CN103180713B - 移动微实体流中的运动相关误差的表征 - Google Patents
移动微实体流中的运动相关误差的表征 Download PDFInfo
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Abstract
描述了用于检测和表征移动微实体的运动相关误差的设备和方法。运动相关误差可出现在移动微实体的流中，并且可表示期望到达时间的偏差或微实体位置的不确定性。在流式细胞计中观测到的微实体的运动相关误差，例如为脉冲抖动，并且被发现具有与关于系统时钟的参数的函数相关性。可通过关联在流体流中移动的微实体的测量结果来表征运动相关误差。
Description
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.119(e)要求于2011年8月25日提交的名为“System and Method for Correction of Pulse Jitter in FlowCytometers”的美国临时申请No.61/527,340的优先权，其整体在此引入作为参考。
技术领域
所述方法和设备涉及对移动微实体流中的运动相关误差进行表征。可以使用对更高阶运动特征的评估以改善对移动微实体的测量和/或操作。应用领域包括流式细胞术、微流体（microfluidics）及纳米制造。
背景技术
近年来，对微实体的分析、开发和制造领域已经变得在各种技术中广泛应用。这里使用的微实体可包括细胞、微生物、微颗粒或纳米颗粒、液滴、分子、蛋白质、肽、校准颗粒、以及微制造结构，该微制造结构诸如为微机电（MEM）结构、微电子芯片及微传感器。微实体可包括最大尺寸小于约1毫米（mm）的任何实体（人造或自然生成的）。在一些研究、医学或制造应用中，大数目的微实体可以流的方式移动。所述流可以是控制对进入流的微实体的移动和计量的系统的一部分。一个示例应用为对流式细胞计中的细胞进行表征和分选。另一个实例可以为对微流体通道中的微实体进行移动、观察和分选。
在一些应用中，可能期望在一个或多个选择的时间精确获知移动流中的所选择的微实体的位置，或者在其它实施例中，精确获知所选择的微实体将到达一个或多个位置的时间。例如，参考图1，微实体125可在微实体流120中移动。微实体的流120可包括能够输送微实体的流体流（例如气体、液体或颗粒流）或流动路径。微实体可以悬浮在流中。在一些情况中，微实体的流120可包括以类似流的方式移动的微实体的稠密集合。微实体的流120可通过机械、电学和磁方式的任何组合传送。
可在第一时间t1于第一位置P1检测到微实体125，并且可能期望知道微实体125到达沿流的预先选择的第二位置P2或多个其它位置的时间t2。相反地，可在第一时间t1于第一位置P1检测到微实体125，并且可能期望知道微实体125在预先选择的经过时间t3或其它多个时间之后将位于哪个位置P3或其它多个位置。在前者的情况中，预测到达时间t2有利于于确定何时可以在第二位置P2处对微实体进行测量或操作（例如，分选操作、成像操作、充电操作、转化操作、照射实体、信号检测等）。在后者的情况中，预测微实体125的位置P3有利于精确跟踪流中的实体的移动和/或演变，例如，当微实体沿流移动时获取并重叠微实体的多个图像。
一种用于预测移动流中的微实体的到达时间t2或位置P3的方法为基于平均流速度vavg计算t2或P3的期望值。平均流速度可以以任何合适的方法测量或确定。如果求出或已知vavg，则可以通过关系式d=vavg×t确定t2或P3，其中d为微实体125在经过时间t中行进的距离。一种用于预测在预定位置P2的到达时间t2的可选方法为，在P1处观测到实体之后将平均传输时间或延迟时间Δtavg加到t1的值。时间Δtavg可以以任何合适的方法测量或确定。在一些情况中，这些预测移动微实体的到达时间或位置的方法已经足够。
流式细胞计是使用流以传输微实体用于对诸如生物细胞的微实体进行表征和分选的系统实例。流式细胞计广泛用于快速分析异质细胞悬浮物，以识别构成子种群。其中使用流式细胞计细胞分选的许多应用实例包括：隔离稀少种群的免疫系统细胞用于艾滋病（AIDS）研究，隔离遗传非典型细胞用于癌症研究，隔离特定染色体用于基因研究，以及隔离各种微生物品种用于环境研究。例如，荧光标记的单克隆抗体被经常用作“标记物”以识别诸如T淋巴细胞和B淋巴细胞的免疫细胞，临床实验室使用该技术以对HIV感染病人的“CD4阳性”T淋巴细胞数目进行计数，他们还使用该技术以识别与各种白血病和淋巴癌相关的细胞。
近来，相比于严格地研究应用，两种关注领域为面向临床的移动细胞分选，病患护理应用。首先从化学制药开发转移到生物制药开发。例如，许多新的癌症治疗使用生物材料。这些包括一类基于抗体的癌症疗法。细胞分选器在识别、开发、提纯和最终制造这些产品中起到重要的作用。
与此相关的是转移到使用细胞置换疗法用于病患护理。目前在干细胞上的很多关注围绕经常称为再生疗法或再生医学的新医学领域。这些疗法可能经常要求将相对稀少的细胞从病人的组织分离。例如，可从骨髓分离出成人干细胞并最终作为再注入物的一部分回到其被移出的病人。流式细胞术和细胞分选是使得可以进行这些治疗的重要组织处理工具。
发明内容
描述了用于表征在流中移动的微实体的运动相关误差的设备和方法。移动微实体的运动相关误差可包括任何类型和形式的误差，该误差造成在已知在第一位置或第一时间检测到微实体的情况下相同微实体在第二位置或第二时间的期望到达时间或期望位置的偏移。移动微实体的运动相关误差可包括实际物理移动和/或微实体的似动（apparent movement）。可以理解，运动相关误差可与沿流的各个点的多个到达时间和位置相关。一个或多个期望到达时间或一个或多个期望位置可基于流中的运动的基本假设，例如，恒定速度和/或恒定加速度。在一些实例中，对运动相关误差的表征可获得说明各种类型的运动相关误差的微实体运动的更精确的模型。对微实体的运动相关误差的表征有利于诊断和改善被设计用于对流中移动的微实体进行测量和/或操作的设备的性能。
在一个实例中，开发技术和设备以表征流式细胞计的运动相关误差。发现在流式细胞计流中移动的微实体的询问点到达时间的偏移是稳定的并且函数地相关于系统参数。可使用偏移的函数相关性的模型以减小测量误差并改善流式细胞计的操作（例如，细胞处理能力和/或分选纯度）。
根据一些实施例，一种用于表征与在系统中在第一位置和一个或多个其它位置之间移动的微实体相关联的运动相关误差的系统，包括，检测设备，该检测设备被配置为至少在第一位置检测微实体的存在，以及一个或多个处理器。该一个或多个处理器可被配置为针对多个微实体的每一个，接收指示到达第一位置处的第一到达时间的第一信号。该处理器还可以被配置为针对多个微实体的每一个，测量相应延迟时间，其中在第一到达时间与由系统提供的参考信号之间测量该相应延迟时间。根据一些实施例，处理器还可以被配置为针对来自一个或多个其它位置的每一个其它位置的多个微实体的每一个，接收指示在所述一个或多个其它位置的每一个其它位置处的一个或多个相应其它到达时间的其它信号，并针对多个微实体的每一个，测量在所述一个或多个其它位置的每一个其他位置处，每个相应其它到达时间与相应的期望到达时间的相应偏差。在各个实施例中，一个或多个处理器可以适于与测量的相应偏差相关地存储所测量的相应延迟时间。
在陈述对多个微实体的每一个进行测量中，可以理解，可以不对流中的每个微实体进行测量。多个微实体可以是全部微实体的子集，并且可以指微实体的获得有效测量的部分。
在一些实施例中，用于表征与移动微实体相关的运动相关误差的系统包括周期性能量的源，其被配置为将周期性能量与移动微实体流耦合。用于周期性能量的驱动信号的特征可用作参考信号，通过其结合第一到达时间测量延迟。系统还可以包括激光器聚焦辐射源，其被用于光学地探测位于沿流的选定询问点的移动微实体。系统还可以包括光学检测器，其被配置为检测来自光学探测的微实体的辐射。
在一些实施中，一种用于表征与在系统中在第一位置和一个或多个其它位置之间移动的微实体相关的运动相关误差的系统，包括，检测设备，其被配置为至少在第一位置检测微实体的存在，以及一个或多个处理器。该一个或多个处理器可被配置为接收第一信号，该第一信号指示多个微实体的每一个到达第一位置的第一到达时间。一个或多个处理器还可以被配置为关于系统的参数基于接收的第一信号确定值。该值可以是表征微实体的运动相关误差的误差模型的分量。一个或多个处理器还可以被配置为对于来自一个或多个其它位置的每个的多个微实体的每个接收指示在一个或多个其它位置的每个的一个或多个相应其它到达时间的其它信号。另外，一个或多个处理器可被配置为对于多个微实体的每个，测量在一个或多个其它位置中每个处从相应其它到达时间到相应期望到达时间的相应偏移，并存储与测量的相应偏移相关的确定值。
还提出了一种用于表征在流中移动的微实体的运动相关误差的相关方法。例如，用于表征运动相关误差的方法包括通过检测设备对多个微实体的每个检测到达第一位置的第一到达时间。该方法还可以包括通过至少一个处理器对于多个微实体的每个测量相应延迟时间，其中在第一到达时间与由系统提供的参考信号之间测量相应延迟时间。该方法还可以包括，对于多个微实体的每个，检测在一个或多个第二位置的相应一个或多个第二到达时间，以及，对于多个微实体的每个，测量一个或多个第二到达时间中的相应变化，其中相对于期望的一个或多个第二到达时间测量相应变化。该方法还包括存储与一个或多个第二到达时间中的测量的相应变化相关的测量的相应延迟时间。
在本发明范围内还提出了一种有形的制造的计算机可读介质和/或存储装置，其包括可机读指令，该指令当由至少一个处理器执行时调节至少一个处理器以执行用于表征在流中移动的微实体的运动相关误差的方法的一个或多个步骤。计算机可读介质和/或存储装置可用于调节被设计为在流中移动的微实体上测量和/或操作的仪器。
通过下面结合附图的描述，可以更全面地理解本发明前述和其它方面、实施例和特征。
附图说明
本领域技术人员可以理解，这里所述附图仅为了说明的目的。可以理解，在一些情况中，为了方便理解本发明，可能扩大或放大地示出本发明各方面。在附图中，在各个图中，相同的标号通常表示相同的特征、功能相似和/或结构相似的元件。附图不一定成比例，重点是为了说明本发明的原理。附图不会以任何方式限制本发明范围。
图1示出移动微实体的流；
图2示意示出根据一个实施例的流式细胞计的选定部件；
图3A示意示出用于说明液滴动力学的校准的流式细胞计的选定部件；
图3B-3G示出根据一些实施例的可用于指示微实体在相应询问点的存在或表征微实体的信号图；
图4A-4F示出根据一些实施例的可在流式细胞计中使用或观察到的各种系统信号和数据；
图5为在流式细胞计中观察到的脉冲抖动的一个实例；
图6A示出根据一个实施例的当关于流式细胞计中的参考信号测量时在第一位置检测到的来自微实体的触发信号的延迟；
图6B示出图6A中观察的微实体在第二位置处的到达时间的对应变化；
图7A-7C为对于流式细胞计测量的抖动图的实例；
图8A示出根据一个实施例的当样本流体导管未与喷嘴同心对准时在流式细胞计中测量到的背景抖动；
图8B示出当样本流体导管中心对准时的相同系统中的背景抖动；
图9示出用于表征运动相关误差的方法的一个实施例；
图10A-10D为在不同的实验条件下对流式细胞计记录的抖动图；
图11A-11C是根据一个实施例的对流式细胞计中的沿流的三个询问点记录的抖动图；
图12示出对流式细胞计中的沿流的三个询问点和对不同的实验条件记录的抖动图；以及
图13示出根据一个实施例的对记录的抖动图的正弦拟和（黑线）。
通过下面结合附图的详细描述，本发明的特征和优点将变得更加清楚。
具体实施方式
如上所述，在一些涉及移动微实体的应用中，可能期望预测或获知微实体到达预选位置的到达时间，或相反地预测或获知微实体在选定时间的位置。对于低精度和/或低速系统，基于基本假设（例如，流中的实体的平均速度vavg，或平均传输时间Δtavg、恒定速度、恒定加速度）的预测对于获得微实体到达时间或位置的合理精确的预测以对微实体进行测量或操作已经足够。然而，对于高精度和/或高速系统，系统中的微实体的更高阶运动特征可能导致流中的实体的到达时间或位置的不能接受的大的不确定性。大的不确定性可能限制对移动微实体的操作和/或采集代表移动微实体的数据的能力。从而，时间或位置的大的不确定性可能对速度、精度、及系统的性能施加限制。
根据一些实施例，可以对于在系统中在第一位置和至少第二位置之间移动的微实体的运动相关误差进行表征和补偿。在一些系统中，运动相关误差可表现出与对移动微实体关于系统的参数测量的值的函数的和/或稳定的相关性。可进行对移动微实体的测量以表征运动相关误差并揭示误差与系统参数的相关性。通过这样的表征测量，可构建运动相关误差的模型并使用该模型来预测和/或补偿在系统中移动的微实体的运动相关误差。
图2示意示出流式细胞计200的某些元件。流式细胞计是包括移动微实体225（通常为在单个纵列中移动的细胞）的流的系统的一个实例。尽管将主要结合流式细胞计描述本发明的实施例，相同的技术和设备可用于使用移动微实体的流的其它系统或设备中。例如，本发明实施例可实施于微流体系统中和微米或纳米制造系统中，其中在流体流中制造微米或纳米实体。各个系统可适于对移动微实体进行一个或多个操作。这些系统中的操作类型可包括下列操作的任何组合：测量微实体的特征、成像、照射以检测荧光性、分选、转换（例如，引入化学或电学电荷、照射以交联聚合物、照射以转换微实体的成分）、尺寸分析、以及重量分析。
I.流式细胞计系统概述
30多年前首次将基于流式细胞术的细胞分选引入研究群体。这是一种已经广泛应用于生命科学研究的许多领域的技术，对于在诸如遗传学、免疫学、分子生物学和环境科学的领域中工作的技术人员是极为有用的工具。与诸如免疫淘选或磁柱分离的批量细胞分离技术不同，基于流式细胞术的细胞分选设备以每秒几千个细胞或更高的速度串行地测量、归类、然后分选各个微实体。该对单个细胞的快速“逐个”处理使得流式细胞术成为用于从来自另外异质细胞悬浮物的细胞提取高纯度子群的有价值的工具。
通常通过荧光材料以一些方式标记将分选的细胞。束缚到细胞的荧光探针在该细胞通过紧密聚焦、高强度光束（通常为激光束）时发出荧光。计算机记录每个细胞的发射强度。这些数据然后被用于对每个细胞分类，以用于具体分选操作。基于流式细胞术的细胞分选已经成功应用于多种细胞类型、细胞组分和微生物，以及多种尺寸相当的无机颗粒。
在当前的使用中有两种基本类型的细胞分选器。它们是“液滴细胞分选器”和“流体切换细胞分选器”。液滴细胞分选器使用微液滴作为将选定细胞传输或传送到采集器皿的容器。通过将超声能量耦合到喷射流而形成微液滴。包含选择的细胞的液滴然后被静电导引到希望的位置以对来自较大群的选择细胞进行分选。这可以是非常有效的过程，可以从单个流每秒分选多达90,000个细胞。
第二种基于流式细胞术的细胞分选器是流体切换细胞分选器。一些流体切换细胞分选器使用压电装置以驱动机械系统，该机械系统将流动样本流的一段偏转到采集器皿中。相比于液滴细胞分选器，流体切换细胞分选器由于用于偏转样本流的机械系统的循环时间可能具有较低的最大细胞分选速率。该循环时间，即初始样本偏转与恢复稳定非分选流动的时间之间的时间，通常显著大于在液滴细胞分选器上的液滴生成器的周期。该较长的循环时间将一些流体切换细胞分选器限定为几百个细胞每秒的处理速率。由于相同的原因，通过流体细胞分选器切换的一段流通常是来自液滴生成器的单个微液滴的体积的至少十倍。这导致相比于液滴分选器的采集器皿，在流体切换分选器的采集器皿中的细胞浓度相应较低。
近来，微流体分选器已经发展为根据需要使用MEMS致动器或电场以偏转微实体。这些分选器可以在诸如微流体芯片的完全封装的芯片中分选。使用微流体系统使得可以从相同的输入通道进行多个并行分选，从而增大了微流体分选器中的净处理量。
参考图2，流式细胞计200可包括喷嘴202，从喷嘴流出流体流220。喷嘴202可包括容纳鞘液（sheath fluid）的第一室205。喷嘴还可以包括导管203，该导管203将样本流体传送到流220的芯部。微实体225可悬浮在样本流体中。鞘液和样本流体可朝向喷嘴孔208流动，以流220的形式从喷嘴202流出。鞘液可形成流外围的鞘层。
喷嘴202还可以包括换能器212，该换能器212被配置为将能量耦合到至少鞘液中。换能器212可以是声学换能器，其基于规则的周期将声能耦合到鞘液中。将周期性能量耦合到鞘液和/或样本流体中可以高一致性调节从喷嘴202流出的流220中的液滴228的形成。由耦合到喷嘴内的流体的声能（例如，来自喷嘴中的压电换能器的周期性振动）导致流220中的扰动。由于如通过瑞利预测的表面张力，在声学频率下形成液滴228。在可接受的参数范围内（频率、鞘层压力、换能器驱动幅度等），液滴在距离喷嘴一致的距离处分离出来。在一些实施例中，细胞分选器可以实现一种反馈系统，该反馈系统把分离位置226保持在距离喷嘴孔208近似恒定的距离处。还可以与液滴228一起形成卫星液滴227。
如图2所示，从液滴细胞分选器的喷嘴流出的射流沿着流220向下承载微实体225行进了几个毫米，直到微实体255被封入从流同步分离出来的微液滴228之一中。在一些实施例中，微实体可以沿流以近似恒定的速度移动。在一些液滴细胞分选器中，从测量点（例如在束B1的第一询问点）到细胞通过分离点226（流分离为自由液滴的位置）的位置的飞行时间（tf）恒定在液滴生成时段的约1％内。
液滴228的形成可受到施加到换能器212的信号的下滴驱动频率fd和振幅Ad的影响。在一些实施例中，可通过下滴时钟265调节下滴驱动频率fd，下滴时钟265又可通过系统的处理器250控制。可通过被配置为向换能器212提供驱动信号的驱动器260调节下滴驱动振幅Ad。在一些实施例中，驱动器260可从处理器250接收振幅控制信号。根据一些实施例，增加下滴驱动振幅Ad将使液滴分离点226向喷嘴移动。改变驱动频率fd改变形成液滴的频率。在一些实施例中，驱动频率可选为具有在约10kHz和约250kHz之间的值。
处理器250可以是任何类型和形式的数据处理装置，例如，微处理器、微控制器、连接到系统的计算机、或现场可编程门阵列（FPGA）。在一些实施例中在系统中可有多于一个的处理器。在一些情况中，可以存在多种处理器类型的组合，例如微处理器和一个或多个FPGA。
系统200还可以包括用于在每个液滴228上放置电荷的设备。对液滴充电可用于各个液滴的分选操作，从而分选液滴中包含的微实体。可通过处理器250控制电荷源270，以在选定的时间量中对与鞘液和/或样本流体电接触的导电探针207施加选定的电势值。例如，当在流220中形成最后附着的液滴228-0时，可对导电探针207施加第一电势。由于流体是导电的，流体的表面带电，并且最后附着的液滴获取电荷。当最后附着的液滴从流分离以形成液滴时，例如移动到前一个液滴228-1的位置，新形成的液滴保存的电荷与在最后附着的液滴228-0从流220分离时施加到流体和流的电势相关。在一些情况中，在形成的液滴上的电荷与施加到流体的电势的方根成比例。在最后附着的液滴分离后，可以对导电探针207施加第二电势，从而形成为最后附着的液滴的下一个液滴将获得与其前任不同或相同的电荷。在一些情况中，可以不对液滴施加电荷（例如，接地电势或中性电荷）。
系统200还可以包括用于分选液滴的设备，从而对通过液滴传送的任何微实体进行分选。分选设备可包括静电偏转板290，对该静电偏转板施加电势以在板之间建立电场。当带电的液滴横穿过电场时，该液滴可以被横向偏转并被采集到样本器皿（未示出）中。被提供中性电荷的液滴可以在偏转板290之间通过而不被偏转板偏转。以该方式或类似方式，可以对微实体进行分选。
在各个实施例中，系统200可包括用于检测操作的部件，例如检测可用于表征移动微实体的一个或多个信号。该一个或多个信号可用于确定在含微实体的流分段上进行的后续操作（例如，分选操作）。对于图2所示的实施例，检测操作可包括通过来自一个或多个辐射源S1、S2、...S5的光学辐射照射微实体。辐射源可发出不同波长的辐射束B1、B2、...B5。在一些实施例中，一个或多个源可发出相同波长的辐射。在一些实施例中的辐射源S1、S2、...S5可以是激光源、在一些实施例中可以是高强度弧光灯源、在一些实施例中可以是高强度发光二极管、或者任何合适的辐射源。辐射束可以是分离的，并被设置为在喷嘴202附近与流220相交。在一些实施例中，可将辐射束聚焦到流220上。辐射束B1、B2、...B5可与微实体相互作用以产生散射的辐射或激发荧光辐射。例如可通过检测器D1检测散射或荧光辐射，检测器D1可生成代表检测到的辐射的电信号。可通过例如一个或多个检测器D2、D3、...D5检测代表荧光辐射的一个或多个信号。可通过光学元件215采集来自微实体的荧光辐射和/或散射的辐射，并将其引导到检测器。
在一些流式细胞计和其它系统中，例如微流体系统，可以使用其它类型的颗粒检测和感测。在一些实施例中，可以对沿流移动的微实体进行直接电感测或库尔特型（Coulter-type）测量。在一些情况中，可进行库尔特体积测量以表征微实体。在一些实施中，可使用其它类型的感测，例如磁的、磁光的、电光的、热学的感测。可使用利用这些检测和感测技术中的任意技术的信号或测量结果以表征和/或补偿微实体的运动相关误差。例如，可使用利用这些检测和感测技术中的一个或多个获得的信号或测量结果来开发用于微实体的运动相关误差的模型，并且可以使用随后的信号或测量结果来确定补偿运动相关误差的校正量。
液滴细胞分选器可被配置为作为空气中感测（sense-in-air，SIA）设备操作。在这样的系统中，至少一个激励激光器束被聚焦到流220上，该流220包括流动鞘层流和传送微实体（以单个纵列对准）的内部芯流。该流被定位为，使得该相交在一个或多个光采集系统的焦点处进行。共同的焦点经常被称为询问点。如图2所示，沿流220可以空间分离地具有多个激光系统和多个询问点。这些询问点中的每一个可具有一个或多个分离的激光束和信号检测设备。可将询问点空间限制在喷嘴202附近的询问区域222中。可使用空间过滤以减小与单个询问点相关的观测区域（还称为视场（FOV）），并减小附近询问点的交叉检测。用于单个询问点的FOV可以在50微米的量级。从而，要求流、激光器焦点、和光学系统的焦点的严格和精确的对准。在一些实施例中，与单个询问点相关的观测区域可限于几十微米。当微实体沿着流行进时，其顺序通过每个询问点。可以从每个询问点测量和记录来自微实体的辐射。这些测量结果在从包含微实体的分段的流分离前是相关的。带电的液滴然后可以通过空气行进到静电板290，其在该静电板290中将被偏转以用于分选。
尽管图2中示出了五个探测束和五个检测器，在一些系统中可使用更少或更多的探测束和更少或更多的检测器。在一些实施例中，可以设置多于一个的检测器用于探测束，并且光学部件可以将光发射分割并引导到多于一个的检测器。在一些情况中，可在检测光学器件中使用光学和/或空间过滤，以分离荧光信号和/或阻挡来自辐射源的辐射。使用五个光源以探测微实体的流式细胞计的一个实例为sy3200TM流式细胞计（可从iCyt Mission Technology of Champaign,Illinois获得）。
例如可以通过数据获取硬件230数字采样地采集来自检测器D1、D2、D3...D5的时间变化信号，并将其存储到存储器240中用于后续通过处理器250的分析，所述数据获取硬件230可通过模拟到数字转换时钟245来定时。在一些实施例中，可将数据直接提供到处理器250用于分析。在一些实施例中，将数据临时存储到存储器240中，例如缓冲器或适当的随机存取装置，并然后通过处理器250读取用于分析。
如从上述对流式细胞计的描述可以理解，来自检测器的数据信号可以是代表横穿辐射束B1、B2、...B5的微实体225的脉冲。每个脉冲可具有峰值高度、宽度和面积。所述脉冲高度、宽度和面积可通过处理器250评估并用于表征每个微实体225。然后可使用评估的特征确定对每个微实体225或包含一个或多个微实体的液滴的后续操作。
尽管可以以周期间隔形成液滴228，微实体225可以以随机间隔分散在流220中。例如，微实体可以在供给到喷嘴202的样本流体中处于稀释悬浮状态。微实体然后可以在随机时间到达喷嘴的开口208。从而，如图2所示，一些液滴可能不包含微实体，一些液滴可包含多于一个的微实体，例如两个、三个或更多。
对细胞分选器的正确操作要求将从每个询问点记录的测量数据与生成数据的每个微实体正确地相关。为正确表征流220中的选定微实体，需要获知来自检测器D1、D2、D3、...D5的什么信号对应于选定的微实体。为了在封入液滴时在选定微实体上正确进行操作（例如分选），需要进一步知道微实体将被封入哪个液滴228中。例如，需要将每个检测信号正确分配给从其产生检测信号的同一微实体（以及将包含微实体的液滴），从而可以确定对该微实体的精确表征。另外，为了流式细胞计实例中的分选目的，需要知道微实体何时到达最后附着的液滴228-0，以在正确的时间对导电探针207施加正确的电势，以便给予包含该微实体的液滴228-0希望的电荷。当适当地带电时，最后附着的液滴将随后分离为自由的液滴并根据其电荷被分选。
作为理解实施为流式细胞计的本发明内容的辅助，现在将描述用于空气中分选流式细胞计的数据处理、操作定时、以及校准方法的细节。然而，所述技术和设备可应用于除流式细胞计以外的系统，在这些系统中，微实体从至少第一位置移动到一个或多个第二位置，并且其中可在移动微实体上进行操作。
II校准
可利用校准颗粒在校准试验中建立系统的数据处理和系统操作的定时，在所述系统中，微实体从第一位置移动到一个或多个其它位置。作为一个实例，可校准液滴细胞分选器使得数据获取系统可将对每个细胞或微实体采集的数据与将承载其（并且可能是其它微实体）离开流并进入采集器皿的具体液滴相关。可在制造设备中执行校准试验或运行，以初始设置系统，以及/或者其可以日常地运行（例如在每次实验之前），以验证系统的操作。可利用高荧光的微实体通过经验观测完成该校准。可通过将液滴分选到用于人工观察的显微镜载片上或通过使用自动检测系统以记录来自液滴的发射来观测分选结果。根据一些实施例，用于校准目的的微实体可包括校准珠，例如荧光标记的聚苯乙烯微珠。在一些实施例中，可使用荧光细胞用于校准目的。可以将校准珠稀释到样本流体中至这样的程度，即，例如，如图3A所示，在任意给定时刻从喷嘴202流出的流220中有两个或更少的珠。
当微实体225或校准珠沿流220行进时，其通过位于流中的询问束B1、B2、...B5，并之后由从流分离的液滴228-1封装。对于多询问点系统，当单个微实体顺序通过每个询问点时，需要把对该单个微实体的多个测量结果（例如如图3B-3F所示的信号）进行相关。相关的数据用于对每个微实体进行分选决定，并影响对包含微实体的液滴的分选。
可在校准进程中把来自多个询问点的信号正确识别为与单个微实体和液滴相关。通过使校准微实体运行通过系统，数据获取系统可被配置为使得，单个微实体通过选定“触发”询问点（例如，具有辐射束B1的第一询问点）触发一个定时序列，该定时序列在期望微实体到达每个其它询问点时精确地“打开”或选择窄数据获取窗口（例如，从每个询问点选择数据流的分段）。为了改善系统处理量（对于细胞分选器较重要），应将这些定时窗口的持续时间保持为尽可能地短。
在现代数字数据获取系统中，通常对来自全部询问点的测量数据缓存模拟到数字转换（ADC）样本。在一些情况中，将数据缓存足够长，以允许从下游询问点发生触发，而不是仅根据来自沿流的第一询问点的触发。换句话说，当缓存数据时，触发询问点可以是这样的点，在该点，在已经在其它询问点生成针对微实体的一个或多个信号后生成触发信号。随后，选定的“触发”询问点可以是系统中的询问点中的任意一个。
根据一些实施例，如果将获知流的速度和到流中的每个询问点的距离以及到断开点226的距离，可以从基于第一辐射束B1的通过事件的计算估计辐射束通过时间和在最后附着液滴的到达。然而，在一些系统中，距离随每天的操作或每次运行的操作而变化，并且没有方便的方法以直接测量距离或流体速度。
在一些实施例中，可通过校准进程确定束横穿的有效传输时间和断开点。作为实例，如图3B所示，横穿第一束B1的荧光校准珠可在时间t0生成荧光信号。在一些实施例中，该信号可用作“触发”信号，其向系统表示将分析并随后处理（例如，分选）的新的微实体的到达。在其它实施例中，并且如上所述，可使用另一个询问点来提供触发信号而不是第一询问点。与该触发信号一起并且对应于触发信号，如图3C-3G所示，可通过导致触发信号的相同微实体生成在近似时间t1、t2、t3、t4、tc发生的一组信号或事件。
通过将多个校准珠运行通过系统，可确定在各个信号和/或事件之间发生的平均时间偏移或传输时间dt1、dt2、dt3、dt4、dtc。当这些时间已知时，然后可以确定哪个信号与启动触发事件的微实体相关。例如，在与时间t0的触发事件隔开的时间dt1、dt2、dt3、dt4的其它检测器数据流中出现正确信号。在处理信号之后，还可以确定在将包含该微实体的液滴上将施加什么电荷值。在一些实施例中，可以处理来自在承载所关注的微实体的流的分段中或附近的其它微实体的信号，以确定对从流分段形成的液滴将施加什么电荷。当已知时间偏移时，系统使用被分析和处理的有效样本来运行，而不是校准珠。
在一些实施例中，当同一微实体通过其它询问束B2、B3、B4、B5时，可能生成或不生成其它信号，例如在时间t1、t2、t3、t4的脉冲。如果荧光微实体对询问点处的激发辐射没有响应，例如如图3E所示，在该询问点可以不生成信号。当微实体在时间tc到达最后附着液滴228-0时可以生成信号。根据一些实施例，当微实体到达最后附着液滴228-0以及对最后附着液滴充电时，可以通过频闪观测仪激发来对该微实体成像。
由于可以数字采样和记录来自询问点的信号，可通过数字数据流（例如来自模拟到数字转换器的数据流）中的一组数字样本表示来自询问点的信号。因此，校准过程可识别，在来自询问点的检测设备的数据流中的哪个数据流分段或观测窗对应于在穿过触发询问点时启动触发事件的微实体。校准过程可配置数据获取系统，以从与相同微实体相关的每个询问点识别数据流中的数据分段的定时或位置。在一些实施例中，可以使用与来自每个检测器的生成数据相关的时间戳，以辅助识别属于每个微实体的脉冲。
从上述讨论可以理解，在出现触发脉冲时系统200要解决两个问题。第一个问题涉及识别来自其它检测器数据流的哪些信号是由生成触发脉冲的相同微实体生成的。如上所述，可通过从校准进程导出的时间偏移dt1、dt2、dt3、dt4、或使用其它合适的内部相关性识别在其它检测器数据流中的正确信号或数据流分段。当正确地识别信号或数据流分段时，可以对诸如分选的随后的操作适当表征微实体。
第二个问题涉及下滴从属关系或确定微实体最后将进入哪个液滴，从而可以对该液滴施加正确的电荷。第二个问题有些针对液滴细胞分选器，但是可以与形成传送微实体的规则隔开的封装的任何系统相关。例如，第二个问题可以涉及这样的微流体系统，其中将交替类型的不融和的流体引入通道，或者其中，周期地将空气泡引入通道，以形成分隔的流体封装。在这样的系统中，可以周期性地形成液滴或封装，并且微实体可以随机地进入流中。
在关于形成液滴和确定下滴从属关系的更详细内容中，可使用如图4A所示的下滴时钟信号401，以生成施加到流式细胞计喷嘴202中的换能器212的周期性换能器信号403（图4B）。如上所述，换能器212对喷嘴和流220中的流体施加声能。另外，可将充电脉冲（如图4C所示）施加到导电探针207，以对最后附着液滴228-0充电。换能器信号可与下滴时钟信号同步或相位锁定。可调节换能器信号的幅度以将断开点226移动到距喷嘴202的选定位置或距离处。充电脉冲可以与下滴时钟相位锁定，并且可以与下滴时钟和/或换能器信号同相或不同相。根据一些实施例，在系统200的实验或校准进程中，没有用于调节充电脉冲与换能器信号和/或下滴时钟之间的相位的可变相位调节。
根据一些实施例，当对最后附着液滴施加不同的分选充电脉冲时，调节到换能器的驱动幅度，以产生纯净（clean）的分选流。通过设置换能器信号幅度以形成纯净的分选流并且将断开点226保持在到喷嘴202近似固定的距离，可以使荧光校准珠或微实体行进通过系统以确定下滴从属关系。在一些校准进程中，可以以低速将校准实体供应通过系统，从而没有数据信号的混乱。通过检测断开区域中的校准实体，可确定对于特定微实体的来自询问点的哪些信号对应于断开区域中的液滴形成和/或液滴充电时间。在一些实施中，该确定可获得dtc的值。一旦进行确定，可以分配微实体的信号到特定液滴的从属关系。
当确定了下滴从属关系，可以对液滴中的一个或多个微实体进行分选决定。可以基于将处于液滴中的一个或多个微实体的信号的相关性进行分选决定。可通过将液滴电荷值分配到液滴实施分选的物理操作。例如，可以将液滴电荷值412分配到液滴。在一些实施例中，施加到液滴的电荷值可以是准离散的。例如，可通过对应于离散分选流的第一量来使各个电荷值分开，而可以调节最终电荷量以考虑更高阶效应，例如与相邻液滴的电容耦合。
在一些实施例中，可按照系统时钟周期数，例如，按照下滴时钟周期数（图4A）或模拟至数字（ADC）时钟周期数（图4D）或两种时钟周期数的组合，计算在校准进程中发现的平均时间偏移dt1、dt2、dt3、dt4、dtc。可通过使用以高于其它时钟的频率运行的系统时钟获得高分辨率的偏移。在流式细胞计中，ADC时钟可以以几十或几百MHz运行，而下滴时钟可以以比这些值慢几个数量级的频率运行。按照ADC时钟周期数计算的延迟值将提供更高的分辨率。在一些实施中，可按照更慢的时钟周期数（例如下滴时钟周期数）来计算长延迟。在一些情况中，可按照较慢和较快的时钟周期数的混合来计算长延迟。例如，如果下滴时钟的周期为Td，ADC时钟的周期为TADC，则可以将延迟计算为
dt=NTd+aTd (1)
其中N为整数，a表示小数：0<a<1。可将值a计算为
a=MTADC/Td (2)
其中M为整数。组合公式1-2获得dt=NTd+MTADC
III.数据获取
如上所述，时间偏移或延迟dt1、dt2、dt3、dt4可用于选择用于观测定时窗310或数据流分段的适当时间，其中期望来自微实体的信号在每个询问点出现并且对于已经启动触发事件（例如，穿过B1处的触发询问点）的相同微实体出现。在观测窗内出现的数据将归属于该微实体，并被处理以确定对该微实体的操作（例如，分选操作）。如上所述，由于可以缓存来自询问点的数据，任意询问点可用作触发点，并且用于单个微实体的观测窗可在触发信号之前和之后出现。
在一些实施例中，观测窗310识别来自检测器D1、D2、...D5的数据流中的时间分段，在所述时间分段，信号将被归属于特定微实体。例如，系统中的检测器D1、D2、...D5的每一个可输出包括通过穿过相应询问束B1、B2、...B5的微实体生成的信号的样本的数据流。例如，如图4D-4F所示，可以以根据模拟到数字转换器时钟的高数据速率获取样本。穿过将用作触发器的选定束（在该实例中为束B1）的微实体，将生成触发信号（例如脉冲），其可被检测并用于识别微实体到达触发器询问点的到达时间。在下面的示出实例中，用于标记到达时间或参考时间t01的触发信号的特征被取为触发脉冲的峰，在其它实施例中可以使用其它值，例如由系统用户选择的上升沿阈值水平、脉冲积分的阈值。触发事件的参考时间t01可与时钟周期数相关，如图4D所示。
通过对微实体建立参考时间t01，并从校准进程获知延迟（例如延迟dt2），可以按照时钟周期数或数据样本确定在数据流中的何处查找移动通过系统的相同微实体的后续事件（例如穿过束B3）。例如，并参考图4D-4F，第一微实体可横穿触发束（在该实例中取为束B1），并在时间t01生成触发脉冲410。触发脉冲410可在来自检测器D1的数据流中被检测。数据流可包括其它微实体的后续触发脉冲412、414。通过获知延迟时间dt2，可以在来自检测器D3的数据流中找到当第一微实体横穿束B3时由其生成的后续信号。后续信号将出现在横跨微实体在束B3处的期望到达时间t21的观测窗310中。观测窗将从触发事件t01偏移对应于延迟时间dt2的多个时钟周期数（在该实例中为ADC时钟周期数）。在该观测窗310中，脉冲422表现为到达得晚，如图4F所示。对应于其它微实体的其它脉冲也出现在图4F的轨迹中。
从检测器D1、D2、...D5接收的数据可被存储在临时数据存储装置中，例如FIFO缓存器中。在一些实施例中，可将数据存储在长期数据存储装置中。由于数据被存储，在操作和处理数据时存在更大的灵活性，因为不需要实时处理。例如，通过数据存储，可以从选定事件在时间上向后和向前查找。根据一些实施例，根据时钟周期数确定观测窗的位置可以变换为根据存储器地址或存储器位置确定数据信号的位置（例如，假设将数据顺序存储在地址空间中或者与观测时间相关联地存储）。时间的延迟值，例如dt2，可被变换为地址空间中的偏移。
在这样的实施方式中，流220中的任何束横穿事件可以用作特定微实体的参考触发事件。例如，针对流中横穿第二束B2的微实体检测的信号可用作触发事件。通过以对应于适当的延迟时间的地址偏移在地址空间中向前和向后查找，可以找到对于相同微实体的其它束横穿的对应数据。
确定数据获取观测窗310的定时或位置确保对于穿过系统的每个微实体正确记录信号（可包括没有信号）。如图3E所示，一些微实体在询问点可以不生成信号，例如，不提供超过背景水平的可测量信号。例如，标记样本中的一些微实体的荧光标签可以对一些询问束敏感而对其它询问束不敏感。在背景噪声水平之上的可识别信号的缺失对于分类或表征微实体可能是重要的。从而，对观测窗310的正确确定可以帮助确定在该询问点或横穿束的微实体的信号的缺失。
IV.运动相关误差
在具有含移动微实体的流的系统中，如流式细胞计，微实体225到达沿流的询问点可能与期望到达时间存在偏差。例如，即使流220的流速可以基本恒定，并且通过校准仔细确定时间偏移dt1、dt2、dt3、dt4，然而对于由微实体启动的触发事件，仍可能存在微实体到达第二询问点和各个询问点或沿流220的位置的不确定性。微实体的到达时间或位置的不确定性可能来源于一种或多种运动相关误差。
移动微实体的运动相关误差可包括任何类型和形式的误差，该误差造成，在给定在第一位置或第一时间检测到微实体的情况下，相同微实体在第二位置或第二时间（或其它位置或其它时间）与期望到达时间（或多个时间）或期望位置（或多个位置）的偏离。移动微实体的运动相关误差可由实际和/或表观的原因导致。实际运动相关误差可包括流中的微实体从期望位置的物理移动，例如，耦合到流的能量在微实体沿流移动时可以扰动或抖动流中的微实体的位置，即使在一些实施例中，流可以没有湍流地流动。表观运动相关误差可包括观测影响，其在没有相应的物理运动时给出微实体的移动。表观运动相关误差的实例可包括但不限于，电子检测影响（例如，可变电子延迟，数字化误差）和光学影响（例如，由于波状流体流导致的可变透镜化影响）。
在流式细胞计领域，与微实体在询问点的到达时间的不确定性相关联的运动相关误差可称为“脉冲抖动”。脉冲抖动提供了商业系统中的移动微实体的运动相关误差的一个实例，并且当在示波器上观察来自微实体的信号脉冲时可以看到。脉冲抖动可由实际和/或表观原因导致。如图4F所示，相对于期望峰值到达时间t21，通过脉冲422的迟到示出脉冲抖动的实例。本发明人已经发现，在不通过换能器212对流220施加周期性能量的情况下下可以观测到脉冲抖动，并且在对流施加周期性能量的情况下，该脉冲抖动明显变得更加显著。在目前商业使用的全部多激光器、SIA细胞分选器中都在一定程度上观测到脉冲抖动。
图5示出脉冲抖动的实例。在图5中，在图中重叠了在相同的下游位置观测的并从上游位置的标称相同的条件触发的来自多个微实体的多个脉冲。图上的脉冲位置的变化反映了在下游位置的到达时间的变化，并表示系统中的运动相关误差。在一些系统中，到达时间的变化可大于几个脉冲长度。图上的脉冲位置的变化反映获知微实体在选定时间的位置的不确定性。
在图3C-3G中，由垂直虚线表示的观测窗310的尺寸被设置为反映在每个询问束位置处的脉冲抖动的量。如上所述，观测窗是其中可以采集数据并将数据归于启动触发脉冲的相同微实体的时间。观测窗随着到喷嘴的距离而尺寸增加，这反映了脉冲抖动随着到喷嘴的距离而增加的观测。更大量的脉冲抖动需要观测窗310的更大的时间跨度。
在各个实施例中，观测窗310的尺寸被设置为，使得由微实体在相应询问点生成的大多数脉冲被捕获并且在观测窗310中可识别。在一些实施例中，观测窗310的尺寸被设置为，使得由微实体在相应询问点生成的脉冲的期望部分在观测窗310中被捕获。在各个实施例中，期望部分可以为在大约0.95和大约1之间、在大约0.90和大约0.95之间、在大约0.8和大约0.90之间、在大约0.7和大约0.8之间、或大约0.6和大约0.7之间。在一些实施中，如果脉冲到达一个位置的时间分布由标准偏差σ表征，则观测窗310的尺寸可以设置为与脉冲的平均宽带wavg成比例的第一值加上与标准偏差成比例的第二值。例如，观测窗的宽度W可通过下面的公式表示：W=cwavg+fσ，其中c是大于0的实数，且f是大于0的实数。如果一项显著大于另一项，实施例可具有通过cwavg或fσ确定的窗口宽度。
可以理解，运动相关误差（例如，流式细胞计中的脉冲抖动）可以对系统操作和处理量施加限制。例如，为了将来自询问点的数据正确归属于正确的微实体，每个观测窗优选不与数据流中的前一个窗口或连续的观测窗显著重叠。在一些情况中，少量的重叠可以接受。在一些实施方式中，观测窗可以没有重叠，并且在各个观测窗之间可能存在缓存或死区时间。保持小重叠或防止观测窗的重叠可对微实体处理速率和/或询问区域222的尺寸施加限制。例如，流220中的微实体必须被足够远地隔开，从而观测结果可以被正确地去卷积并以期望的概率或精度被分配到关注的微实体。在一些实施中，用于连续微实体的窗最小地重叠或者不重叠。可选地，或者另外，询问点必须被限制在喷嘴开口208附近的区域，在该区域中脉冲抖动的量在可接受的限制内。
发现当测量脉冲来自最接近流出开口208的询问点时脉冲抖动最小，并且相应的数据获取窗对于开口附近的询问点可具有最短的持续时间，同时保持期望水平的测量精度。本发明人已经观测到，抖动随着到喷嘴202的距离略微增加。该抖动的增加可对询问区域222的尺寸施加限制。例如，询问区域可被限制为这样的尺寸，使得对于给定处理量，抖动不导致用于给定处理量的观测窗的显著重叠。在一些系统中，脉冲抖动可将总询问区域限制为靠近喷嘴开口208的流的小区域（约1mm或更小）。对询问区域的尺寸的限制可限制可用于系统中的询问束的数目，并且对询问束的数目的限制限制了对微实体的分析。
另外，本发明人已经发现，抖动随着施加到换能器212的驱动信号的幅度增加。该抖动的增加可对驱动换能器的强度施加限制。在一些应用中可能期望以较大的幅度驱动换能器212，因为这通常引起液滴形成的更好的均匀性和稳定性。然而，相关联的脉冲抖动的增加可能阻止以高处理量、更高幅度驱动换能器。
V.表征运动相关误差
进行了一组实验以表征液滴细胞分选器流式细胞计中的运动相关误差，并导出运动相关误差的模型。由于液滴生成基本是周期性的和正弦的（例如，由于施加到换能器212的驱动信号的形式），假设流式细胞计的运动相关误差可以与施加到流220的周期扰动相关，并且包含周期函数的模型可代表系统中的运动相关误差。因此，假设在沿流220的任何位置处的流式细胞计中的脉冲抖动J可以表现出与时间偏移Δtdc或相位φdc的近似正弦相关性，所述时间偏移Δtdc或相位φdc是从下滴时钟周期中的参考或特征点（例如前缘）到检测的“触发”脉冲上的参考点（例如，在脉冲的前沿或后沿上的脉冲峰值或选定阈值）测量的。
为了理解并不限于任何特定理论，该相关性可如下数学表示：
I～Asin(ΔtdcF+θ) (3)
其中A是将确定的幅度，F表示液滴生成频率或下滴时钟的频率，以及θ表示将确定的相位。根据一些实施例，A和θ可在校准进程中对于系统实验地确定。在其它实施例中，A和θ可以在分析和处理有用样本期间通过系统累积数据时现场确定。对于本领域技术人员显而易见的，可以使用其它模型（例如，简单或更高阶的Bessel函数，更高阶三角函数、高斯函数、相同或不同函数的叠加），以表示具有移动微实体的系统中的运动相关误差。还可以认识到，可以存在流式细胞计中的运动相关误差的其它成分，诸如由于移动和波状流导致的在光学检测设备中引入的误差、以及在用于从询问点采集数据的数据获取系统的电子元件中引入的误差。误差的一些其它成分可以或不以相同的模型表示。一些可能需要不同的模型。
根据一个实施例，可在具有移动微实体流的系统上将用于流式细胞计的抖动J测量为从观测窗中的期望到达时间到实际到达时间的时间偏移。可通过如上所述的校准过程建立到流220中的任意位置的期望到达时间（例如，时间t1、t2、t3、t4，参考图3C-3F）和观测窗310。用于选定位置的观测窗可被设置为横跨期望到达时间。实际到达时间可被测量为检测脉冲上的选定参考点的时间。在观测窗中何处出现期望到达时间（例如，开始、中间、结尾）以及在脉冲上使用哪个作为参考点（例如，前沿阈值、峰值、后沿阈值、积分阈值）的选择可以取决于特定实施方式，并且对于运动相关误差的模型开发不重要，只要选定的到达时间和参考点被一直使用。
为了理解应用于流式细胞计的本发明的各个方面，图6A-6B示意示出抖动J和与下滴时钟的时间偏移Δtdc。图6A可表示从触发询问点接收的信号，以及图6B可表示从沿流220的另一个询问点接收的信号。在一些实施例中，两个值都可以按照时钟循环被记录并通过将时钟周期数乘以时钟周期而转换为实际时间。例如，如上文结合公式（1）-（2）所述，可以按照ADC时钟周期数、下滴时钟周期数、或其组合测量时间偏移Δtdc和抖动J。在该实例中，从下滴时钟的上升沿到检测的触发脉冲610的峰值来测量时间偏移Δtdc。从观测窗310的中心的期望到达时间ta到第二检测脉冲620的峰值测量抖动J。在一些实施例中，可由微实体在横穿第一束B3时生成触发脉冲610，且第二检测脉冲620可以是从流220中的另一个询问点检测的脉冲。在一些实施例中，可使用脉冲上的其它参考点、下滴时钟以及观测窗。如果在脉冲抖动与液滴生成之间的假设关系正确，则观测到的多个微实体的抖动J将根据构建的误差模型（例如公式3的模型）而与测量的时间偏移Δtdc相关。
图7A示出对于流式细胞计中的多个微实体记录的作为时间偏移Δtdc或相位φdc的函数的脉冲抖动幅度J的测量结果。图7A所示的抖动数据的图可以称为“抖动图”。利用校准珠在上述sy3200TM系统上进行测量。喷嘴开口直径为70微米，并且流体上的压力为50psi。液滴生成频率为84.9kHz，并且利用离喷嘴最远（离喷嘴大约2mm）的询问束进行抖动测量。获得的抖动图清楚示出在抖动振幅J与触发脉冲定时的偏移Δtdc之间的近似正弦的相关性。
图7B示出在与图7A相同的条件下的抖动测量的结果，但是其中利用距离喷嘴212第二远的询问束进行测量。抖动图示出抖动振幅的变化（在更靠近喷嘴处减小），但抖动图的相位θ没有变化。对于图7A和图7B中的图，已经减去与两个询问点之间的沿流的延迟相关的相位延迟。结果表示，无论是由实际还是表观原因导致，运动相关误差以相同的相位沿流随着微实体行进并增大振幅。
图7C中示出抖动图的相位θ的变化。对于该试验，液滴频率被改变至77.9kHz，并且所有其它条件相同。频率变化导致抖动图相位的变化。当喷嘴212的位置相对用作触发器的询问束的位置变化时，也观测到抖动图相位的变化。当换能器驱动信号的振幅变化时，未观测到在任意询问点的抖动图相位的变化。
当换能器驱动信号的振幅变化时，观测到抖动图的振幅的变化。另外，如上所述，抖动图的振幅的变化与询问束到喷嘴的距离相关。（比较图7A和7B）在距离喷嘴较远的束测量的抖动图的振幅大于在距离喷嘴较近的束测量的抖动图的振幅。
图7A-7C所示的抖动图结果示出，在流式细胞计系统或类似配置的任何系统中存在可以校准或补偿的微实体的运动相关误差的预测或确定分量。例如，如果对触发脉冲测量到距离下滴时钟信号上的特征点的时间偏移Δtdc，则可以从公式3和/或从抖动图的数据计算用于调节微实体到达流220中的另一个位置的到达时间的校正量。所计算的校正量可用于例如当微实体穿过系统时调节用于微实体的每个询问点的观测窗310的定时。这样的调节可用于重新使各个观测定时窗以各个脉冲的期望出现处为中心。关于从询问点传出的数据流，可以使用计算的校正量以调节数据流中的数据分段的位置或存储对应于相同微实体的信号的数据的存储器地址。因为存在脉冲抖动的预测分量，可在系统的数据获取设备中补偿该预测分量。运动相关误差自身不能被物理校正。可以理解，可以在其它系统中进行用于运动相关误差的补偿，在这些其它系统中，存在可以建模的运动相关误差的预测或确定分量，例如，由诸如公式3的数学模型表示。
可对系统进行进一步改善。例如当在系统中校正运动相关误差的主要来源时，更高阶运动误差可以变得可观测。按照这里所述的处理，还可以表征、建模和补偿更高阶误差。
使用上述技术，本发明人还发现，在流式细胞计中存在运动相关误差的第二分量。该运动相关误差的第二分量称为“背景抖动”。通过进行测量以表征误差，发现背景抖动与时间偏移Δtdc和系统的液滴生成器无关。即使关闭系统的液滴生成器260，即在流中不形成液滴228，仍观测到背景抖动。图8A示出在其中关闭液滴生成的流式细胞计中测量的背景抖动的一个实例。对于该测量，使用70微米直径的喷嘴开口，并且鞘层压力为50psi。
尽管背景抖动不具有基于上述时间偏移Δtdc的预测质量，用于表征抖动的测量揭示了，背景抖动的振幅示出了与喷嘴202中的样本流体导管203的居中的相关性。当样本流体导管未在喷嘴中居中时获得图8A的数据。当导管203在喷嘴202中近似居中时，如图8B所示观测到背景抖动的最小值。还观测到，背景抖动在询问点的激光束扫过流220（从左到右）时发生变化。对于图8A和8B，利用用于在打开液滴生成器时测量脉冲抖动的相同的过程在距离喷嘴202最远的询问点测量抖动。因为背景抖动示出与流式细胞计喷嘴中的导管位置的相关性，例如在关闭液滴生成器时对系统中的抖动的测量和表征可以提供关于系统的机械对准的信息，该信息对于改善系统性能是有用的。在一些流式细胞计或微流体系统中，背景抖动可与其它可影响流220的流动动态学的机械特征相关，所述特征例如为，导电探针207的位置、换能器212的位置、插入微流体通道的装置的位置。
在上述情况中，背景抖动被观测到具有与系统的机械对准参数的函数相关性。根据一些实施例，系统可被配置为向系统操作者提供与背景抖动的水平相关的反馈。反馈可以是示出背景抖动量的视觉显示，并响应于系统构件的机械对准近似实时地示出减小或增大。
从上述讨论可以理解，对移动流中的微实体的运动相关误差的测量和表征可用于诊断和改善系统性能。在由共有专利实体同时提交名为“Compensation of Motion-Related Error in a Stream of MovingMicro-Entities”的专利申请中描述了用于补偿运动相关误差的技术，其整体在此引入作为参考。
图9的流程图示出了用于表征移动微实体的流中的运动相关误差的方法1100的一个实施例。图9所示的步骤不必全部包括在用于表征运动相关误差的方法的各个实施例中。一些实施例可以仅包括所示步骤的子集。一些实施例可包括图中未示出而在这里描述的其它步骤。尽管图9中的步骤涉及表征流式细胞计中的脉冲抖动，可以理解，该方法包括用于表征其它系统中的运动相关误差的等同实施例，所述其它系统诸如为微流体系统和微加工系统。
根据一个实施例，用于表征运动相关误差的方法1100可包括启动1105系统，在该系统中微实体从第一位置移动到第二位置或一个或多个其它位置。系统可以是流式细胞计、微流体系统或被配置为对移动微实体进行测量和/或操作的任何系统。根据一些实施例，系统可以是其中在流体流中形成微结构的系统，例如，在Doyle等人的美国专利申请公开No.2010/0172898中描述的系统。该方法可包括初始化1110系统的步骤。初始化动作可包括验证和/或设置系统的运行参数，例如，设置移动微实体的速度。在流式细胞计中，初始化步骤1110的动作可包括对上述信号相关性和下滴从属关系进行校准。
方法1100还可以包括测量1120运动相关误差，诸如脉冲抖动数据。测量的运动相关误差可表示实际到达时间相对于期望到达时间的偏差或变化。微实体到达选定位置的期望到达时间可基于由微实体在触发位置导致的单独的检测事件（例如，触发事件）。可基于其它因素，例如微实体的平均速度或在“触发”位置与测量位置之间的平均传输时间，相对于期望到达时间评估实际到达时间的偏差。除了测量实际到达时间的偏差之外，测量1120运动相关误差的动作可包括测量触发事件的方面（例如，关于系统度量，诸如系统参考信号，或系统时钟，脉冲分布、距离或波长，测量触发事件的发生）。在液滴细胞分选流式细胞计中，触发事件的方面可以是其相对于用于对液滴的形成定时的下滴时钟的参考点（例如上升沿）的发生时间。在其它实施例中，可相对于将能量耦合到传送微实体的流中的定时测量触发事件的定时。在一些实施例中，系统度量可包括感测的值，例如流的温度、流体的压力、流的瞬时速度、外部声学水平、对系统构件测量的加速度值。
继续流式细胞计的实例，测量1120运动相关误差可包括测量每个脉冲的下列值：当脉冲到达选定触发通道时的下滴时钟相位（或距离下滴时钟上的参考点的时间偏移）、以及对于选定询问点或与询问点相关的检测通道在期望到达时间和实际到达时间之间的时间偏移。可以存储采集的数据以用于在处理1100中的下一阶段的处理。
可以存在几个可能的实施例，其中在选定触发通道测量脉冲到达时间。一种方法为测量每个脉冲的峰值位置。另一个实施例为测量脉冲的上升边沿通过选定阈值的点。另一个实施例包括测量脉冲的积分（即脉冲下的面积）通过选定阈值的点。
在一些实施例中，可在误差校准和表征进程中获取运动相关误差数据（诸如抖动图数据）。在一些实施方式中，可在液滴延迟校准进行之后执行误差校准和表征。在其它实施例中，在其中正分析微实体的实验中，可以现场获取运动相关误差数据。当现场采集运动相关误差数据时，误差表征和补偿可以是动态进程，其中基于观测数据周期地更新误差模型。因此，误差表征和补偿可以随时间变化以反映采集的误差数据中的任何变化。在一些实施例中，使用贝叶斯先验对于构建初始误差模型并在给定系统中的运动相关误差的进一步观测值时支持误差模型的更新是有用的。
在一些实施例中，对于流220中的任意询问点表征运动相关误差包括确定1130在选定询问点的运动相关误差E与可决定误差的可测量系统质量之间的关系。一旦测量了误差数据，可处理该数据以确定1130运动相关误差E与如上所述的用于流式细胞计的可测量系统变量（例如相对于系统参考信号的触发事件的偏移（Δtdc或φdc））之间的关系。在一些实施例中，可通过误差校准和表征测量，例如如上文结合图7A-7C所述的测量，经验地确定E与Δtdc或φdc之间的关系。校准珠或荧光细胞可运行通过系统以对于每个询问点获得如同图7A-7C的抖动图。在一些实施中，该关系可通过函数建模，例如识别适合测量的数据的函数。
可以对移动微实体流中的每个关注点确定1130运动相关误差E与可测量系统变量之间的关系。关注点可以是流中对微实体进行测量或对微实体进行操作的位置。在一些实施例中，可以关注点或关注位置进行多于一个的测量。例如，在流式细胞计中，对于单个询问点可以有几个检测通道。由于在一些情况中系统中的每个检测通道可表现出不同的误差（例如，不同量的脉冲抖动），可以对每个通道确定运动相关误差E与可测系统变量之间的关系。
方法1100可包括确定1140是否已经对于每个关注点评估运动相关误差E与可测量系统变量（例如，Δtdc）之间的关系的动作，所述关注点例如为流中的各个询问点和与各个询问点相关的各个检测通道。在一些情况中，可能每个询问点具有多于一个的检测通道，并且方法1100可包括确定1140是否已经对每个检测通道评估运动相关误差E与可测量系统变量之间的关系的动作。如果未对流中的每个关注点和/或检测通道评估运动相关误差E与可测量系统变量之间的关系，则方法流程可返回到对流中的下一个关注点和/或检测通道测量1120运动相关误差的步骤。对于其中内插一个或多个关注点的数据的实施例，方法流程可返回到如图9中虚线箭头所示确定1130运动相关误差E与可测量系统变量之间的关系的步骤。可通过测量端点之间的内插技术确定误差补偿值。如果已经对流中的每个关注点和/或检测通道评估运动相关误差E与可测量系统变量之间的关系，则方法流程可前进到计算1150可用于表征和补偿运动相关误差的校正值的动作。
根据一些实施例，计算1150校正值包括进行对测量的误差数据的曲线拟合。可以在或不在一个或多个图上绘制测量的误差数据。可将例如公式3中的周期函数的一个或多个函数拟合到每个图或其相应数据，可在每个询问点使用所获得的拟合函数，以补偿在随后的实验进程中的运动相关误差。通过确定拟合函数的参数（例如，振幅、相位、延迟、系数），可以对每个接收的脉冲根据分析函数计算表征和补偿值。
可选地，可以将每个询问点的运动相关误差数据编制并存储到查找表（LUT）中，该查找表可用于每个询问点在后续实验进程中补偿脉冲抖动。在一些实施例中，计算1150校正值可包括，生成各个值的查找表，其中LUT的每个元素对应于触发相位或延迟分段（bin）,并且从用于相位或延迟分段的运动相关误差数据确定每个元素的值。用于确定LUT中的每个元素的值的可能方法包括但不限于，对该分段计算运动相关误差数据的平均值、中值及模式。对该阶段的可选补充为跟踪残差，并使其趋于零平均值。在一些实施例中，这可以通过重新计算标称偏移以使得LUT中的值为零平均值而完成。这可以通过计算测量数据的平均值、将其从数据减去，以及将其增加到标称偏移而完成。在其它实施例中，增加标称偏移的一部分，例如所述偏移的1/2，以获得到零平均值的收敛。
在一些实施例中，所计算的LUT值的数目可受到限制，其中每个LUT值可跨越一定范围的运动相关误差条件。继续流式细胞计的上述实例，计算的LUT值可限于离散的触发时间或相位偏移分段，例如，如图13所示，36个分段每个分段跨越约10度的触发相位偏移值。从而，任何落入10度分段中的测量的触发偏移相位将接收相同的平均值。可以理解，在一些实施例中可以用时间表达触发偏移，例如，相对于下滴时钟信号上的参考点的时间延迟（Δtdc），或者可以用相位φdc表达，例如下滴时钟循环的相位。
在一些实施例中，当编制LUT时可使用内插技术。例如，可进行测量以确定对应如上所述的10度分段增量的LUT值。然后可通过处理器250基于线性或更高阶内插计算内插的LUT值。在一些实施例中，可在现场可编程门阵列中执行内插。然后可以将测量和内插的LUT值存储到LUT数据存储器中用于后续使用。
在一些实施例中，可以在正常系统操作期间，例如，在细胞分选运行期间，现场执行计算1150校正值的动作，或者在其它实施例中，其可以在正常操作之前（例如，在校准运行期间）执行。作为一个实例，可使用测量的触发偏移以从现场的函数拟合计算校正值。在上述流式细胞计的情况中，计算1150校正值的动作可包括计算可用于偏移时间观测窗310的偏移时间，所述时间观测窗310用于从每个询问点获取脉冲数据。计算的时间偏移可基于运动相关误差测量数据，并且可以使得计算的偏移时间补偿在选定位置测量的运动相关误差的平均量。计算的校正值可用于补偿测量的误差并然后弃用，或可以被存储到查找表中并后续根据测量的触发偏移进行访问以补偿运动相关误差。
在一些实施中，可以实时地，例如，在其中分析微实体的正常分选进程期间，进行测量1120运动相关误差数据和确定1130运动相关误差E与可测量系统变量之间的关系的动作。实时获取的运动相关误差数据可被处理并在系统运行时用于计算误差补偿值。在一些实施例中，计算的值可以被随后用于补偿运动相关误差。在这样的实施方式中，用于测量和表征运动相关误差的单独校准进程不是必需的，可以在正常进程期间实时更新先前计算的任何运动相关误差补偿数据。在一些实施例中，使用贝叶斯统计可提供用于实时更新用于系统的误差模型的有效架构。
在一些实施例中，可以对每个关注点或关注位置和/或每个检测通道执行以下动作：测量1120运动相关误差数据、确定1130误差E与可测量系统变量之间的关系、以及计算1150校正值。可以单独地处理测量的数据。例如，可以将来自每个测量的数据拟合为函数形式、或编制到专用于对应于测量的数据的位置和/或通道的查找表中。
如上所述，当缓存来自询问点的数据时，流中的询问点的任一个询问点可以用作触发询问点。因此，系统可被配置为基于一个触发询问点（例如，自流式细胞计喷嘴沿流遇到的第一个询问点）确定校正值，以及随后改变操作以使用另一个询问点（例如，第二个询问点）作为触发询问点。在一些实施例中，可以不需要在系统上执行重新校准过程以确定新的触发询问点的校正值。而是，可以数学变换存储的校正值、函数拟合、或LUT以反映触发询问点中的变化。根据流式细胞计的一个实施例，如果校正值被实现为由在颗粒横穿触发点时确定的相位或时间偏移指示的LUT时，并且触发询问点从沿流的第一个询问点变化到沿流的第二个点，则可以应用下面的数学变换：首先，从基于每个分段的询问点LUT的每一个减去用于第二询问点的初始LUT值。对于第二询问点，这从其自身减去初始LUT值，而对于新的询问点正确地剩下LUT中的零值。第二，用于其它询问点的新LUT的每个必须被循环地（circularly）偏移多个分段，所偏移的多个分段等于第一和第二询问点之间的相位差（其对于当前下滴时钟频率和流速率被确定）。
由于可以对选定询问点使用多个数据获取通道，并且全部这些通道具有基本相等的运动相关误差特征，可以有利于使横穿这些共用通道的脉冲抖动测量数据一致。一个实施例包括选择位于询问点的共用通道中的一个（例如，对于检测的微实体具有最佳信噪比的通道），以用于确定运动相关误差值。根据另一个实施例，在计算校正值之前可组合对于位于询问点的全部通道测量的全部运动相关误差数据。另一个方法包括，对每个通道计算指示校正值适合测量数据的程度的量度，并从具有最佳量度的通道选择校正值。例如，量度可使用均方误差（MSE）或均方根误差（RMSE）算法，或者可以计算总残差。
在一些实施中，确定1130运动相关误差E与可测量系统变量之间的关系和/或计算1150校正值可包括测量第一询问点和第二询问点处的运动相关误差数据。在第一和第二询问点之间可存在一个或多个询问点。根据一些实施例，可从对于第一和第二询问点测量的数据内插用于第一与第二询问点之间的一个或多个询问点的数据。内插可符合线性模型、非线性模型、或选定函数形式。用于每个点的数据，无论测量的或内插的，可被拟合为函数形式，或可被编制到专用于每个询问点的查找表中。
在系统硬件和/或软件方面，参考图2，可通过组合一个或多个处理器250、数据获取装置230和存储器240实施运动相关误差表征和补偿。根据一个实施例，可通过调节数据获取窗的定时实施运动相关误差表征和补偿，所述数据获取窗在检测和处理触发事件之后由数据获取装置230打开用于检测脉冲。处理器250可识别触发事件，例如来自检测器D1的脉冲，并将触发脉冲上的参考点（例如前沿阈值）与下滴时钟上的参考点（例如上升沿）比较。基于这两个事件之间的时间差，处理器250可调节通过数据获取装置230打开的观测窗的定时，以接收来自其它询问点检测器D2、D3、D4、D5的脉冲数据。观测窗可以在时间上提前或延迟。
根据另一个实施例，从询问点检测器接收的全部数据可以临时存储到存储器240中，例如FIFO或环形缓存器中。处理器250可被配置为基于触发事件相对于下滴时钟的定时，例如基于时间偏移Δtdc或下滴时钟相位φdc的测量值，从每个检测器数据流中选择数据分段。
如上所述，对于流式细胞计，抖动图存在依赖于一定系统条件的方面。抖动图的振幅可取决于从液滴换能器212耦合到流220中的能量的振幅或量和从喷嘴或换能器到询问点的距离。抖动图的相位可取决于下滴驱动信号的频率以及触发询问点到喷嘴的距离。从而，如果下滴驱动信号的振幅、下滴驱动信号的频率、以及/或者询问点到喷嘴的距离改变，则系统可能需要被重新校准以获得用于运动相关误差的更新的模型。在配置用于现场误差数据采集、表征和补偿的系统中，可连续更新表征和补偿值，从而系统跟踪下滴驱动信号的振幅、下滴驱动信号的频率、以及/或者询问点到喷嘴的距离的变化，从而可以不需要单独的误差重新校准进程。
表征和补偿运动相关误差具有用于具有移动微实体流的系统的几个有利方面。表征运动相关误差可通过使用补偿技术对误差建模并减小误差。在数据分析中补偿运动相关误差可减小位于任何询问点的观测窗310的宽度。减小观测窗可以允许对流中具有更近间隔的微实体进行检测、测量和分选，从而允许系统的更高处理量。
与在流式细胞计中表征和补偿运动相关误差（例如脉冲抖动）相关的一个益处涉及用于检测微实体的检测设备。因为可以补偿流式细胞计中的脉冲抖动，在系统中可以容许更大量的脉冲抖动。因此，询问点可以在流中隔开较远。在一些实施例中，询问区域可以在2毫米上延伸。增大的询问点间隔减少了来自每个询问点的信号的串扰，从而改善了每个询问点的信噪比。
表征和补偿运动相关误差还可以改善在对于每个微实体确定下滴从属关系中的精确度，因为更好地确定了在流220的将形成液滴的分段中微实体的位置距离中心位置的偏差。较窄的观测窗可以允许用于在流的将形成液滴的分段内确定微实体的位置的更精细的分辨率。以更精细的分辨率获知分段内的微实体的位置改善了对下滴从属关系的确定。对下滴从属关系的更精确的确定可以改善分选质量，例如，分选纯度。
还可以通过两个或多个的更好的分辨率改善分选纯度。一些将形成液滴的流分段可以承载一个以上的微实体。较窄的观测窗可允许更清晰地分辨两个或多个，例如，指示液滴中存在多于一个的微实体，而之前的系统仅可以指示一个实体。较窄观测窗还可以允许更好地确定，如果微实体在将形成的两个液滴之间的流分段边界附近，微实体最终进入哪个液滴。
如上所述，运动相关误差表征和补偿可以允许更大的询问区域222。例如，不能容许在距离喷嘴较大距离（例如大于约1mm，大于约1.5mm）处出现大量脉冲抖动的流式细胞计可以使用抖动表征和补偿技术以减小脉冲抖动的不希望的影响。更大的观测区域可允许使用额外的询问束以用于对微实体的更复杂的分析。
VI.对移动微实体流的调制
在上述流式细胞计实施例中，将声能量耦合到传送微实体的流以形成液滴，从而可以将微实体包含在可根据施加的电荷分选的液滴中。根据规则周期性循环将声能耦合到流220，但是微实体在随机时间到达流220中。将周期性声能施加到流有助于控制随机到达流中的各个微实体，例如有助于识别并分选每个微实体。尽管耦合声能对于流式细胞计以脉冲抖动的形式将一定量的运动相关误差引入系统中，该误差具有确定性质，例如如图7A-7C所示，这允许补偿误差以允许对微实体的更精确的分析和更高的系统处理量。
可以存在其它技术领域，其中对移动微实体流施加声能可以有利于微实体分析和控制。例如，在可以用于分析或制造微实体的微流体系统中，可将周期性声能耦合到微实体移动通过的通道中。尽管微实体可以随机到达通道中，上述周期性声能和误差表征和补偿技术可以用于更好地确定通道中的各个微实体的位置、或者在对微实体进行操作的选定位置的时间。更精确地获知微实体在通道中的位置或者微实体到达选定位置的到达时间可以改善微流体系统的分析和/或分选操作。在一些实施例中，可通过位于微流体芯片上的集成声学换能器将声能耦合到通道中。
在一些实施例中，耦合到移动微实体流的声能可改善对微实体的成像。例如，系统可被配置为利用时间延迟集成（TDI）多像素成像器件成像在流中流动的微实体。在D.Basiji等人的美国专利No.6,608,680中描述了TDI成像的一个实例，其在此引入作为参考。更精确地获知在流中移动的微实体的连续位置允许更好地对准由移动微实体形成的连续图像。更好地对准连续图像可用于减小图像噪声并改善图像分辨率。
VII.实例
通过说明，并且不限于任何特定实施方式，在下面的实例中描述了检测流式细胞计中的补偿脉冲抖动的实例。
实例1
在该实例中，液滴细胞分选器由称为反射采集光学元件-5（RCO-5）的光采集光学元件构成，其允许探测沿流220的五个询问点并从其采集光。（可从以下地址获得RCO-5，iCyt MissionTechnology，2100South Oak Street,Champaign,IL61820,USA）。RCO-5允许各询问点之间的各种间隔距离。在该实例中，细胞将从顶部询问点（＃1）行进到底部询问点（＃5）的路径长度（垂直距离）为2mm。通过具有70、100和126微米的开口直径的液滴细胞分选器喷嘴和从10m/s到40m/s的各个流速度测试RCO-5。通过使用来自iCyt反射系统的数据获取系统（产品BW-5）（可从以下地址获得，iCytMission Technology,2100South Oak Street,Champaign,IL61820,USA）测量脉冲抖动。该数据获取系统以105MHZ数字地采样通过细胞分选器的检测器（Hamamatsu光电倍增管（PMT），具有45MHz的带宽）产生的模拟信号。通过对于在询问点＃2产生的信号和在询问点＃5的来自相同微实体的信号测量10％峰值高度的脉冲前沿的交叉点之间的Δt评估脉冲抖动。全部5个询问点在喷嘴开口208的大约2mm内。液滴直到距离喷嘴开口大约6mm处从流分离。
当液滴生成器未启动时（即，流未分离为液滴而进入废液器皿），观测到抖动小于100ns。当启动液滴生成器时，对于每个操作点记录各种抖动量（鞘层压力、液滴频率、液滴换能器驱动强度的组合）。观察到的脉冲抖动的最高值为3微妙的总变化（或脉冲的平均宽带的大约三倍）。
还进行了以下观测：（1）没有液滴生成时（即，只有流动流），任意两个点的Δt几乎恒定；（2）当开始液滴生成时，在第一与最后（间隔最远的）询问点之间观测到显著的Δt的变化，其在一些情况中可以是4个脉冲长度；（3）脉冲抖动的量或剧烈程度随着液滴换能器驱动振幅的增大而增大；以及（4）当液滴断开点移为更接近喷嘴的出口时，脉冲抖动的量或剧烈程度增加。
实例2
在该实例中使用样机台式细胞分选器。该仪器由以下部件构成：Bittware数据获取系统、100微米直径喷嘴、24psi流体压力、40KHz液滴生成、以及在以下波长发光的多个询问激光器：488nm、640nm、405nm以及561nm。
开发的测试软件基于iCyt sy3200TM细胞分选器（可从以下地址获得：iCyt Mission Technology,2100South Oak Street,Champaign,IL61820,USA）的测试软件，其将提供两个附加的数据特征（相比于仪器软件的公布版本）。这两个附加数据特征为：
x-时间偏移，105MHz分辨率，对于每个检测器脉冲从数据获取窗的前沿到脉冲前沿上的选定阈值。
y-时间偏移，105MHz分辨率，对于每个检测器脉冲从最后下滴时钟前沿到脉冲宽度阈值交点的前沿。
对于该实验，细胞分选器首先被校准以具有零分选相位设置。这通过使用仪器自动分选校准系统校验并通过将360个微实体分选到显微镜载片（人工计数）上（典型现有技术人工校准方法）而确定。然后在实验中通过下列方式调节分选校准相位设置：基于通过液滴成像系统对于以前建立的对部分液滴波长的参考点的观察而调节喷嘴高度。
通过该相位=0校准，期望上述参数y将基本为将变为自由液滴的流分段（即，未来的液滴）中的细胞的相对位置偏移。这是因为，零相位校准将下滴时钟的定时与液滴形成对准。从而，液滴延迟恰好是整数个液滴周期，没有增加周期的小数部分。
上述参数x基本为对抖动J的直接测量。如果该偏移是恒定的，则没有抖动。窗口定时被设置为从询问点＃2生成触发。通过关闭液滴生成器（基本没有脉冲抖动）设置询问点＃3－＃5的获取窗。调节定时和窗口宽度，使得没有抖动的脉冲在窗口中心，该窗口在脉冲前和后大约±3微秒。当开启液滴生成器时，观测每个获取窗，以确保在窗边界内获得最大脉冲抖动。
假设在测量的参数x和y之间存在强相关性。该相关性假设近似为
其中A表示振幅，F是液滴生成频率，φ表示将确定的相位偏移，以及Φ表示流式细胞计的分选相位。
图10A-10D示出对于各个分选相位在询问点＃5处对x和y测量的数据。该关系表现为周期的和近似正弦的。测量的脉冲抖动vs.下滴时钟的时间偏移或相位的分散图被称为“抖动图”。
图11A-11C示出在每个询问点＃3－＃5观测到抖动。在一些系统中，认为在喷嘴附近的点，诸如询问点＃3是“无抖动的”。然而，图11A-11C中的结果示出在全部询问点中存在抖动。还观测到，虽然抖动图的振幅随着到喷嘴的距离增加，但抖动图的相对相位对于每个询问点保持相同。
实例3
在流式细胞计系统上进行其它实验以确定对于给定操作点如何在询问点之间比较抖动图，以及抖动图对于各个操作点如何变化。对于这些实验，从询问点＃2触发数据获取，并且对询问点＃3-#5采集数据。
在图12中的抖动图的阵列中示出用于各个操作条件的代表数据。在垂直方向，对询问点＃3-#5绘制抖动，其中询问点＃3的数据在每列的顶部，询问点＃5的数据在每列的底部。自左侧起的前两列处于下滴时钟频率F=54.2kHz。下两列处于F=60.2kHz。在每列顶部示出实际分选延迟相位设置（利用仪器的分选校准特征设置）。通过实际微实体分选校验在全部情况中的分选校准。抖动图相对相位对于沿流的每个询问点保持相同。抖动图相对相位随着分选延迟相位中的变化以及液滴频率而变化。使用70微米喷嘴开口用于测量，并且流体压力为30psi。
观测到，对于每个操作点，沿流的每个询问点的抖动图具有相同的相对相位。振幅或最大抖动变化（上述公式3中的A）在更远的询问点处增大（例如，当微实体移动到距离喷嘴更远且更接近液滴断开点时增大）。当液滴生成器换能器驱动的强度增大（将液滴断开点移动到更靠近喷嘴），A增大，但是抖动图的相位保持相同。还从实验测量发现，对于给定系统操作点，抖动图是高度可再现的。在选定操作点和分选相位校准，抖动相位图表现出可再现的相位。
对在实验室实验中采集的数据进行分析，以确定正弦函数适合数据的程度。图13示出了这些分析的结果。在图13中，示出用于从距离喷嘴最远的询问点（询问点＃5）获得的测量的抖动图。记录数据把测量抖动（纳秒）表示为相对于下滴时钟信号上的参考点的触发脉冲偏移（以相位表示）的函数。图中所示为适配数据的最小二乘正弦曲线（黑线）和来自查找表计算的分段平均值（白色圆形）。在该实例中，通过各个离散相位角分段中的抖动数据的平均值计算LUT值。每个相位角度分段跨越大约10度。尽管拟合函数和LUT值都良好地表示测量的数据，LUT值可以更精确地表征抖动。例如，LUT值反映了抖动数据中的更高阶的影响，其在抖动图的最大和最小值附近更清楚可视。
VIII.结论
在本申请中引用的全部文献和类似材料，包括但不限于，专利、专利申请、文章、书、专著和网页，无关于这些文献和类似材料的格式，其整体在此详细引入作为参考。在一个或多个引入的文献和类似材料与本申请不同或矛盾的情况中，包括但不限于定义的术语、术语使用、描述的技术等，以本申请为主。
这里所用的章节标题仅为了有条理性，而不应理解为以任何方式限制所述主题。
尽管结合了各个实施例和实例描述了本发明，本发明不限于这些实施例或实例。相反，如本领域技术人员可以理解，本发明包括各种替换、修改和等同物。
尽管在本文已经描述和示出了本发明各个实施例，本领域普通技术人员容易想到用于进行这里所述的功能和/获得结果和/或一个或多个优点的多种其它方法和/或结构，并且认为该变化和/或修改的每个落入这里所述的本发明实施例的范围内。更通常地，本领域技术人员容易理解，这里所述的全部参数、尺寸、材料和配置都是示例的，实际参数、尺寸、测量和/或配置将取决于具体应用或者使用本发明技术的应用。本领域技术人员可以仅利用常规实验而了解或者能够确定这里所述的具体本发明实施例的多个等同物。从而，可以理解，前述实施例仅以示例的方式示出，在所附权利要求及其等同物的范围内，本发明实施例可以以不同于具体描述和要求的方式实施。本发明的新颖实施例涉及这里所述的每个单独特征、系统、物件、材料、套装、系统升级和/或方法。另外，如果所述特征、系统、物件、材料、套装、系统升级和/或方法不是相互一致的，两个或多个所述特征、系统、物件、材料、套装和/或方法中的任意组合被包括在本发明范围内。
本发明的上述实施例可以以多种方法中的任一方法实现。例如，一些实施例可以利用硬件、软件或其组合实现。当实施例的任何方面至少部分地以软件实现时，可以在任意合适的处理器或处理器的集合上执行软件代码，所述处理器或者被设置在单个计算机中或者分布在多个计算机中。
在这方面，本发明各方面，例如，分析检测脉冲、校准和补偿脉冲抖动，可以指示部分地实施和/或实现为以一个或多个程序编码的计算机可读存储介质（或多个计算机可读存储介质）（例如，计算机存储器，一个或多个软盘、压缩盘、光盘、磁带、闪存、现场可编程门阵列（FPGA）中的电路配置或其它半导体器件、或其它有形计算机存储介质或非瞬时介质），所述程序当在一个或多个计算机或其它处理器上执行时进行实现上述技术的各个实施例的方法。计算机可读介质可以是可输运的，从而可以将其上存储的程序或多个程序装载到一个或多个不同的计算机或其它处理器上，以实现上述本发明的各个方面。作为一个实例，在一些实施例中，可以在FPGA中完整或至少部分地实现对数据的处理和系统操作。
这里所用的术语“程序”或“软件”概括地表示任何类型的计算机代码或计算机可执行指令集，其可被用于编程计算机或其它处理器以如上所述实现本发明各个方面。另外，可以理解，根据该实施例的一个方面，在执行时进行本发明方法的一个或多个计算机程序不需要位于单个计算机或处理器上，而是可以以模块方式分布于多个不同计算机或处理器中以实施本发明的各个方面。
计算机可执行指令可以为多种形式，诸如通过一个或多个计算机或其它装置执行的程序模块。通常，程序模块包括进行特定任何或实现特定抽象数据类型的路线、程序、对象、组成、数据结构等。通常，程序模块的功能性可根据需要组合或分布于各个实施例中。
另外，这里所述的技术可实现为已经提供其至少一个实例的方法。作为该方法的部分进行的步骤可以以任何方式排序。因此，实施例可以以不同于所示顺序的顺序进行的步骤构成，其中可包括同时进行即使在所述实施例中示出为顺序步骤的一些步骤。
这里定义和使用的全部定义应理解为在词汇定义上控制引入作为参考的文献中的定义和/或定义术语的普通意义。
说明书和权利要求中使用的不定冠词“一”和“一个”除非明确地相反的指出，应理解为表示“至少一个”。
说明书和权利要求中所用的短语“和/或”应理解为表示结合的元件的“任一个或同时二者”，即在一些情况中结合出现、在其它情况中不一起出现的元件。以“和/或”列出的多个元件应以相同的方式构成，即“一个或多个”这样结合的元件。除了由“和/或”短句具体识别的元件之外的其它元件可以可选地出现，无论其与这些具体识别的元件是否相关。从而，作阿非限制性实例，结合开放性表述（诸如“包括”）的表示“A和/或B”在一个实施例中可以仅指A（可选地包括除B之外的元件）；在另一个实施例中，仅指B（可选地包括除A以外的元件）；在另一个实施例中，指A和B（可选地包括其它元件）；等。
在说明书和权利要求中，所用的“或者”应理解为具有与上述“和/或”相同的意思。例如，当在列表中分开项目，“或者”或“和/或”应理解为包括的，即，在多个元件或其列表中，包括至少一个，还包括一个以上，并可选地包括其它未列出的项目。仅清楚指出相反意思的术语，诸如“仅一个”或“恰好一个”，或者，在权利要求中使用的，“由...构成”将表示包括多个元件或元件列表中的仅仅一个元件。通常，这里所用的术语“或者”在由诸如“任一个”、“之一”、“仅一个”或者“恰好一个”的排他性术语在前限定时仅应解释为指示排他的可选项（即，“一个或另一个，但不是同时二者”）。当在权利要求中使用时，“基本由...构成”应具有如在专利法的领域中使用的普通意思。
在说明书和权利要求中，在指示一个或多个元件的列表中使用的短语“至少一个”应理解为表示选自元件列表中的任何一个或多个元件的至少一个元件，而不一定包括在元件列表中具体列出的每个元件的至少一个，并且不排除元件列表中的元件的任意组合。该定义还允许，还可以可选地存在除了在短语“至少一个”表示的元件列表中具体识别的元件之外的元件，无论其与所述具体识别的元件是否相关。从而，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”（或，等同地，“A或B的至少一个”，或，等同地，“A和/或B的至少一个”）在一个实施例中可以指至少一个，可选地包括多于一个的A，而不存在B（并可选地包括除B之外的元件）；在另一个实施例中，可以指至少一个，可选地包括多于一个的A，和至少一个，可选地包括多于一个的B（并可选地包括其它元件），等。
在权利要求以及上述说明书中，所有的过渡短语，诸如“包括”、“包含”、“承载”、“具有”、“含有”、“涉及”、“保存”、“由...组成”等应理解为开放性的，即表示包括但不限于。如美国专利局专利审查手册第2111.03部分中所述，仅仅过渡短语“由...构成”和“主要由...构成”应分别为闭合或半闭合型的过渡短语。
权利要求不应理解为限于所述顺序或要素，除非陈述该影响。应理解，在不偏离所附权利要求的精神和范围下，本领域技术人员可以进行形式和内容上的各种变化。在此要求落入下面的权利要求及其等同物的精神和范围内的全部实施例。
Claims (22)
1.一种用于在第一位置与一个或多个其它位置之间移动微实体的系统，该系统包括：
用于至少在第一位置检测微实体的存在的检测设备；以及
一个或多个处理器，该处理器被配置为：
针对多个微实体的每一个，接收指示到达第一位置处的第一到达时间的第一信号；
针对多个微实体的每一个，测量相应延迟时间，其中在第一到达时间与由系统提供的参考信号之间测量该相应延迟时间；
针对来自一个或多个其它位置的每一个其它位置的多个微实体的每一个，接收指示在所述一个或多个其它位置的每一个其它位置处的一个或多个相应其它到达时间的其它信号；
针对多个微实体的每一个，测量在所述一个或多个其它位置的每一个其他位置处，每个相应其它到达时间与相应的期望到达时间的相应偏差；以及
与测量的相应偏差相关地存储所测量的相应延迟时间。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述系统为微流体系统，并且微实体在微流体流中从第一位置移动到所述一个或多个其它位置。
3.根据权利要求1所述的系统，其中所述系统为流式细胞计，并且微实体在流体流中从第一位置移动到所述一个或多个其它位置。
4.根据权利要求3的系统，还包括下滴时钟，所述下滴时钟用于对流式细胞计中液滴的形成计时，并且其中从下滴时钟导出参考信号。
5.根据权利要求1的系统，还包括能量耦合器，所述能量耦合器用于将能量耦合到在第一位置与所述一个或多个其它位置之间传送微实体的流，其中所述参考信号包括提供给能量耦合器的周期性信号的特征。
6.根据权利要求1所述的系统，还包括：
一个或多个光源，被配置为在第一位置和所述一个或多个其它位置探测微实体；
一个或多个光学检测器，被配置为从探测的微实体接收光学信号；以及
电子元件，被配置为向一个或多个处理器提供代表接收的光学信号的电信号。
7.一种用于表征与在系统中的第一位置与第二位置之间移动的微实体相关联的运动相关误差的方法，该方法包括：
通过第一检测设备针对一个或多个微实体的每一个检测到达第一位置处的第一到达时间；
通过一个或多个处理器，针对所述一个或多个微实体的每一个，测量相应延迟时间，其中在第一到达时间和系统提供的参考信号之间测量每个相应延迟时间；
通过第二检测设备，针对所述一个或多个微实体的每一个，检测到达第二位置处的相应的第二到达时间；
通过一个或多个处理器测量每个第二到达时间的相应偏差，其中相对于相应期望的第二到达时间测量相应偏差；以及
存储与每个第二到达时间中的测量的一个或多个相应偏差相关联的所测量的相应延迟时间。
8.根据权利要求7的方法，还包括重复以下步骤：检测相应的第二到达时间，测量相应偏差，以及存储微实体移动到达的一个或多个其它位置。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述系统为微流体系统，并且微实体从微流体流中的第一位置移动到第二位置。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述系统为流式细胞计，并且微实体从流体流中的第一位置移动到第二位置。
11.根据权利要求10的方法，其中从下滴时钟导出参考信号，所述下滴时钟用于对流式细胞计中的液滴的形成计时。
12.根据权利要求7的方法，其中所述参考信号包括用于将能量耦合到在第一位置和第二位置之间传送微实体的流的周期性信号的特征。
13.根据权利要求7的方法，其中所述第一位置和第二位置沿着流式细胞计的流布置。
14.根据权利要求13的方法，其中所述第一位置和第二位置之间的间隔大于约1毫米。
15.根据权利要求7的方法，其中所述微实体包括下列任一项：细胞、分子、蛋白质、肽、微颗粒、微结构、及校准珠。
16.根据权利要求7所述的方法，还包括：
周期性地将能量耦合到传送微实体的流；以及
使用驱动能量的周期性耦合的信号的特征作为参考信号。
17.根据权利要求7的方法，其中在分析微实体的过程期间实时地执行所述方法。
18.一种实现机器可读指令的制造数据存储装置，当由其中微实体从第一位置移动到一个或多个其它位置的系统的一个或多个处理器执行所述指令时，使得所述一个或多个处理器用于：
针对多个微实体的每一个，接收指示到达第一位置处的第一到达时间的第一信号；
针对多个微实体的每一个，测量相应延迟时间，其中在第一到达时间与由系统提供的参考信号之间测量相应延迟时间；
针对来自一个或多个其它位置的每一个其它位置的多个微实体的每一个，接收指示到达所述一个或多个其它位置的每一个其它位置处的一个或多个相应其它到达时间的其它信号；
针对多个微实体的每一个，测量在一个或多个其它位置的每一个处，每个相应其它到达时间与相应的期望到达时间的相应偏差；以及
与测量的相应偏差相关地存储测量的相应延迟时间。
19.根据权利要求18的制造数据存储装置，还包括这样的指令，该指令使得所述一个或多个处理器把代表相应延迟时间的第一值与代表相应偏差的第二值相关联地记录在查找表中。
20.根据权利要求19的制造数据存储装置，其中所述第二值为测量的相应偏差的分段平均。
21.根据权利要求18的制造数据存储装置，还包括这样的指令，该指令使得一个或多个处理器拟合出相应延迟时间和相应偏差的函数。
22.根据权利要求21的制造数据存储装置，其中所述函数为具有包括测量的相应延迟值的变量的正弦函数。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150715 |