CN103193848A

CN103193848A - 拟人参皂苷rt6及其提取方法和其药物用途

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Publication number: CN103193848A
Application number: CN2013101183378A
Authority: CN
Inventors: 李平亚; 林美妤; 韩柳; 郑茜; 李卓; 刘海宇; 王翠竹; 刘金平
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2013-04-06
Filing date: 2013-04-06
Publication date: 2013-07-10
Anticipated expiration: 2033-04-06
Also published as: CN103193848B

Abstract

本发明涉及拟人参皂苷RT6及其提取方法和其药物用途。属于新化合物及其药物用途。以西洋参茎叶为原料，经过醇提，正，反相硅胶柱层析，重结晶方法，得到了一种新化合物，其化学名称为：(20S,24R)-6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-达玛-3-酮-20,24-环氧-6α,12β,25-三醇。拟人参皂苷RT6在制备抗肿瘤药物中有着广泛的药物用途。

Description

拟人参皂苷RT6及其提取方法和其药物用途

技术领域

本发明属于医药领域，尤其是指一种新化合物及其提取方法，和其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

西洋参(Panax quinquefolius L.)又称花旗参、美国人参,为五加科人参属植物，原产于北美洲加拿大蒙特利尔、魁北克、温哥华山区和美国东部，20世纪70年代在我国吉林、黑龙江和陕西等省引入。西洋参作为传统中药，应用历史悠久，自18世纪在美洲被发现后由法国人传至中国，作为药用，也有300多年历史，早在清康熙三十三年，当时的医学家汪昂著《补图本草备要》的增补项中首先收载了西洋参，称其“性凉、味苦、甘厚、气薄；补肺降火、生津液、除烦倦,虚而有火者相宜”。

西洋参中的化学成分比较复杂，包括皂甙类、氨基酸类、糖类、挥发油类、无机元素类和脂肪酸类等。西洋参茎叶总皂苷(Panax quinquefolium saponins，PQS)是西洋参茎叶中主要的活性成分。迄今为止，已从西洋参地下及地上部分分离鉴定出四种类型的皂甙：原人参二醇型、原人参三醇型、齐墩果酸型、奥克梯隆醇型皂苷。其中奥克梯隆醇型皂苷是西洋参中特有成分，是区别同属植物人参的显著标志。

原人参二醇型皂苷(Protopanaxadiol，PPD)，根据C-20的绝对构型不同可分为20(S)和20(R)-原人参二醇型皂苷，如人参皂苷Ra1、Ra2、Rb1、Rb2、Rc和Rd,现代研究表明：其主要有肝肾保护作用，抗肿瘤作用，抑制中枢系统、改善小鼠学习记忆能力和脑代谢，减轻脑损伤。改善微循环、抑制血小板聚集，减少炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α释放以减轻心源性休克、肺水肿等急性心、肺的损伤，对缺血再灌注后损伤的心肌及人肾小管细胞具有一定保护作用。除此以外，人参二醇型皂甙还有降血糖、调节血脂、保护内皮细胞、调节冠脉血管张力、增加心肌血流灌注，具有一定的抗动脉粥样硬化作用并且与化疗药物合用可以增加化疗药物的抗癌效应等。

原人参三醇型苷(Protopanaxatriol，PPT)，根据C-20位绝对构型不同可分为20(S)和20(R)-原人参三醇型皂苷，如人参皂苷Re、Rg1、Rf、Rg2和Rh1等，其主要作用有改善正常大鼠的学习记忆能力，抗氧化损伤、通过阻滞钙通道从而改善大鼠的心肌收缩功能，增强机体的免疫功能等。

齐墩果酸（Oleanolic acid）：目前从人参皂苷得到的齐墩果酸型皂苷主要为人参皂苷Ro(Ginsenoside Ro)。具有肝肾保护作用，免疫双调节作用以及抑制血小板凝集、降血脂、降糖、抗病毒、消炎、抗突变及抗癌等作用。

奥克梯隆醇型皂苷（ocotillol type）：从西洋参中主要得到两种奥克梯隆醇型皂苷：伪人参皂苷F11和RT5。其主要有促进学习记忆能力，对物理性及化学性损伤造成的急性脑缺氧具有保护作用，对心血管系统既有外周又有中枢调节作用，对心肌具有正性肌力作用等。

西洋参茎叶总皂苷（PQS）具有抗心肌缺血和保护心肌、抗心律失常、抑制心室重构、抗病毒性心肌炎、降压等作用。

抗心肌缺血和保护心肌：丁涛等研究显示PQS能明显减少冠脉结扎犬心肌缺血程度和范围，缩小心肌梗死面积，降低血清中游离脂肪酸(FFA)和丙二醛(MDA)含量，同时还降低急性心肌缺血大鼠血清中乳酸脱氢酶(LDH)，肌酸激酶(CK)，天冬氨酸转氨酶(AST)含量,提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，从而起到抗心肌缺血，保护受损心肌作用。

抗心律失常：PQS的抗心律失常机制主要与其对钙离子通道的阻滞作用密切相关的。有研究发现PQS可使大鼠心肌细胞动作电位的波幅、波宽、阈点位、最大除极速度减小并能抑制豚鼠心房肌静息电位后增强现象，缩短动作电位时程，延长有效不应期，降低心肌收缩力，其机制与抑制心肌细胞膜Na⁺、Ca²⁺、K⁺离子流有关。

对血管保护作用：PQS可对抗由氯化钾、氯化钙和去甲肾上腺素导致的家兔主动脉条血管平滑肌的收缩。其机制与抑制细胞外与细胞内的钙内流的释放有关。研究表明PQS可使缺血心肌血管内皮生长因子，碱性成纤维生长因子表达增强，心肌微血管密度增加，提示PQS可以通过促进大鼠AM I后缺血心肌内源性VEGF和bFGF的合成与分泌进而促进心肌血管新生，血管密度增加，改善心肌微循环。血管平滑肌细胞的异常增殖是动脉粥样硬化形成、高血压与血管再狭窄的共同细胞病理基础之一。

抗病毒性心肌炎作用：研究显示西洋参可明显提高病毒性心肌炎小鼠存活率,使心肌组织病理改变恢复加快,心肌细胞凋亡坏死率减低及外周血T细胞亚群比例改善、自身抗体减少,表明其对病毒性心肌炎小鼠有较好的治疗作用。

降压作用：研究表明国产西洋参总黄酮通过对外周阻力血管的扩张,明显降低大鼠的血压、心率。Stavro PM等研究显示西洋参有中等强度的降压作用。除此之外,PQS还有调脂、抗动脉粥样硬化及稳定斑块等作用。

发明内容

本发明提供一种拟人参皂苷RT6及其提取方法和其药物用途。

如以下结构式所述的拟人参皂苷RT6：

分子式:C₃₆H₆₀O₁₀

分子量：652.5

化学名称：(20S,24R)-6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-达玛-3-酮-20,24-环氧-6α,12β,25-三醇。

白色针晶（乙酸乙酯-甲醇1:1），mp259-260℃；TLC检测，10%硫酸-乙醇为显色剂，105℃下加热显紫红色斑点；是从西洋参茎叶中分离得到的新单体化合物。

本发明所述的拟人参皂苷RT6的提取方法是：

取西洋参茎叶，加3-8倍量的60-95%乙醇加热回流提取，每次3-6小时，共提取5-7次，合并提取液，回收溶剂至干；将乙醇提取物经硅胶柱色谱，洗脱剂：CHCl₃-MeOH 90～120:10～30；C-18反相柱色谱，洗脱剂：MeOH-H₂O 80～90:20～10；乙酸乙酯：甲醇2:4～6重结晶，得到拟人参皂苷RT6。

本发明所述的拟人参皂苷RT6在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明所述的拟人参皂苷RT6在制备抗人乳腺癌或人前列腺癌或人肺癌药物中的应用。

目前未见到有关拟人参皂苷RT6的提取方法及化合物的报道，该化合物属于新化合物，属于首次分离得到；该化合物的新的药物用途属首次发现。

当本发明用于制备抗肿瘤药物时，其口服或胃肠外给药，均是安全的，在口服情况下，其可以任何常规形式给药，如散剂、粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、溶液剂、悬浮液、糖浆、口腔含片、舌下含片等：当该药物肠胃外给药时，可采取任何常规形式，例如注射剂：如静脉内注射、软膏剂、栓剂、经皮给药、吸入剂等。

本发明制备抗肿瘤的药物是由有效成分单体或有效成分与固体或液体的赋形剂一起构成的，这里使用的固体或液体的赋形剂在本领域是众所周知的，下面举几个具体例子，散剂是内服的粉末剂，它的赋形剂有乳糖、淀粉、浆糊精、碳酸钙、合成或天然硫酸铝、氧化镁、硬脂酸镁，碳酸氢钠、干燥酵母等；溶液剂的赋形剂有水、甘油、1，2-丙二醇、单糖浆、乙醇、乙二醇、聚乙二醇、山梨糖醇等；软膏剂的赋形剂可以使用脂油，含水羊毛脂、凡士林、甘油、蜂腊、木腊、液体石腊、树脂、高级腊等组合成的疏水剂或亲水剂。

本发明的有益效果在于，新化合物拟人参皂苷RT6可用于制备抗肿瘤的药物，具有疗效显著的特点。与人参、西洋参中原有的抗肿瘤主要成分（人参皂苷Rg3）比较，该新型母核结构的化合物具有更好地抗肿瘤作用。同时，文献报道C-3连有羰基的四环三萜类类似化合物大都具有免疫增强的作用，推测该新型母核结构的化合物具有抗肿瘤活性可能与增强机体的免疫力有关。

有效物质的剂量可以根据服用方式，病人的年龄和体重及病情严重程度和其它类似的因素而改变，口服量为：20～100mg，每日二次服用；注射5～20mg，每日一次～二次。

附图说明

图1是本发明化合物的¹H NMR谱；

图2是本发明化合物的¹³C NMR谱；

图3是本发明化合物的HMBC谱；

图4是本发明化合物的HMQC谱。

具体实施方式

实施例1

取西洋参茎叶1000g，加3000ml 60%乙醇加热回流提取，每次3小时，共提取5次，合并提取液，回收溶剂至干；将乙醇提取物经硅胶柱色谱，洗脱剂：CHCl₃-MeOH90:30；C-18反相柱色谱，洗脱剂：MeOH-H₂O 80:20；乙酸乙酯：甲醇2:4重结晶，得到拟人参皂苷RT6。

实施例2

取西洋参茎叶1000g，加5500ml 80%乙醇加热回流提取，每次4.5小时，共提取6次，合并提取液，回收溶剂至干；将乙醇提取物经硅胶柱色谱，洗脱剂：CHCl₃-MeOH 105:20；C-18反相柱色谱，洗脱剂：MeOH-H₂O 85:15；乙酸乙酯：甲醇2:5重结晶，得到拟人参皂苷RT6。

实施例3

取西洋参茎叶1000g，加8000ml 95%乙醇加热回流提取，每次6小时，共提取7次，合并提取液，回收溶剂至干；将乙醇提取物经硅胶柱色谱，洗脱剂：CHCl₃-MeOH120:10；C-18反相柱色谱，洗脱剂：MeOH-H₂O 90:10；乙酸乙酯：甲醇2:6重结晶，得到拟人参皂苷RT6。

鉴定例：采用波谱学方法进行结构鉴定。

HR-ESI-MS谱给出分子量为651.4115[M-H]^-的准分子离子峰，结合¹H NMR、¹³CNMR谱确定其分子式为C₃₆H₆₀O₁₀。IR：ν_max3400,1700,1450and1330cm^-1。

¹H-NMR谱(500MHz，C₅D₅N)中未给出烯氢质子信号；中场未给出糖质子信号；高场给出8个甲基信号:δ1.81(3H,s),1.72(3H,s),1.44(3H,s),1.24(3H,s),1.23(3H,s),1.10(3H,s),0.78(3H,s),0.77(3H,s).；与人参二醇比较，少一个甲基质子信号。¹H-NMR谱中还给出其它质子信号。

化合物的¹³C-NMR（125.8MHz，C₅D₅N）谱中共给出36个碳信号。其中一组葡萄糖碳信号，结合化合物的¹H-NMR（500MHz，C₅D₅N）给出的一个糖端基质子信号δ4.97(1H,d,J=7.5Hz)可知葡萄糖为β-构型。碳谱中还给出8个甲基碳信号，7个次甲基碳信号，7个季碳信号以及1个羰基碳信号(δ218.5)。与拟人参皂苷RT₅比较，基本相似，除了A-环的碳信号意外。

在HMBC谱中,H-28,H-29与C-3远程相关.结合¹H NMR谱,确定羰基链接在C-3.HMBC谱还显示出H-28和C-29,C-3,C-4和C-5,H-29和C-28,C-3,C-4和C-5,H-1和C-19,H-5和C-10,C-19,C-28和C-29,H-21和C-17和C-22,H-24和C-26和C-27,H-18和C-7,C-8和C-9,H-19和C-5,C-9和C-10之间的相关。根据该化合物的HMBC谱归属了甲基质子的信号：化学位移为δ0.77的甲基质子与C-15(δ32.7)，C-8(δ40.1)，C-13(δ49.5)和C-14(δ52.3)有远程相关，指定为H-30位甲基；化学位移为δ1.10的甲基质子与C-7(δ43.1)，C-8(δ40.1)，C-9(δ49.1)和C-14(δ52.3)有远程相关，归属为H-18位甲基；化学位移为δ1.44的甲基质子与C-24(δ85.6)，C-25(δ70.4)和C-26(δ27.1)有远程相关，指定为H-27位甲基；化学位移为δ1.81的甲基质子与C-28(δ31.7)，C-4(δ48.1)，C-3(δ218.5)和C-5(δ58.0)有远程相关，归属为H-29位甲基；化学位移为δ1.23的甲基质子与C-22(δ31.8)，C-17(δ48.4)，C-20(δ86.7)有远程相关，指定为H-21位甲基；化学位移为δ0.78的甲基质子与C-10(δ38.4)，C-1(δ40.2)和C-9(δ49.1)有远程相关，归属为H-19位甲基；化学位移为δ1.72的甲基质子与C-3(δ218.5)，C-4(δ48.1)，C-5(δ58.0)和C-29(δ19.7)有远程相关，指定为H-28位甲基。在NOE谱中，当照射H-17质子时，可观察到H-21质子信号增强，说明C-21位的立体构型为S构型。当照射H-21质子时，可观察到H-27质子信号增强，说明C-24位的立体构型为R构型。

又根据该化合物的HMBC、HMQC谱归属了其他碳、氢信号。数据见表1。¹H NMR谱、¹³C NMR谱、HMBC谱、HMQC谱分别见附图1-4。

综合分析，鉴定该化合物为(20S,24R)-6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-达玛-3-酮-20,24-环氧-6α,12β,25-三醇。经Science Finder检索未发现有关该化合物的文献报道，为一新化合物。

表1 拟人参皂苷RT6的NMR数据和HMBC相关(500and125.8MHz,pyridine-d5)

本发明通过下面的药效学实验例进一步说明其药效。

实验例、MTT（四唑盐）法测定拟人参皂苷RT6对肿瘤细胞的杀伤作用的选择

⑴试验设计

使用瘤株：MCF-7人乳腺癌细胞、PC3M人前列腺癌细胞、NCI-H446人肺癌细胞三种人体肿瘤细胞系。

（注：不同细胞采用不同的培养液：RPMI1640、IMDM、DMEM。）

试验分组：

拟人参皂苷RT6组：1.0、2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20μg/ml；

人参皂苷Rg3组：1.0、2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20μg/ml；

空白对照组：溶剂；

阳性对照组：5-氟尿嘧啶(1.0μg/ml)。

⑵方法：

①MTT液的配制：250mgMTT，放入小烧杯中，加50mlPBS（pH7.4,0.01M），搅拌30min，配制成浓度为5mg/ml溶液，用0.22um的微孔滤器滤菌，分装，4℃保存，两周内有效。

②取对数生长期的肿瘤细胞，加入适量0.25%胰蛋白酶，使贴壁细胞脱落，作细胞计数，一般不着色的活细胞应在97%以上，配成6×10⁴/ml细胞悬液。

③取96孔平板，每孔加细胞悬液100ul。将平板置37℃5%CO₂温箱24h。

④孵育24h后，于96孔板加入100μl/孔不同浓度的SPG-Rg3（SPG-Rg3用无血清培养基稀释，调成所需浓度），置37℃5%CO₂温箱孵育72h。

⑤96孔板每孔加入20ulMTT液（MTT用无血清RPMI1640培养液配成5mg/ml溶液）继续孵育4h，终止培养。

⑥小心吸弃上清液，每孔加入150ul DMSO，震荡10min，使结晶物充分溶解；

⑦用自动化分光光度平板读数计在570nm处测定每个小孔的光密度（OD值）。

⑧结果判定：

a.计算出细胞存活率:

（计算细胞存活率时，将各测试孔的OD值减去本底OD值，各重复孔的OD值取均数±SD）

b.求出T/C=50%时的药物浓度（IC₅₀）及T/C=10%时的药物浓度（IC₉₀）。

c.数据使用SPSS软件分析系统进行处理（加权直线回归法）。

⑶结果：实验结果表明：与人参、西洋参中抗肿瘤主要成分——人参皂苷Rg3比较，拟人参皂苷RT6对3种人体肿瘤细胞均有更强的杀伤作用，结果分别见表2-4。

表2 对MCF-7人乳腺癌细胞的影响

表3 对PC3M人前列腺癌细胞的影响

表4 对NCI-H446人肺癌细胞的影响

制备药剂的实施例1：

拟人参皂苷RT6 1.0g，以1，2-丙二醇100ml溶解，过滤后分装，每支1ml，含拟人参皂苷RT6 10mg。

制备药剂的实施例2：

拟人参皂苷RT6 10.0g，药用淀粉适量，二者充分混合，装胶囊，制成200粒胶囊，每粒重0.20g，含拟人参皂苷RT6 50mg。

Claims

1.一种如下式的拟人参皂苷RT6，

化学名称是：(20S,24R)-6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-达玛-3-酮-20,24-环氧-6α,12β,25-三醇。

2.如权利要求1所述的拟人参皂苷RT6的提取方法：其特征在于包括下列步骤：

3.如权利要求1所述的拟人参皂苷RT6在制备抗肿瘤药物中的应用。

4.如权利要求3所述的拟人参皂苷RT6在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤为人乳腺癌或人前列腺癌或人肺癌。