十或二十年）后仍能获得，但优选在受试者整个一生中都长期持续应用。在上述延续的时间中，典型依照每天约一次的规律应用，然而应用频率可以在约每周一次至约每天三次或更多次的范围内变化。

本发明组合物的各种用量可被用来提供皮肤外观和/或皮肤感觉的有益效果。以mg组合物/cm²皮肤计，本发明组合物每次典型施用的量为约0.1mg/cm²至约20mg/cm²。尤其有用的涂敷量为约0.5mg/cm²至约10mg/cm²。

优选通过施用皮肤露剂、清洁洗剂、乳状洗剂、霜膏、凝胶、泡沫、油膏剂、糊剂、乳液、喷剂、护发剂、滋补剂、化妆品、唇膏、粉底、指甲油、须后水等形式的组合物，来实施角质组织状况的调节，所述组合物旨在保留于皮肤或其它角质组织上，以达到某些美观方面的、预防方面的、治疗方面的或其它方面的有益效果（即“免洗型”组合物）。在角质组织（如皮肤）上施用组合物后，其留在皮肤上优选至少约15分钟，更优选至少约30分钟，甚至更优选至少约1小时，最优选至少几小时，如最多约12小时。面部、毛发、和/或指/趾甲的外表部分的任何部分能够被处理，例如，面部、嘴唇、眼圈区域、眼睑、头皮、颈部、躯干、手臂、手、腿、手指、脚趾、头皮毛发、睫毛、眉毛等等。本发明的组合物的施用可以使用，例如，手掌和/或手指、工具如棉球、药签、衬垫等进行。

在详细地并且通过引用本公开的具体实施例描述了本公开的主旨之后，要指出的是，本文所公开的多种细节不应当被认为意味着这些细节涉及是本文所述的多种实施例的基本组分的元件，即使是在当在伴随本说明书的每一图片中描绘了具体元件的情况下。相反，本文所附的权利要求应当被作为本公开的广度和本文所述的多种发明的相应范围的唯一表示。此外，将显而易见的是，在不脱离所附权利要求限定的本发明范围的情况下各种修改形式和变型是可能的。更具体地讲，虽然本公开的某些方面在本文被认为是优选的或尤其有利的，但预期本公开不必限于这些方面。

还要指出的是，本文所提及的“至少一种”组分、元件等等，不应当被用于产生这样的推论，即替代性地使用的冠词“一个”或“一种”应当限于单个组分、元件等等。要指出的是，类似“优选的”、“一般的”和“通常”的术语，当在本文中被使用时，不被用于限制受权利要求书保护的发明的范围或意味着某些特征对于受权利要求书保护的发明的结构或功能是关键的、必需的、或甚至是重要的。相反，这些术语仅仅是为了确定本公开实施例的具体方面，或强调可以或不可以用于本公开具体实施例的供选择或另外的特征。

在上文的描述中，基因以大写字母和斜体表示，而蛋白质或受体蛋白质是不带斜体的大写。

本专利申请中引用的所有文件的相关部分均以引用方式并入本文；任何文献的引用均不可解释为是对其作为本发明的现有技术的认可。当本书面文献中术语的任何含义或定义与引入本文以供参考的文献中的术语的任何含义或定义冲突时，将以赋予本书面文献中的术语的含义或定义为准。

Claims (15)

1.一种用于确定至少一种受试试剂对于改变有色皮肤的外观有效的筛选方法，所述方法包括：

使细胞、细胞培养物、或大量细胞与所述受试试剂接触，其中所述细胞、细胞培养物、或大量细胞包含ADRβ1受体；以及

基于所述受试试剂与所述ADRβ1受体的结合相互作用，确定所述受试试剂是否是适合用于改变有色皮肤的外观的有效的ADRβ1受体拮抗剂，其中当所述受试试剂具有小于约1000ppm、或优选小于约100ppm、或最优选小于约50ppm的半数抑制浓度时，所述受试试剂被认为是有效的ADRβ1受体拮抗剂。

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其中被翻译为所述ADRβ1受体拮抗剂的ADRβ1基因表现出上调，所述上调通过统计分析展示为具有至少2的倍数变化值和小于0.05的p值。

3.根据权利要求1所述的筛选方法，其中所述ADRβ1受体拮抗剂还作为所述ADRβ2受体的拮抗剂起作用。

4.根据权利要求1所述的筛选方法，还包括使第二种细胞、第二种细胞培养物、或第二组大量细胞与所述受试试剂接触，并且如果所述受试试剂是所述ADRβ2受体的拮抗剂，确定所述受试试剂对于改变有色皮肤的外观有效。

5.根据权利要求1所述的筛选方法，还包括将所述ADRβ1受体拮抗剂调节黑素的生产并从而减少人类皮肤中老年斑外观的能力与所述ADRβ1受体拮抗剂的拮抗活性相关联。

6.根据权利要求1所述的筛选方法，还包括在选自B16细胞分析的黑素合成分析或皮肤模型中评价所述受试试剂。

7.根据权利要求1所述的筛选方法，其中在ADRβ1受体拮抗剂和ADRβ1受体之间结合相互作用时产生发冷光的信号。

8.一种被配制用于局部施用至皮肤的化妆品组合物，包含至少一种通过权利要求1的方法被鉴定为ADRβ1受体拮抗剂的受试试剂。

9.根据权利要求8所述的化妆品组合物，其中所述ADRβ1受体拮抗剂选自palGQPR、palGHK、acetylGHK、acetylGQPR、去氧苯比妥、十一碳烯酰基苯丙氨酸、以及它们的组合。

10.一种用于确定至少一种受试试剂对于改变有色皮肤的外观有效的筛选方法，所述方法包括：

使细胞、细胞培养物、或大量细胞与所述受试试剂接触，其中所述细胞、细胞培养物、或大量细胞包含ADRβ3受体；以及

基于所述受试试剂与所述ADRβ3受体的结合相互作用，确定所述受试试剂是否是适合用于改变有色皮肤的外观的ADRβ3受体激动剂。

11.一种被配制用于局部施用至皮肤的化妆品组合物，包含通过权利要求10的方法被鉴定为ADRβ3受体激动剂的受试试剂。

12.根据权利要求11所述的化妆品组合物，其中所述ADRβ3受体激动剂包含一种或多种选自下列的化合物：ZD7114、阿米贝隆、索拉贝隆、L-796568、CL-316243、LY-368842、以及它们的组合。

13.一种用于确定至少一种受试试剂对于改变有色皮肤的外观有效的筛选方法，所述方法包括：

使细胞、细胞培养物、或大量细胞与所述受试试剂接触，其中所述细胞、细胞培养物、或大量细胞包含ADRα1B受体、ADRα2C受体、或二者；

基于所述受试试剂与所述ADRα1B受体、ADRα2C受体、或二者的结合相互作用，确定所述受试试剂是否是适合用于改变有色皮肤的外观的ADRα1B受体拮抗剂和/或ADRα2C受体拮抗剂。

14.一种被配制用于局部施用至皮肤的化妆品组合物，包含通过权利要求13的方法被鉴定为ADRα1B受体拮抗剂的受试试剂，任选地其中所述ADRα1B拮抗剂选自多沙唑嗪、哌唑嗪、卡维地洛、以及它们的组合。

15.一种被配制用于局部施用至皮肤的化妆品组合物，包含通过权利要求13的方法被鉴定为ADRα2C受体拮抗剂的受试试剂，任选地其中所述ADRα2C拮抗剂选自育亨宾、螺沙群、卡维地洛、以及它们的组合。

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