CN103194511B - 一种脂肪酶催化合成克林霉素脂肪酸酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脂肪酶催化合成克林霉素脂肪酸酯的方法。该方法包括下述步骤：在脂肪酶的催化作用下，使克林霉素与脂肪酸和/或脂肪酸酯在20～80℃的条件下，反应0.05～72小时，反应液经过分离纯化得到克林霉素脂肪酸酯。其中，克林霉素与脂肪酸和/或脂肪酸酯的摩尔比为1∶0.1～1∶10；脂肪酶的用量为克林霉素质量的0.01～10倍。本发明首次实现了克林霉素脂肪酸酯的酶催化合成，避免了该产品在化学方法合成中对克林霉素中3，4位羟基的保护和脱保护过程，减少了工艺流程，具有催化效率高、选择性好、稳定性好等特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种脂肪酶催化合成克林霉素脂肪酸酯的方法。
背景技术
克林霉素脂肪酸酯是由克林霉素2号位羟基与脂肪酸或脂肪酸酯进行酯化或转酯化合成得到；而盐酸克林霉素棕榈酸酯是目前克林霉素脂肪酸酯中唯一经FDA批准的临床常用的抗生素。克林霉素棕榈酸酯是克林霉素的前体药物，在体外无抗菌活性，在体内经酯酶水解形成克林霉素而发挥抗菌活性，克林霉素的抗菌机理与大环内酯类抗生素相似，通过与细菌核糖核蛋白体50s亚单位结合，抑制肽链的延长和细菌蛋白质的合成；同时清除细菌表面A蛋白和绒毛状外衣，使其易被吞噬和杀灭而达到抑制细菌作用。
临床上盐酸克林霉素主要治疗厌氧细菌的感染，亦可治疗原生动物疾病，如疟疾。它是痤疮的常用外用处方药，并可有效治疗抗药性金黄色葡萄球菌。但克林霉素味道极苦，而克林霉素棕榈酸酯作为前体药物则苦味显著降低适合口服。
克林霉素棕榈酸酯化学名是6-(1-甲基-反-4-丙基-L-2-吡咯烷甲酰氨基)-1-硫代-7(S)-氯-6，7，8-三脱氧-L-苏式-α-D-半乳辛吡喃糖苷2-棕榈酸酯盐酸盐，分子式C34H63ClN2O6S，分子量699.87，结构式如下：
长期以来，国内外的盐酸克林霉素棕榈酸酯均是通过化学方法来合成生产的。如：英国专利GB1205083以茴香醛为保护剂和盐酸克林霉素一起同流水分制备得到3，4-位羟基保护的盐酸克林霉素，再与棕榈酰氯反应水解脱保护制备得盐酸克林霉素棕榈酸酯。赵鹏等人(赵鹏；成西涛；蓝伟；田斌应用化工，2008年06期)则以盐酸克林霉素和棕榈酸氯为原料，2，2-二甲基丙烷为保护剂反应合成异丙叉克林霉素棕榈酸酯后经水解脱保护等得到类白色的粉末状的盐酸克林霉素棕榈酸酯。中国专利CNI332967C将缩酮克林霉素、三乙胺溶液与溶解在氯仿中的棕榈酰氯在搅拌下50-90℃的水浴中反应得到棕色稠状物的克林霉素棕榈酸酯。
但以上这些方法在化学反应前后均需对3，4位羟基进行保护和脱保护，如英国专利使用了茴香醛，赵鹏等人使用了2，2-二甲基丙烷，而中国专利使用的缩酮化克林霉素则是使用了盐酸克林霉素保护后的原料。因此，寻找一种简便的、无需对3，4位羟基进行保护和脱保护且转化率高的制备克林霉素脂肪酸酯的方法，具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备克林霉素脂肪酸酯的方法。
本发明所提供的制备克林霉素脂肪酸酯的方法，包括下述步骤：在脂肪酶的催化作用下，使克林霉素与脂肪酸和/或脂肪酸酯进行反应，得到所述克林霉素脂肪酸酯。
其中，克林霉素与脂肪酸和/或脂肪酸酯的摩尔比为1∶0.1～1∶10，优选1∶2～1∶5，进一步优选1∶3～1∶4。
所述脂肪酶的用量为克林霉素质量的0.01～10倍，优选1～5倍，进一步优选3～5倍。
所述反应的反应温度为20～80℃，优选40～60℃，进一步优选40～50℃；反应时间为0.05～72小时，优选24～48小时，进一步优选40～48小时。
所述反应的反应介质为含水量不高于0.5％的有机溶剂。所述有机溶剂选自下述至少一种：乙腈、丙酮、石油醚、甲苯、正己烷、环己烷、庚烷、辛烷、壬烷和癸烷。
所述反应可在摇床中进行，所述摇床的转速可为0-1000r/min。
所述方法还包括对得到的克林霉素脂肪酸酯进行纯化的步骤。
本发明中所述的克林霉素为盐酸克林霉素、克林霉素游离碱、克林霉素醇化物、3，4-缩酮化克林霉素或以上混合物。
本发明中所述的脂肪酸或脂肪酸酯为：棕榈酸、棕榈酸乙烯酯、棕榈酸甲酯、棕榈酸乙酯；癸酸、癸酸甲酯、癸酸乙酯；月桂酸、月桂酸甲酯、月桂酸乙酯；肉豆蔻酸、肉豆蔻酸甲酯、肉豆蔻酸乙酯；硬脂酸、硬脂酸甲酯、硬脂酸乙酯；油酸、油酸甲酯、油酸乙酯或以上混合物；优选棕榈酸、棕榈酸乙烯酯、棕榈酸甲酯、棕榈酸乙酯或其混合物。
本发明中所述的脂肪酶包括游离脂肪酶或者固定在载体上的固定化脂肪酶，所述载体为硅藻土、树脂或纺织品膜。
所述脂肪酶具体可选自下述任意一种：南极假丝酵母脂肪酶A(Candida antarcticaLipase)，南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica Lipase B)，褶皱假丝酵母脂肪酶(Candida rugosa Lipase)，猪胰脂肪酶(Porcine pancreas Lipase)，米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei Lipase)和疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosusLipase)。
上述脂肪酶商品化的固定化酶可为诺维信脂肪酶435(Novozym435)，LipozymeRM IM或Lipozyme TL IM。
本发明首次实现了克林霉素脂肪酸酯的酶催化合成，避免了该产品在化学合成方法中对克林霉素的3，4位羟基进行保护和脱保护的过程，减少了两步工艺流程，还具有条件温和、催化效率高、选择性强、稳定性好等特点。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中所采用的固定化脂肪酶：Novozym435、Lipozyme TL IM和LipozymeRM IM均购自于丹麦诺维信公司。
Novozym435所对应的酶为Candida antarctica lipase B、Lipozyme RM IM所对应的酶为Rhizomucor miehei Lipase、Lipozyme TL IM所对应的酶为Thermomyces lanuginosusLipase。
Novozym435对于酯类合成的活力可用1克酶生成的月桂酸丙酯单位(PLU/g)来表示，Novozym435的酶活力为10000PLU/g。
Lipozyme TL IM的酶活力为250IUN/g。
1个IUN的定义是按下列分批酯交换的条件，初始速率达到每分钟转化0.01％(重量比)的硬脂酸三甘油酯：
底物：极度氢化大豆油与大豆由按27∶73重量比混合；
温度：70℃；辅助溶剂：无；加酶量：10％重量比。
Lipozyme RM IM的活力并不固定。每个批次的产品各有宣称的活力。典型的活力是5-6BAUN/g。Lipozyme BM IM的酯交换活力以BAUN/g表示。BAUN是BatchAcidolysis Unit Novo诺维信分批酸解单位的缩写。
Lipozyme RM IM活力的测定基于分批的酸解检定。
底物：高油酸含量的葵花籽油；癸烯酸
温度：70℃(158°F)
时间：60分
反应速率由测量结合到高油酸含量葵花籽油的三甘油酯分子1，3位置上的癸烯酸的量来决定。
实施例1～16的反应条件及结果列于表1中，表中：A-脂肪酶，B-脂肪酶/克林霉素质量比，C-底物名称(脂肪酸酸或脂肪酸酯)，D-底物摩尔比(克林霉素/脂肪酸或脂肪酸酯)，E-溶剂含水量，另以下所用克林霉素均为克林霉素游离碱。
实施例1：合成克林霉素棕榈酸酯
将底物42mg(0.1mmol)克林霉素游离碱和77mg(0.3mmol)棕榈酸与2ml含水量小于0.5％的正己烷溶剂和126mg脂肪酶(Novozym435)混合，在温度为40℃的条件下，摇床中(200r/min)，反应40h，转化率为80％；取出固定化脂肪酶，反应液经过分离、结晶得到盐酸白色克林霉素棕榈酸晶体。
实施例2：
操作步骤同实施例1，不同之处在于：0.3mmol棕榈酸替换为0.3mmol棕榈酸乙烯酯，其转化率为82％。
实施例3：
操作步骤同实施例1，不同之处在于：0.3mmol棕榈酸替换为0.3mmol棕榈酸乙烯酯，126mg脂肪酶替换为168mg脂肪酶，其转化率为95％。
实施例4：
操作步骤同实施例1，不同之处在于：0.3mmol棕榈酸替换为0.4mmol棕榈酸乙烯酯，其转化率为85％。
实施例5：
操作步骤同实施例1，不同之处在于：0.3mmol棕榈酸替换为0.3mmol棕榈酸乙烯酯，反应温度由40℃替换为50℃，其转化率为81％。
实施例6：
操作步骤同实施例1，不同之处在于：0.3mmol棕榈酸替换为0.3mmol棕榈酸乙烯酯，126mg脂肪酶替换为210mg脂肪酶，反应时间由40小时替换为48小时，其转化率为90％。
实施例7-8：
操作步骤同实施例1，不同之处在于：0.3mmol棕榈酸分别替换为0.3mmol棕榈酸甲酯、0.3mmol棕榈酸乙酯，其转化率分别为78％、75％。
实施例9-12：
操作步骤同实施例1，不同之处在于：反应溶剂分别替换为石油醚、环己烷、正庚烷、正癸烷，转化率依次为81％、82％、80％、79％。
实施例13-14：
操作步骤同实施例1，不同之处在于：底物棕榈酸分别替换为月桂酸、肉豆蔻酸，转化率依次为42％，31％。
实施例15-16：
操作步骤同实施例1，不同之处在于：脂肪酶分别改用为TLIM、RMIM，转化率分别为70％，71％。
表1
Claims (5)
1.一种制备克林霉素脂肪酸酯的方法，包括下述步骤：在脂肪酶的催化作用下，使克林霉素与脂肪酸和/或脂肪酸酯进行反应，得到所述克林霉素脂肪酸酯；
所述克林霉素选自下述至少一种：盐酸克林霉素、克林霉素游离碱、克林霉素醇化物和3,4-缩酮化克林霉素；
所述脂肪酸和/或脂肪酸酯选自下述至少一种：棕榈酸、棕榈酸乙烯酯、棕榈酸甲酯、棕榈酸乙酯或其混合物；
所述反应的反应介质为含水量不高于0.5％的有机溶剂；所述有机溶剂具体选自下述至少一种：乙腈、丙酮、石油醚、甲苯、正己烷、环己烷、庚烷、辛烷、壬烷和癸烷；
所述克林霉素与脂肪酸和/或脂肪酸酯的摩尔比为1:3～1:5；
所述脂肪酶的用量为克林霉素质量的3～5倍；
所述反应的反应温度为40～50℃；反应时间为40～48小时。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述脂肪酶选自下述任意一种：南极假丝酵母脂肪酶，褶皱假丝酵母脂肪酶，猪胰脂肪酶，米黑根毛霉脂肪酶和疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述南极假丝酵母脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶B。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应在摇床中进行，所述摇床的转速为0-1000r/min。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法还包括对得到的克林霉素脂肪酸酯进行纯化的步骤。
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