BR112012022653B1 - Método de geração de parâmetros de medição e analisador de partículas - Google Patents

Abstract

gerar parâmetros de pulso em um analisador de partículas. a presente invenção refere-se a um método apra gerar parâmetros de medição para uma amostra de partículas em um analisador de partículas. o método inclui investigar a amostra de partículas com um investigador de disparo e um ou mais investigadores secundários posicionados respectivamente ao longo do comprimento de uma área de investigação, gerando pulsos respectivos com base na investigação de uma primeira partícula da amostra de partículas, determinar uma janela de detecção de pulso primário com base em um pulso de disparo, determinar um intervalo de busca para encontrar um pulso secundário com base em fatores incluindo a janela de detecção do pulso primário e um atraso laser, ajustar o intervalo de busca para a variação do atraso de laser baseada dinamicamente na investigação da primeira partícula, indentificar o pulso secundário no intervalo de busca ajustado, e processar o pulso secundário para determinar um valor de pico do pulso secundário. também é provido um aparelho corespondente.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO DE GERAÇÃO DE PARÂMETROS DE MEDIÇÃO E ANALISA-DOR DE PARTÍCULAS".

ANTECEDENTES

Reivindicação de prioridade [001] Este pedido de reivindica prioridade de acordo com 35 U.S.C. § 119(e) para o Pedido de Patente Provisória dos Estados Unidos 61/312.616, depositado em 10 de março de 2010, que é aqui incorporado em sua inteireza por referência.

Campo da invenção [002] A presente invenção refere-se à análise de amostras de partículas usando um analisador de partículas.

Antecedentes [003] Os analisadores de partículas permitem a análise rápida de amostras de partículas para detectar várias características da amostra assim como para detectar características das partículas individuais. Alguns analisadores de partículas também incluem a funcionalidade de classificar as partículas de acordo com uma ou mais características detectadas.

[004] Os analisadores de partículas, tais como citômetros de fluxo e analisadores hematológicos, são frequentemente usados para analisar amostras de células biológicas tais como sangue ou tecido. Em um citômetro de fluxo, uma amostra de célula é submetida à investigação em uma área de investigação ao longo da via de fluxo da amostra. Tipicamente, as células em um fluido de envoltório passam através de uma célula de fluxo, uma por uma, em que são investigadas por sondas, incluindo um ou mais feixes de luz. Por exemplo, uma ou mais fontes de luz de laser podem ser posicionadas na célula de fluxo ao longo da via de fluxo da corrente de células. Em outros citômetros de fluxo, tais como em citômetros de fluxo de jato no ar, as cé- lulas em um fluido de envoltório são investigadas por uma ou mais sondas exteriores à célula de fluxo. Diversas mensurações são geradas para cada célula que passa. À medida que a célula passa pela área de investigação, as características de luz resultantes, tais como difusão de luz, perda de luz, e fluorescência são medidas pelos detectores. As características de luz mensuradas são usadas para gerar pulsos elétricos correspondentes para cada célula investigada. Os pulsos elétricos são analisados para determinar os parâmetros da célula, tais como, pico do pulso, largura do pulso, e área do pulso. Um citôme-tro de fluxo classificador, por exemplo, pode classificar células de tipos diferentes nos receptáculos.

[005] Antes de ser investigada, a amostra de célula pode ser preparada usando-se vários fluorocromos e/ou reagentes para marcar tipos de célula específicos. Cada fluorocromo e/ou reagente pode se ligar a células de tipos diferentes. À medida que as células passam através da área de investigação, as fontes de luz de laser excitam os fluorocromos e/ou reagentes. Aumentando o número de diferentes flu-orocromos e/ou reagentes que podem ser detectados, uma amostra de célula pode ser analisada para a presença de uma faixa crescente de tipos de células. Contudo, cada fonte de luz de laser, por exemplo, pode somente excitar fluorocromos dentro de uma faixa de comprimento de onda limitada. É, desta maneira, desejável usar múltiplas fontes de luz de laser para possibilitar a detecção de uma faixa mais ampla de comprimentos de onda e frequências.

[006] Mas fontes de luz de laser múltiplas que são posicionadas ao longo do trajeto de fluxo da corrente de células podem levar a uma coincidência aumentada e transbordamento se as distâncias entre as fontes de luz forem muito reduzidas. A coincidência, isto é, a detecção de mais de uma partícula dentro de uma janela de detecção, leva a atrofia das partículas afetadas da amostra analisada. O transborda- mento, isto é, a detecção da resposta óptica gerada por fontes de luz adjacentes, provoca ineficácias devido à necessidade de compensar os efeitos do transbordamento. Portanto, para evitar a coincidência aumentada e o transbordamento, as fontes de luz de laser são posicionadas com uma ampla distância entre elas. Aumentando-se a distância entre as fontes de luz de laser múltiplas, a eficiência do analisador de partículas pode ser melhorada reduzindo as coincidências e o transbordamento. A distância aumentada entre as fontes de luz também possibilita a análise de uma faixa de tamanho de partículas, aumentando assim a utilidade do analisador de partículas ainda mais. Contudo, aumentar a distância entre as fontes de luz de laser conduz a uma descoberta inesperada de que os parâmetros gerados para partículas frequentemente não são precisos quando as distâncias entre as fontes de luz de laser são aumentadas.

[007] O documento US-A1-2008/319,680 é direcionado a um sistema de processamento eletrônico para um citômetro de fluxo que usa um chip de processamento que processa dados em uma arquitetura paralela em uma amostra de uma base de amostra e fornece um maior rendimento de dados. Além disso, amplificadores lineares multi-ganhos são usados, o quais são combinados usando circuitos de rea-limentação para fornecer dados precisos e dados de alta resolução tendo uma faixa dinâmica alta.

[008] Desta maneira, é desejável melhorar a precisão dos parâmetros gerados em analisadores de partículas que utilizam fontes de luz múltiplas.

BREVE RESUMO

[009] A presente invenção é dirigida para a análise dos dados de um analisador de partículas. Em uma modalidade, um método de gerar parâmetros de medição para uma amostra de partículas em um anali-sador de partículas, inclui: investigar a amostra de partículas com in- vestigadores posicionados respectivamente ao longo do comprimento de uma área de investigação, os investigadores compreendendo um investigador de disparo e um ou mais investigadores secundários; gerar pulsos respectivos com base na investigação de uma primeira célula da amostra de partículas, em que os pulsos compreendem um pulso de disparo correspondendo ao investigador de disparo e um pulso secundário correspondendo a um dos investigadores secundários; determinar uma janela de detecção de pulso primário com base no pulso de disparo; determinar um intervalo de busca para encontrar o pulso secundário com base em fatores que incluem a janela de detecção do pulso primário e um atraso do laser; ajustar o intervalo de busca para variação do atraso de laser baseando-se dinamicamente na investigação da primeira partícula; identificar o pulso secundário no intervalo de busca ajustado; e processar o pulso secundário para determinar um valor de pico do pulso secundário.

[0010] Em outra modalidade, um método de se gerar parâmetros de medição para uma amostra de partículas em um analisador de partículas inclui: investigar a amostra de partículas com investigadores posicionados respectivamente ao longo do comprimento de uma área de investigação, os investigadores compreendendo um investigador de disparo e um ou mais investigadores secundários; gerar pulsos respectivos com base na investigação de uma primeira célula da amostra de partículas, em que os pulsos compreendem um pulso disparador correspondendo ao investigador de disparo e um pulso secundário correspondendo a um dos investigadores secundários; determinar uma janela de detecção de pulso primário baseando-se no pulso de disparo; determinar uma janela de detecção de pulso secundário baseando-se em fatores incluindo a janela de detecção do pulso primário e um atraso de laser; detectar as características de um sinal de agitação aplicado à primeira partícula; deslocar a janela de detecção de pulso secundário com base nas características do sinal de agitação; identificar o pulso secundário no intervalo de busca ajustado; e processar o pulso secundário para determinar os parâmetros de medição do pulso secundário.

[0011] Ainda outra modalidade é um analisador de partículas incluindo pelo menos um processador, um investigador de partículas, e um analisador de pulsos. O investigador de partículas está configurado para: investigar a amostra de partículas com investigadores posicionados respectivamente ao longo do comprimento de uma área de investigação, os investigadores compreendendo um investigador de disparo e um ou mais investigadores secundários; e gerar pulsos respectivos com base na investigação de uma primeira célula da amostra de partículas, em que os pulsos compreendem um pulso disparador correspondendo o investigador de disparo e um pulso secundário correspondendo a um dos investigadores secundários. O analisador de pulsos inclui um criador de janela de detecção de pulso primário configurado para determinar uma janela de detecção de pulso primário com base no pulso de disparo, um criador de janela de detecção de pulso secundário configurada para determinar, com base em fatores que incluem a janela de detecção do pulso primário e um atraso de laser, um intervalo de busca correspondendo a um dos ditos investigadores secundários e um gerador de parâmetro de pulso secundário. O criador da janela de detecção de pulso secundário também pode ser configurado para ajustar o intervalo de busca para variação do atraso de laser com base dinamicamente na investigação da primeira partícula. O gerador de parâmetro de pulso secundário está configurado para identificar um pulso secundário no intervalo de busca ajustado, e processar o pulso secundário para determinar um valor de pico do pulso secundário.

[0012] Características e vantagens adicionais da presente inven- ção, assim como a estrutura e operação de suas várias modalidades, são descritas abaixo em detalhe com referência aos desenhos anexados. Deve-se notar que a invenção não está limitada às modalidades específicas aqui descritas. Tais modalidades são aqui apresentadas unicamente para propósitos ilustrativos. Modalidades adicionais ficarão evidentes às pessoas versadas na técnica(s) com base nos ensinamentos aqui contidos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0013] A figura 1 é um analisador de partículas exemplar, de acordo com uma modalidade da presente invenção.

[0014] A figura 2 é uma ilustração de um pulso exemplar e sua janela de detecção correspondente.

[0015] A figura 3 é uma ilustração dos efeitos da introdução de um sinal de agitação em um analisador de partículas.

[0016] A figura 4 é uma ilustração das características de uma largura de pulso com respeito às características de um sinal de agitação aplicado à corrente de células.

[0017] A figura 5 é uma ilustração de um analisador de pulsos, de acordo com uma modalidade da presente invenção.

[0018] A figura 6 é uma ilustração de um método de se gerar parâmetros com precisão em um analisador de partículas, de acordo com uma modalidade da presente invenção.

[0019] A figura 7 é uma ilustração de um método para expandir um intervalo de busca além da janela de detecção de pulso secundário, de acordo com uma modalidade da presente invenção.

[0020] A figura 8 é uma ilustração de um método para calcular um valor de pico de um pulso, de acordo com uma modalidade da presente invenção.

[0021] A figura 9 é uma ilustração de um método para determinar a janela de detecção de pulso secundário, de acordo com uma moda- lidade da presente invenção.

[0022] A figura 10 é uma ilustração da relação entre a fase do sinal de agitação aplicado à corrente, e o tempo de chegada de um pulso com relação à janela de detecção de pulso correspondente.

[0023] A figura 11 é uma ilustração de um método para ajustar a janela de detecção de pulso secundário, de acordo com uma modalidade da presente invenção.

[0024] As características e vantagens da presente invenção ficarão mais evidentes a partir da descrição detalhada demonstrada abaixo quando tomada em conjunto com os desenhos. Nos desenhos, números de referência similares geralmente indicam elementos idênticos, funcionalmente similares e/ou estruturalmente similares. Geralmente, o desenho no qual um elemento aparece inicialmente é indicado pelo(s) dígito(s) mais à esquerda no número de referência correspondente. DESCRIÇÃO DETALHADA

[0025] A presente invenção refere-se à análise de partículas. Enquanto que a presente invenção é aqui descrita com referência às modalidades ilustrativas para aplicações particulares, deve ser entendido que a invenção não está limitada a isso. Aqueles versados na técnica com acesso aos ensinamentos aqui reconhecerão as modificações, aplicações, e modalidades adicionais dentro do escopo dos mesmos, e campos adicionais em que a invenção será de utilidade significativa. [0026] Conforme descrito na seção de antecedentes acima, é desejável que investigadores ópticos múltiplos, tais como fontes de laser e detectores, estejam disponíveis para investigar uma amostra de célula. Investigadores de laser múltiplos, cada um capaz de excitar e detectar luz de uma parte do espectro de frequências, posicionados ao longo do comprimento de uma área de investigação na via de fluxo da amostra, podem submeter a amostra de células à investigação sob uma ampla faixa de comprimentos de onda e frequências, aumentando assim a utilidade e eficácia de uma único grupo de medições sucessivas da amostra de células através do analisador de partículas. Outros fatores, tais como o custo decrescente dos lasers, disponibilidade de uma variedade crescente de fluorocromos, e a disponibilidade de poder de processamento aumentado, facilitam o desenvolvimento de analisadores de partículas com um número maior de investigadores ópticos do que os disponíveis em dispositivos convencionais. Contudo, os inventores descobriram que aumentar o número de investigadores ópticos, e, mais particularmente, aumentar a distância entre os investigadores ópticos, pode introduzir consequências inesperadas e inconsistências na geração dos parâmetros que descrevem as propriedades das partículas. Em alguns analisadores de partículas, tais como citô-metros de fluxo classificadores, em que a corrente de células fluindo através da área de investigação é perturbada (por exemplo, para facilitar a formação de gotas para possibilitar a separação) os erros envolvidos na geração de parâmetros de acordo com métodos convencionais em dispositivos com um número maior de investigadores ópticos pode ser importante. Modalidades da presente invenção possibilitam a geração de parâmetros precisos, tais como pico do pulso, largura do pulso, e área do pulso, em analisadores de partículas tendo investigadores ópticos múltiplos. Habilitando o uso de investigadores ópticos múltiplos, modalidades da presente invenção aumentam a capacidade de um analisador de partículas para detectar uma variedade de características de partículas em um único grupo de medições sucessivas. Capacitando os investigadores ópticos múltiplos para ser colocados a grandes distâncias um do outro enquanto ainda gerando parâmetros precisos, as modalidades da presente invenção aumentam a eficiência dos analisadores de partículas reduzindo ou eliminando a coincidência e o transbordamento. Adicionalmente, permitindo que os investigadores ópticos múltiplos sejam colocados a grandes distâncias um do ou- tro, as modalidades da presente invenção possibilitam a análise das partículas de vários tamanhos, por exemplo, usando diferentes configurações de bocal.

Analisador de partículas [0027] A figura 1 é uma ilustração de um analisador de partículas 100, de acordo com uma modalidade da presente invenção. O anali-sador de partículas 100 pode, por exemplo, ser um citômetro de fluxo classificador. O analisador de partículas 100 compreende um ou mais processadores 102, uma memória 103, um armazenamento 104, um investigador de partículas 105, e um analisador de pulsos 106. Em algumas modalidades, o analisador de partículas 100 também pode incluir um analisador de dados 107 e uma exibição (mostrador) 108. [0028] Um ou mais processadores 102 podem incluir um ou mais de uma unidade de processamento central (CPU), uma rede de portas de campo programáveis (FPGA), um circuito integrado de aplicação específica (ASIC), um processador digital de sinais (DSP) ou dispositivos de processamento de instruções similares. A memória 103 geralmente inclui uma memória volátil tal como uma memória de acesso aleatório para armazenamento temporário de dados e instruções de processamento. O armazenamento 104 geralmente inclui armazenamento não volátil para armazenar instruções de processamento, dados de configuração, dados de partículas, e resultados do processamento. O armazenamento 104 pode incluir meios de armazenamento que podem ser lidos por computadores tais como disco rígido, armazenamento instantâneo, disco óptico, disco flexível, e similares. O investigador de partículas 105 capacita a amostra de partículas para ser submetida à investigação pelas fontes de luzes múltiplas em uma área de investigação. O analisador de pulsos 106 inclui a funcionalidade de gerar parâmetros correspondentes a partículas individuais na amostra de partículas. Por exemplo, o analisador de pulsos 106 aceita como entrada pulsos elétricos gerados pelo investigador de partículas 105 para as partículas respectivas, e gera parâmetros tais como pico do pulso, largura do pulso, e área do pulso. O analisador de pulsos 106 é mais descrito abaixo com respeito à figura 5. Os parâmetros gerados no analisador de pulsos 106 são depois processados pelo analisador de dados 107 e reportados e/ou exibidos usando-se a exibição 108. A in-fraestrutura de comunicações 109 interliga os vários componentes do analisador de partículas 100, e pode incluir dispositivos de conexão, tais como barramento de interconexão de componente periférico PCI (peripheral component interconnect), barramento serial universal USB, Firewire, Ethernet, ou dispositivos similares.

[0029] O analisador de dados 107 recebe os parâmetros gerados pelo analisador de pulsos 106 e reporta adicionalmente e/ou processa os dados classificando, contando, e analisando os dados. O analisador de dados 107 pode incluir funcionalidades para filtrar os dados recebidos para dados errôneos. Algumas modalidades da presente invenção melhoram a qualidade dos parâmetros que são submetidos ao anali-sador de dados tal como o analisador de dados 107. O analisador de dados 107 e/ou mostrador 108 podem ser externos ao analisador de partículas 100 em algumas modalidades. O analisador de dados 107, por exemplo, pode ser configurado em um computador separado acoplado ao analisador de partículas 100 através de uma rede (não mostrada). Em uma modalidade, o analisador de dados 107 pode incluir um software de análise tal como o software de análise de dados de fluxo citométrico SUMMIT™ de Beckman Coulter.

[0030] O investigador de partículas 105 inclui uma área distribuidora de amostra de partículas 112, um bocal injetor de amostras 113, uma área de investigação 114, uma pluralidade de fontes de luz 116, uma pluralidade de detectores de luz 118, e um gerador de pulsos elétricos 120. A área distribuidora de amostra de partículas 112 provê a retenção da amostra de partículas 126 e um líquido de envolvimento 128. A amostra de partículas pode, por exemplo, ser uma amostra de sangue integral ou uma amostra de sangue integral preparada pela adição de um ou mais fluorocromos e/ou reagentes.

[0031] O bocal 113 possibilita a injeção da amostra de partículas, incluindo o líquido de envolvimento, a ser injetado na área de investigação 114. O bocal 113 é, em geral, configurado para injetar uma amostra de partículas hidrodinâmicamente focalizadas de modo que as partículas, tal como a partícula 130, flui através da área de investigação 114 em uma única fila, uma partícula após a outra. Em algumas modalidades, o bocal 113 pode ser configurado com o tamanho do bocal (isto é, diâmetro do bocal) e a pressão do líquido de envolvimento. [0032] Ao longo do comprimento da área de investigação 114, é posicionada uma pluralidade de fontes de luz 116 e uma pluralidade de detectores de luz correspondentes 118. A área de investigação 114, em algumas modalidades, pode compreender uma célula de fluxo. Em algumas modalidades, tais como em citômetros de fluxo de jato no ar, a área de investigação pode compreender uma área no trajeto do fluxo da amostra de partículas fora da célula de fluxo. Um empare-lhamento de fonte de luz e detector correspondente pode ser referido como um investigador. Na modalidade ilustrada, sete fontes de luz 116 e sete detectores de luz correspondentes 118 são mostrados posicionados ao longo do comprimento da área de investigação. Em uma modalidade, as fontes de luz 116 podem compreender fontes de luz de laser tendo diferentes comprimentos de onda. Na área de investigação, cada fonte de luz respectiva 116 ilumina cada partícula à medida que ela passa por uma área de detecção correspondendo à respectiva fonte de luz, e os sinais ópticos resultantes incluindo dispersão luminosa e/ou fluorescência são detectados pelos detectores correspondentes 118. Cada detector pode compreender um orifício (não mostra- do em separado) e um detector óptico para detectar a dispersão luminosa e/ou fluorescência. Os sinais ópticos de cada detector são convertidos em sinais elétricos respectivos, tais como sinais de voltagem, pelo gerador de pulsos elétricos 120. O sinal elétrico correspondendo à resposta óptica gerada pela investigação de uma célula única por um investigador é referido como um pulso. Os pulsos são processados pelo analisador de pulsos 106 para identificar vários parâmetros correspondentes a partículas e para prover os parâmetros ao analisador de dados 107. O analisador de pulsos 106, com base nos parâmetros identificados, também pode controlar a operação do investigador de partículas 106 através, por exemplo, de um módulo de controle (não mostrado) para efetuar tarefas tais como configurar o bocal, configurar as fontes de luz e detectores, e configurar o separador de partículas opcional 122.

[0033] Em algumas modalidades, um separador de partículas 122 é usado para separar as partículas de acordo com várias características. Associados com o separador de partículas 122 são um dispositivo de carregamento de partículas 136 e um gerador de agitação 124. O gerador de agitação 124 pode ser associado com o bocal 113 para gerar uma agitação da corrente de partículas injetada na área de investigação. Em uma modalidade, o gerador de agitação 124 está localizado em uma montagem de bocal, tal como o bocal 113, acima da saída do bocal. Por exemplo, uma onda de pressão correspondendo a uma onda senoidal pode ser gerada pelo gerador de agitação. A onda de pressão é configurada de modo que a corrente de partículas pode formar gotículas deterministicamente, idealmente com cada gotícula contendo uma única partícula, em uma área de formação de gotículas 132. Em uma modalidade, o gerador de agitação 124 compreende um oscilador de cristal piezoelétrico com uma frequência de oscilação con-figurável. Em uma modalidade, a frequência, amplitude, e fase da on- da de agitação são configuráveis. A área de formação de gotículas 132 encontra-se depois dos investigadores ópticos no trajeto da corrente de partículas na área de investigação. Uma carga elétrica pode ser aplicada a cada gotícula por um dispositivo carregador 136. Em uma modalidade, o dispositivo carregador 136 está localizado na área de formação de gotículas 132. Em outra modalidade, o dispositivo carregador pode ser localizado antes da área de investigação. Por exemplo, um dispositivo carregador localizado acima da área de investigação pode transportar uma carga a uma gotícula na área de formação de gotículas 132 através do líquido de envolvimento. A gotícula pode ser carregada de acordo com as características da partícula contida na gotícula. Quando uma gotícula entra no separador, as placas carregadas 138 direcionam a gotícula a um dos receptáculos 140. O separador de partículas 122 está configurado para ter cada um dos receptáculos 140 coletando partículas com características similares.

[0034] A investigação de uma amostra de partículas inclui a injeção da amostra, com ou sem agitação, na área de investigação e a investigação das partículas pelas sondas ao longo da área de investigação. Como observado anteriormente, cada investigador provoca um pulso representando o mesmo ou diferentes aspectos da mesma partícula a ser gerada. O analisador de pulsos 106 recebe uma corrente de sinais contendo os pulsos gerados pelo investigador de partículas 105, e está configurado para identificar pulsos correspondendo a cada respectiva partícula e investigador.

[0035] O intervalo espacial entre as fontes de luz respectivas 116 pode ser determinado com base em vários critérios, tais como o número de fontes de luz, comprimento da área de investigação, tamanho das partículas, a amplitude da onda de pressão que pode ser gerada para encorajar a formação de gotas, potência das fontes de luz, taxa de evento das células, nível de erro tolerável e similares.

[0036] Posicionando as fontes de luz próximas uma a outra se pode aumentar a sobreposição espectral permitindo que sinais correspondentes a frequências espectrais adjacentes transbordem nas faixas de detecção uma da outra. A sobreposição espectral é indesejável porque é requerida compensação adicional para obter sinais válidos para análise. Contudo, quando as fontes de luz são mais espaçadas, podem ocorrer variações como no momento em que a partícula realmente passa pela área de detecção de um detector e o momento em que ela era esperada na área de detecção. Quando a agitação da corrente de partículas é introduzida, tal como pelo uso de um gerador de agitação 124, a variação em velocidade entre as partículas é aumentada, o que por sua vez pode levar a mais erros na detecção de pulsos. Analisadores de partículas convencionais, que os inventores saibam, não reconhecem a relação entre o espaçamento entre os investigadores, o tempo de chegada dos pulsos nos investigadores secundários, e o sinal de agitação aplicado à corrente de células. Modalidades da presente invenção incorporam características nos analisadores de partículas para superar as imprecisões nos parâmetros gerados quando tal relação existe.

[0037] A figura 2 é uma ilustração de um pulso, uma janela de detecção de pulso, e um limiar de detecção de pulso. O analisador de pulsos 106 detecta pulsos na corrente de sinais vindo do investigador de partículas criando uma janela de detecção de pulso correspondendo a um investigador particular e então encontrando um pulso com relação àquela janela de detecção. O pulso 201, por exemplo, é visto dentro da janela de detecção de pulso 203. O pulso 201 é detectado como um pulso quando o sinal correspondente permanece ou fica acima do limiar de detecção de pulso 205. O limiar de detecção de pulso 205 pode ser pré-configurado. No investigador de disparo, a largura da janela de detecção é determinada com base na duração do pulso acima do limiar. O investigador de disparo pode ser selecionável pelo usuário. Por exemplo, o investigador mais próximo à entrada da área de investigação pode ser selecionado como o investigador de disparo. O investigador de disparo pode ser selecionado com base no tipo de amostra de células e/ou tipo de análise que é desejado. O pulso e a janela de detecção de pulso, correspondentes ao investigador de disparo, podem ser referidos como, respectivamente, pulso primário e janela de detecção de pulso primário. Investigadores de não disparo, pulsos correspondentes, e janelas de detecção correspondentes, são referidos como, respectivamente, investigador secundário, pulso secundário, e janela de detecção de pulso secundário. O atraso do laser (LD) é a distância no tempo entre a janela de detecção do pulso primário e a janela de detecção de pulso secundário. O atraso de laser pode ser dependente da distância espacial entre os investigadores respectivos e a velocidade das partículas respectivas.

Variação do atraso de laser [0038] A figura 3 é uma ilustração das diferenças que podem ser causadas pela introdução de uma agitação na corrente de partículas quando investigadores ópticos múltiplos são posicionados ao longo de uma área de investigação de modo que existe um atraso de laser substancial entre os investigadores. Conforme descrito acima, a agitação pode ser uma onda de pressão introduzida na corrente de partículas. A agitação pode ser introduzida usando um gerador de agitação 124 posicionado dentro ou próximo ao bocal 113. O gráfico 301 ilustra a FITC (um tipo de fluorescência) e mensurações de dispersão lateral com bases no pulso correspondendo ao investigador de disparo quando não há agitação. O gráfico 305 ilustra as mesmas mensu-rações para a mesma amostra baseadas no pulso correspondendo ao primeiro investigador quando uma agitação foi introduzida. Os gráficos 301 e 305 ilustram que os pulsos correspondendo ao investigador de disparo não são afetados substancialmente pela agitação, isto é, apesar da agitação o pulso correspondendo ao primeiro investigador pode ser determinado com precisão. Nesse exemplo, o investigador de disparo é configurado como o primeiro, isto é, mais próximo ao bocal, dos sete investigadores.

[0039] Contudo, os gráficos 302 e 306 representam mensurações de fluorescência baseadas nos pulsos correspondendo ao último investigador que está localizado mais afastado do primeiro investigador. O gráfico 302, conforme mostrado pela variação estreita nas mensurações de fluorescência, ilustra que quando não há agitação, os pulsos podem ser mensurados sem erro significativo mesmo no sétimo investigador. O gráfico 306, contudo, conforme mostrado pela ampla variação nas mensurações de fluorescência, ilustra que quando não há agitação na corrente de partículas, as mensurações correspondentes aos investigadores distantes podem ter uma variação significativa.

[0040] A figura 4 é uma ilustração exemplar dos pulsos com relação às janelas de detecção de pulsos correspondentes. Os pulsos 401 e 403, respectivamente, mostram que o pulso detectado pelo investigador de disparo (isto é, investigador primário) está posicionado com precisão dentro da janela de detecção de pulso correspondente, nos casos de alguma agitação (por exemplo, um sinal de agitação com amplitude de 15V), e um nível de agitação relativamente elevado (por exemplo, um sinal de agitação com amplitude de 40V). Quando a amplitude do sinal de agitação é de 15V, os pulsos 407 e 408, que representam respectivamente os pulsos correspondentes a um investigador precedendo o investigador de disparo na área de investigação e um investigador posicionado depois do investigador de disparo, ilustram que eles podem ter porções substanciais do pulso tanto antes como depois da janela de detecção de pulso correspondente. Os pulsos 410 e 411 ilustram que, quando a amplitude do sinal de agitação é aumen- tada, a diferença na chegada do pulso com respeito à janela de detecção de pulso correspondente aumenta. Por exemplo, o tempo de chegada esperado pode ser mensurado com relação ao centro da janela de detecção de pulso. A diferença nos tempos de chegada do pulso comparada ao tempo de chegada esperado, com base na janela de detecção de pulso correspondente, é referida como a variação do atraso de laser (LDV). Assim, a variação do atraso de laser aumenta com o aumento na amplitude da agitação.

Analisador de pulsos [0041] A figura 5 é uma ilustração de um analisador de pulsos 106. De acordo com uma modalidade, o analisador de pulsos 106 compreende um criador de janela de detecção de pulso primário 502, um gerador de parâmetro de pulso primário 504, um criador de janela de detecção de pulso secundário 506, e um gerador de parâmetro de pulso secundário 508. Compreende-se que outros componentes, tais como um módulo de controle (não mostrado) para controlar o investigador de partículas 105, com base nos parâmetros gerados, podem ser incluídos no analisador de pulsos 106. O analisador de pulsos 106 pode ser implementado em software, firmware, hardware, ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o analisador de pulsos 106 é implementado em firmware FPGA.

[0042] O criador da janela de detecção de pulso primário 502, em uma modalidade, é configurado para determinar a janela de detecção do pulso primário para cada partícula detectada na área de investigação. A determinação da janela de detecção do pulso primário é descrita abaixo com respeito à figura 6.

[0043] O gerador de parâmetro do pulso primário 504, em uma modalidade, é configurado para determinar parâmetros tais como pico do pulso, largura de pulso, e área do pulso, para cada partícula, com base no pulso primário. A determinação dos parâmetros de pulso pri- mário é descrita abaixo com respeito à figura 6.

[0044] O criador da janela de detecção de pulso secundário 506, em uma modalidade, é configurado para determinar um intervalo de busca correspondente a um ou mais investigadores secundários para as partículas respectivas detectado na área de investigação. O criador da janela de detecção de pulso secundário 506 também inclui a funcionalidade para ajustar o intervalo de busca com base na variação do atraso de laser. A determinação e o ajuste do intervalo de busca para pulsos secundários é descrita abaixo com respeito à figura 6.

[0045] O gerador de parâmetro de pulso secundário 508, em uma modalidade, é configurado para determinar os parâmetros tais como pico do pulso, largura de pulso, e área do pulso, para cada partícula, com base no pulso primário. A determinação dos parâmetros de pulso secundário é descrita abaixo com respeito à figura 6. Método para gerar parâmetros [0046] A figura 6 é um fluxograma de um método 600 para gerar os parâmetros de medição, tais como pico do pulso, largura do pulso, e área do pulso, para uma amostra de partículas em um analisador de partículas, de acordo com uma modalidade da presente invenção. [0047] Na etapa 602, uma amostra celular é preparada para análise em um analisador de partículas, tal como um citômetro de fluxo. A preparação da amostra pode incluir a marcação de células (também referida como coloração) com fluorescentes. Conforme mencionado acima, os fluorescentes se ligam a tipos específicos de células, e podem ser usados para identificar aqueles tipos de células quando a amostra de células é iluminada com a luz de laser apropriada.

[0048] Na etapa 604, a amostra celular é investigada na área de investigação. A investigação da amostra de partículas inclui a injeção da amostra, com ou sem agitação, na área de investigação e a investigação das partículas pelas sondas ao longo da área de investigação.

[0049] A amostra de células preparada, junto com um líquido de envoltório, é introduzida no analisador de partículas. A introdução à área de investigação pode ser controlada configurando várias características tais como tamanho do bocal e pressão de envoltório. Os tamanhos dos bocais são configurados, por exemplo, para acomodar vários tipos de partículas. A pressão de envoltório pode determinar a taxa em que a corrente de partículas é injetada na área de investigação. Assim, a pressão de envolvimento pode ser configurada de acordo com uma velocidade média desejada das partículas dentro da área de investigação.

[0050] Em algumas modalidades, um sinal de agitação pode ser aplicado à corrente de partículas. Por exemplo, um gerador de agitação pode introduzir uma pressão na forma de uma onda senoidal à corrente de partículas à medida que ela deixa o bocal. A agitação pode aumentar (com relação a não ter agitação) as diferenças de velocidade entre as partículas à medida que fluem através da área de investigação.

[0051] Ao longo do comprimento da área de investigação, isto é, ao longo do trajeto de fluxo da amostra de células dentro da área de investigação, são posicionados investigadores ópticos múltiplos. Em uma modalidade, os investigadores ópticos são 7 fontes de luz de laser, tais como diodos a laser, e detectores ópticos correspondentes. Os lasers podem ter faixas de comprimentos de onda que podem ou não se sobrepor. Os detectores ópticos são capazes de perceber dispersão luminosa, fluorescência, e outras características ópticas. À medida que cada partícula passa através de uma área de investigação iluminada por uma fonte de laser, o detector correspondente capta os sinais ópticos resultantes. Dessa maneira, os sinais ópticos correspondentes a cada investigador óptico ativo são captados para cada partícula.

[0052] Na etapa 606, os pulsos correspondentes às interrogações são gerados. Os sinais ópticos captados por cada detector óptico são então convertidos em pulsos elétricos respectivos. Em uma modalidade, a conversão fotoelétrica dos sinais ópticos em sinal elétrico pode ser efetivada por um dispositivo tal como um fotodiodo, uma válvula fotomultiplicadora, ou similares. Em uma modalidade, as etapas 604 e 606 podem ser efetuadas pelo investigador de partículas 105.

[0053] Na etapa 608, o pulso primário é detectado. O pulso primário é o pulso em relação aos quais os outros pulsos da mesma partícula são mensurados. O pulso primário está associado com um investigador de disparo, isto é, o investigador em relação em que todas as outras investigações são mensuradas. Em uma modalidade, o investigador óptico de disparo é o primeiro investigador no trajeto do fluxo de partículas. Em outras modalidades, o investigador de disparo pode ser selecionado como qualquer um dos outros investigadores. Conforme observado acima, os usuários podem selecionar diferentes investigadores ópticos como investigador de disparo com base no tipo de amostra e tipo de análise.

[0054] Na etapa 610, é determinada uma janela de detecção de pulso primário. A janela de detecção do pulso primário é definida pelo pulso primário. As duas bordas da janela de detecção do pulso primário estão localizadas nos pontos em que o pulso primário excede o valor de limiar de detecção de pulso predeterminado, isto é, nas bordas ascendentes e descendentes, respectivamente. Assim, a largura da janela de detecção do pulso primário, em uma modalidade, é igual à largura do pulso primário mensurada entre os pontos nos quais o pulso excede o limiar de detecção de pulso.

[0055] Na etapa 612, opcionalmente, os parâmetros correspondentes ao pulso primário são calculados. Em uma modalidade, os parâmetros calculados incluem o pico, largura, e área do pulso primário.

Em uma modalidade, o valor mais elevado do pulso dentro da janela de detecção do pulso primário é determinado como o pico do pulso. Por exemplo, um circuito rastrear e manter pode ser usado para determinar o pico. Em outra modalidade, um buffer de memória, como um buffer first in first out (FIFO) pode ser inicializado para ser zerado no começo da janela de detecção do pulso primário, e atualizado com cada valor sucessivo que é maior que o valor corrente no buffer, à medida que o pulso passa através da janela de detecção do pulso primário.

[0056] A largura do pulso primário, em uma modalidade, é determinada como a distância (duração) entre o ponto de metade do pico na borda ascendente do pulso primário e o ponto de metade do pico na borda descendente. Outras modalidades podem usar a distância entre as bordas de partida e final do pulso (os pontos de interseção com o limiar de detecção de pulso predeterminado), ou a distância entre alguns pontos percentuais em relação ao pico nas bordas ascendentes e descendentes do pulso.

[0057] A largura de pulso primária é determinada integrando-se o pulso acima de uma percentagem predeterminada do valor de pico. Assim, a área do pulso é definida pela área sob a curva entre os pontos correspondentes a uma percentagem predeterminada do valor de pico. Em outra modalidade, a área do pulso pode ser determinada integrando-se o pulso entre os pontos de interseção com o valor de limiar de detecção de pulso predeterminado.

[0058] Com respeito à partícula que disparou o pulso primário, as etapas 614-620 podem ser repetidas para cada investigador para o qual um pulso é gerado. Na etapa 614, um intervalo de busca é determinado nela para detectar um pulso secundário correspondente a um dos investigadores secundários. O intervalo de busca define uma duração de tempo na qual espera que o pulso secundário seja detectável na corrente de pulsos que chega. Em uma modalidade, o intervalo de busca pode ser determinado com base na janela de detecção do pulso primário e no atraso de laser do investigador de disparo a um investigador secundário selecionado. Por exemplo, o intervalo de busca pode ser centrado a uma distância da janela de detecção do pulso primário que corresponde ao atraso de laser entre o respectivo disparador e investigadores secundários. O atraso de laser pode ser predeterminado para cada investigador de disparo e par investigador secundário. Em outra modalidade, o atraso de laser pode ser determinado com base na distância espacial entre o investigador de disparo e o investigador secundário, e a velocidade média das partículas na área de investigação. A velocidade das partículas pode ser determinada a partir de especificações conhecidas do bocal de injeção, pressão de envolvimento, ou pode ser estimada com base na largura da janela de detecção do pulso primário. Ainda em outras modalidades, a velocidade das partículas pode ser determinada baseada em mensurações dinâmicas, tais como, por exemplo, mensurando-se o tempo decorrido para uma partícula ser detectada pelos investigadores entre os quais a distância é conhecida. Também, conforme descrito acima com respeito à figura 4, a amplitude da agitação aplicada, se houver alguma, pode afetar a velocidade da partícula e pode afetar o atraso associado com a partícula chegando no investigador secundário correspondente.

[0059] A duração do intervalo de busca pode ser configurada para ser igual à largura da janela de detecção do pulso primário. Em outra modalidade, a duração do intervalo de busca está configurada para ser igual à janela de detecção do pulso primário mais uma extensão predeterminada. A extensão de janela predeterminada pode ser adicionada igualmente a ambos os lados do intervalo de busca de modo que a distância entre os centros da janela de busca e da janela de detecção de pulso primário é mantida. Em outra modalidade, a duração do inter- valo de busca pode ser estabelecida de acordo com uma configuração predeterminada. A extensão é introduzida para acomodar, até certo ponto, a variação nas chegadas dos pulsos com respeito à janela de detecção original. O tamanho da extensão pode ser estabelecido esta-ticamente, pode ser estabelecido com base no tamanho da janela de detecção de pulso primário correspondente, ou pode ser determinado de acordo com a intensidade da agitação. Por exemplo, extensões maiores podem ser configuradas para amplitudes de agitação maiores, e extensões menores podem ser configuradas para pequenas amplitudes.

[0060] Em uma modalidade, a janela de detecção de pulso secundário é determinada de modo que ela corresponda ao intervalo de busca. A janela de detecção de pulso secundário, com respeito a um investigador selecionado, é o intervalo de tempo durante o qual a corrente de pulsos que chegam é inicialmente examinada para a existência do pulso secundário correspondente. A detecção de coincidência e transbordamento, por exemplo, é baseada em janelas de detecção de pulsos primários e/ou secundários. O dimensionamento (isto é, o estabelecimento da duração) da janela de detecção de pulso deve equilibrar a troca entre fazer a janela grande demais e permitir o aumento dos eventos de coincidência, e fazer a janela pequena demais e permitir que os pulsos caiam fora da janela. Fazer as janelas de detecção de pulso maiores também pode levar a problemas de uma janela de detecção de pulso se sobrepondo à janela de detecção de pulso de um investigador adjacente.

[0061] Na etapa 616, o intervalo de busca é ajustado com base na variação do atraso de laser. Em uma modalidade, o intervalo de busca corresponde inicialmente à janela de detecção de pulso secundário. De acordo com a modalidade, o intervalo de busca é expandido para incluir durações antes e/ou depois da janela de detecção de pulso se- cundário, de modo que o pulso correspondente pode ser detectado mesmo se ele chegou cedo ou tarde com respeito à janela de detecção de pulso secundário devido à variação do atraso de laser. A figura 7 é uma ilustração de uma modalidade em que o intervalo de busca é ajustado expandindo além da janela de detecção de pulso secundário. Em outra modalidade, a janela de detecção de pulso secundário inclui as durações expandidas. As durações expandidas podem ser determinadas, por exemplo, com base no estado ou amplitude da agitação no momento em que a partícula deixa o bocal.

[0062] De acordo com algumas modalidades, por exemplo, modalidades nas quais o intervalo de busca compreendendo a janela de detecção de pulso secundário e as durações expandidas, e modalidades nas quais o intervalo de busca corresponde a uma janela de detecção de pulso secundário expandida, o intervalo de busca pode ser modificado dinamicamente para evitar colisões entre janelas adjacentes. Por exemplo, na detecção de uma colisão em um intervalo de busca expandido, o intervalo de busca pode ser truncado, ou ajustado, para não se sobrepor ao intervalo de busca em colisão.

[0063] Em outra modalidade, o intervalo de busca corresponde à janela de detecção de pulso secundário, e o intervalo de busca é ajustado deslocando ou movendo o mesmo para ocorrer tanto temporalmente adiantado ou atrasado em relação à sua posição inicial. O intervalo de busca é deslocado com base mediante se a variação do atraso de laser esperada vai resultar no pulso chegando antes ou depois da posição inicial. A figura 11 é uma ilustração de uma modalidade em que o intervalo de busca e/ou a janela de detecção correspondente de pulso secundário é deslocado em relação à sua posição inicial com base na variação do atraso de laser esperada.

[0064] Na etapa 618, o pulso secundário correspondente é detectado em relação ao intervalo de busca ajustado. Em uma modalidade, o pulso correspondente à janela de detecção de pulso secundário é determinado como o pulso tendo uma porção substancial do mesmo dentro da janela de detecção de pulso correspondente. Em uma modalidade, se mais de um pulso é visto como estando dentro de uma janela, pelo menos parcialmente, a largura de pulso com sua maior parte dentro da janela é considerado o pulso correspondente à janela respectiva. Em outra modalidade, é considerada a largura de pulso de valor mais elevado. Em outras modalidades, a janela respectiva pode ser ajustada para incluir somente um único pulso.

[0065] Na etapa 620, são determinados os parâmetros correspondentes ao pulso secundário. Em uma modalidade, tendo encontrado o pulso secundário correspondente na etapa 618, o pulso conforme definido pelo pulso acima de um valor de limiar de detecção de pulso e/ou acima de uma percentagem predeterminada do valor de pico é considerado, independentemente da totalidade de tais porções estar dentro da janela de investigação secundária. Por exemplo, em uma modalidade, porções do pulso detectado dentro de um intervalo de busca expandido são consideradas ao longo com as porções dentro da janela de detecção correspondente de pulso secundário. Em outra modalidade, por exemplo, em que a janela de detecção de pulso foi deslocada em resposta à variação do atraso de laser esperado, o pulso secundário pode ser detectado com base nas porções do pulso substancialmente dentro da janela de detecção de pulso secundário.

[0066] O pulso secundário é processado para determinar o valor do pico do pulso com base no pulso inteiro acima do limiar de detecção de pulso. Em uma modalidade, um circuito rastrear e manter pode ser empregado para determinar o pico do pulso. Por exemplo, o pulso pode ser rastreado para valores mais elevados começando a partir de quaisquer valores determinados anteriormente para o pico do mesmo pulso, tal como um valor de pico determinado no momento em que a janela de detecção correspondente de pulso secundário foi criada. Em outra modalidade, um buffer de memória, tal como um Buffer FIFO, pode ser inicializado para ser zerado no ponto em que o pulso secundário excede o limiar de detecção de pulso e atualizado com cada valor sucessivo que é maior que o valor corrente no buffer, à medida que o pulso atravessa. Ainda em outra modalidade, um buffer FIFO pode ser inicializado com o valor de qualquer determinação de pico anterior para o mesmo pulso, tal como um valor de pico determinado no momento da criação da janela de detecção de pulso secundário, e atualizado com cada valor sucessivo que é maior que o valor corrente no buffer à medida que o pulso atravessa.

[0067] O pulso secundário também pode ser processado para determinar a largura do pulso. A largura do pulso secundária, em uma modalidade, é determinada como a distância (duração) entre o valor intermediário ao pico na borda ascendente do pulso primário e o ponto do valor intermediário ao pico na borda descendente. Outras modalidades podem usar a distância entre as bordas de partida e final do pulso (por exemplo, os pontos de interseção com o limiar de detecção de pulso predeterminado), ou a distância entre alguns pontos percentuais em relação ao pico nas bordas ascendentes e descendentes do pulso.

[0068] A área de pulso secundária é determinada integrando o pulso acima de uma percentagem predeterminada do valor de pico. Assim, a área do pulso é definida pela área sob a curva entre os pontos correspondendo a uma percentagem predeterminada do valor de pico. Em outra modalidade, a área do pulso pode ser determinada integrando o pulso entre os pontos de interseção com o valor de limiar de detecção de pulso predeterminado.

[0069] O cálculo dos parâmetros de pulso para pulsos secundários com o deslocamento para fora da janela respectiva de detecção de pulsos, produz melhoras substanciais na precisão desses parâmetros. Por exemplo, convencionalmente, o pico de um pulso secundário foi determinado como o valor mais elevado dentro da janela respectiva de detecção de pulso e, desta maneira, não pode restituir o pico real do pulso nos casos em que o pico real estava fora da janela (por exemplo, fora da janela incluindo as extensões da janela). Em modalidades da presente invenção, deslocando-se para além da janela de detecção para rastrear o pulso secundário, os parâmetros podem ser determinados com precisão mesmo quando uma porção substancial do pulso está fora da janela de detecção.

Detectar o pulso fora da janela de detecção de pulso [0070] A figura 7 é uma ilustração de um método 700 para criar um intervalo de busca que se expande além de uma janela de detecção de pulso correspondente. Em uma modalidade, o método 700 efetua as etapas de processamento da etapa de ajuste 616 descrita acima. [0071] Na etapa 702, porções do pulso secundário dentro da janela de detecção correspondente de pulso secundário são detectadas. A janela de detecção de pulso secundário, por exemplo, pode ser criada na etapa 614, conforme descrito acima. Em uma modalidade, a janela de detecção de pulso secundário é definida correspondendo ao intervalo de busca inicial para a partícula sendo interrogada.

[0072] Conforme observado acima, devido à variação do atraso de laser, o pulso correspondente à partícula sob investigação pode ter porções suas chegando antes ou depois da janela de detecção de pulso secundário. Na etapa 702, as porções do pulso que estão dentro da janela de detecção de pulso secundário são determinadas.

[0073] Na etapa 704, o intervalo de busca é aumentado para incluir áreas antes e/ou depois da janela de detecção correspondente de pulso secundário. Por exemplo, se as porções da largura de pulso dentro da janela de detecção de pulso secundário indicam que o pulso chegou cedo com respeito ao centro da janela, então a janela de busca é ajustada expandindo-a para incluir um intervalo de tempo antes da janela de detecção de pulso secundário. Se porções da largura de pulso dentro da janela de detecção de pulso secundário indicam que o pulso chegou tarde em relação ao centro da janela, então a janela de busca é ajustada expandindo-a para incluir um intervalo de tempo depois da janela de detecção de pulso secundário. Em outra modalidade, se é determinado que o pulso excedeu a janela de detecção de pulso secundário, tanto antes quanto depois, então a janela de busca é ajustada expandindo para incluir intervalos de tempo antes e depois da janela de detecção de pulso secundário. A janela de busca ajustada é então usada para determinar os parâmetros do pulso secundário, por exemplo, como nas etapas 618-620 descritas acima.

Determinação do pico de pulso secundário [0074] A figura 8 é um método 800 para determinar o valor de pico de um pulso secundário, de acordo com uma modalidade da presente invenção. Em uma modalidade, o método 800 pode ser efetuado na etapa 620.

[0075] Na etapa 802, o valor do pico do pulso é inicializado ao valor mais elevado do pulso correspondente dentro da janela de detecção.

[0076] Na etapa 804, é determinado um valor limiar para a detecção de pulso. Em uma modalidade, o limiar é determinado como uma percentagem predeterminada do valor de pico corrente. Em outra modalidade, o limiar é determinado como uma percentagem predeterminada do valor de pico do pulso primário. Ainda em outras modalidades, o limiar pode ser um valor absoluto ou um valor nominal acima de um limiar de ruído.

[0077] Na etapa 806, o pulso, incluindo porções do pulso fora da janela de detecção, é processado para determinar o valor do pico real.

Por exemplo, em uma modalidade, o pulso fora da janela de detecção de pulso, porém dentro do intervalo de busca, é processado começando no ponto em que ele excede o limiar de detecção. Em uma modalidade, durante o processamento do pulso, o valor mais elevado do pulso detectado até esse ponto é armazenado repetidamente em um buffer de memória. O valor remanescente no buffer ao final do processamento do pulso é tomado como o valor de pico do pulso secundário. [0078] Em uma modalidade, a etapa 802 é implementada em uma primeira iteração do processamento dos pulsos, e as etapas 804 e 806 são implementadas em uma segunda iteração de processamento. Por exemplo, na primeira iteração de processamento dos pulsos de sinais que chegam do investigador de partículas, o analisador de pulsos pode criar as janelas para os investigadores primários e secundários. Os parâmetros para o investigador primário também podem ser determinados durante a primeira iteração de processamento. Também, para cada pulso secundário, um valor de pico inicial pode ser determinado (por exemplo, tal como na etapa 802 acima) durante a primeira iteração de processamento. Na segunda iteração de processamento, algumas vezes também referida como reprocessamento dos sinais de pulso, podem ser implementados a determinação dos pulsos secundários com relação às janelas secundárias determinadas anteriormente e o processamento dos pulsos secundários deslocando-se para além dos limites das janelas.

[0079] Em uma modalidade, o reprocessamento dos pulsos é implementado armazenando-se os pulsos ou partes suas em um FIFO na ordem em que eles são recebidos no analisador de pulsos e digitalizados. Os buffers no FIFO podem ser processados na primeira iteração de processamento. Com base na posição dos buffers correspondentes às janelas de detecção relevantes, e se os buffers relevantes ainda estão disponíveis no FIFO, os buffers antes e depois dos buffers correspondentes à janela de detecção podem ser processados na segunda interação de processamento.

Ajustando a janela de detecção de pulso secundário [0080] A figura 9 ilustra um método 900 para criar um intervalo de busca e/ou janela de detecção de pulso secundário, de acordo com uma modalidade da presente invenção. Em uma modalidade, o método 900 pode ser incluído no processamento da etapa 614 descrita acima para criar um intervalo de busca e/ou janela de detecção de pulso secundário.

[0081] Na etapa 902, é determinado o momento em que a janela de detecção do pulso primário ocorreu. Em uma modalidade, o momento é determinado como o momento no qual a janela é iniciada. Em outra modalidade, o momento é determinado como o momento no ponto intermediário da janela.

[0082] Na etapa 904, a duração da janela de detecção do pulso primário é determinada. A duração (também referida como a largura da janela) da janela de detecção do pulso primário é determinada pela duração em que o pulso primário permanece acima do valor do limiar de detecção de pulso.

[0083] Na etapa 906, é determinada a distância entre o investigador primário e o investigador secundário sujeito. Em uma modalidade, essa distância pode ser determinada com base na informação de configuração.

[0084] Na etapa 908, a velocidade de partícula é determinada. Em uma modalidade, a velocidade média das partículas é determinada com base nas configurações de pressão de envolvimento ou configurações de bocal. Em uma modalidade, a velocidade da partícula pode ser determinada com base na largura do pulso primário. Em outra modalidade, a velocidade das partículas pode ser determinada com base na configuração de um bocal através do qual a amostra celular é inje- tada na área de investigação. Por exemplo, o bocal pode ser configurado para injetar a corrente celular a uma taxa de fluxo predeterminada.

[0085] Na etapa 910, é determinado um momento de ocorrência para a janela secundária. Em uma modalidade, o momento de ocorrência para a janela secundária é calculado com base no momento de ocorrência para a janela de detecção do pulso primário, na distância do investigador primário ao investigador secundário, e na velocidade da partícula. Em uma modalidade, o momento de ocorrência é determinado como o momento no qual ocorre a primeira borda da janela. Em outra modalidade, o momento de ocorrência é o momento no qual ocorre o ponto médio da janela. O momento de ocorrência é mensurado como sendo consistente com a maneira na qual o momento de ocorrência do pulso primário é determinado. A medição da distância entre as janelas de detecção dos pulsos primário e secundário com base no centro das janelas respectivas eliminaria a discrepância introduzida pelas mudanças ao limiar de detecção de pulso. Por exemplo, mudar o limiar de detecção de pulso muda o momento de ocorrência da janela de detecção do pulso primário se a distância é mensurada da primeira borda da janela porque o local da primeira borda da janela muda com base no ponto no qual o pulso atinge o valor limiar.

[0086] Na etapa 912, é configurada a largura da janela de detecção de pulso secundário. Em uma modalidade, a largura da janela de detecção de pulso secundário é determinada como a largura da janela de detecção do pulso primário mais a extensão da janela. A duração da extensão da janela pode ser pré-configurada ou determinada dinamicamente baseando-se em fatores tais como o atraso de laser correspondente e a amplitude da agitação aplicada à corrente de células. Conforme descrito acima, quando se determina dinamicamente a largura da janela de detecção de pulso secundário, as larguras das res- pectivas janelas podem ser ajustadas para evitar colisões ou sobreposições com janelas adjacentes.

Ajustes de janela previsíveis [0087] A figura 10 é uma ilustração 1000 de como a fase de um sinal de agitação, tal como o sinal de agitação aplicado à corrente de partículas pelo gerador de agitação 124, introduzida na corrente de células atinge a chegada das partículas nos investigadores respectivos. Nos exemplos mostrados, o investigador de disparo foi configurado para ser o primeiro investigador (isto é, o investigador mais próximo ao bocal). Os gráficos 1002, 1004, 1006, e 1008, respectivamente, mostram a mudança na variação do atraso de laser para os investigadores 2, 4, 5, e 7 os quais estão localizados a distâncias crescentes do investigador de disparo. Igualmente, os gráficos 1010, 1012, 1014, e 1016, mostram a correspondência da variação do atraso de laser vista nos investigadores 2, 4, 5, e 7, respectivamente, como uma função da fase do sinal de agitação aplicado à corrente de células. Os gráficos ilustram que a variação do atraso de laser, isto é, a variação nos tempos de chegada, aumenta à medida que a distância do investigador primário é aumentada. Os gráficos também ilustram que os atrasos de laser, por exemplo, os tempos de chegada das partículas nas janelas secundárias, estão relacionados à fase do sinal de agitação. Por exemplo, os gráficos 1010-1016 ilustram formas de onda representando o atraso de laser em cada janela secundária como uma função da fase de evento do sinal de agitação. O sinal de agitação pode ser uma forma de onda na forma de uma onda senoidal. Por exemplo, a variação na amplitude da onda de agitação pode ser uma onda senoidal. Os gráficos 1010-1016 mostram ondas senoidais que correspondem à onda senoidal gerada no gerador de agitação que introduz o sinal de agitação na corrente de células. O gráfico 1018 ilustra as partículas 1021 que chegaram antes e as partículas 1022 que chegaram depois do ponto médio da janela estabelecida estatisticamente 1020. As populações 1021 e 1022 correspondente à agregação dos valores selecionados em uma faixa pela cor no topo e na base, respectivamente, das ondas senoidais mostradas nos gráficos 1010-1016. Assim, é observado que a chegada com relação a uma janela estatisticamente estabelecida em um investigador secundário pode ser vista como uma função do sinal de agitação, ou, mais especificamente, da fase do sinal de agitação.

[0088] A figura 11 é o método 1100 para determinar previsivelmen-te a janela de detecção de pulso secundário, de acordo com uma modalidade da presente invenção. Em uma modalidade, o método 1100 pode ser efetuado na etapa de ajuste 616, descrita acima, para ajustar um intervalo de busca e/ou janela de detecção correspondente de pulso secundário.

[0089] Na etapa 1102, a fase do sinal de agitação é determinada com relação à partícula. Por exemplo, a fase do sinal de agitação é determinada, por exemplo, se está na fase positiva ou na fase negativa de uma onda senoidal. Isso pode ser determinado rastreando a fase da onda de agitação e relacionando à partícula no primeiro investigador. Em uma modalidade, a partícula vista no primeiro investigador é relacionada à fase do sinal de agitação sujeito a um atraso predeterminado.

[0090] Na etapa 1104, a janela de detecção de pulso secundário é determinada, de acordo com uma modalidade da presente invenção. Em uma modalidade, uma janela de detecção de pulso secundário estabelecida estatisticamente ou determinada dinamicamente é deslocada com base na fase do sinal de agitação com relação à partícula. Por exemplo, se a partícula está relacionada à parte positiva da onda se-noidal representando o sinal de agitação, então a janela de detecção pode ser adiantada de sua posição corrente, e se a partícula estiver relacionada à parte negativa da onda senoidal representando o sinal de agitação, então a janela de detecção pode ser retardada com respeito à sua posição corrente. Além do mais, em uma modalidade, a largura da janela de detecção pode ser ajustada com base na amplitude da onda senoidal na posição relativa à partícula. Por exemplo, a janela pode ser alargada para amplitudes maiores, estreitada para amplitudes menores.

[0091] A descrição anterior da invenção foi apresentada para os propósitos de ilustração e descrição. Ela não pretende ser exaustiva ou limitar a invenção à forma exposta precisa, e outras modificações e variações podem ser possíveis à luz dos ensinamentos acima. A modalidade foi escolhida e descrita de modo a melhor explicar os princípios da invenção e sua aplicação prática para dessa forma capacitar outros versados na técnica a melhor utilizar a invenção em várias modalidades e várias modificações à medida que são adequadas ao uso particular contemplado. Pretende-se que as reivindicações anexadas sejam interpretadas para incluir outras modalidades alternativas da invenção exceto na medida em que estiverem limitadas pela técnica anterior.

REIVINDICAÇÕES

Claims (10)

1. Método (600) de geração de parâmetros de medição, incluindo um valor de pico de um pulso, para uma amostra de partículas fluindo em um analisador de partículas (100), caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) investigar a amostra de partículas com investigadores ópticos posicionados respectivamente ao longo do comprimento de uma área de investigação (114) ao longo de um trajeto de fluxo, cada investigador consistindo de um par de fontes de luz (116) e um detector correspondente (118), os investigadores compreendendo um investigador de disparo e um ou mais investigadores secundários; (b) gerar pulsos respectivos com bases na investigação de uma primeira partícula da amostra de partículas, em que os pulsos compreendem um pulso disparador (401, 403) correspondendo ao investigador de disparo e um pulso secundário (407, 408, 410, 411) correspondendo a um dos investigadores secundários; (c) determinar uma janela de detecção de pulso primário baseando-se no pulso de disparo; (d) determinar um intervalo de busca, o intervalo de busca sendo um intervalo de tempo no qual o pulso secundário é esperado para ser detectado, para encontrar o pulso secundário baseando-se em fatores incluindo a janela de detecção do pulso primário e um atraso de laser, o atraso de laser sendo um tempo entre a janela de detecção de pulso primário e uma janela de detecção de pulso secundário; (e) ajustar o intervalo de busca para a variação do atraso de laser baseando-se dinamicamente na investigação da primeira partícula; (f) identificar o pulso secundário no intervalo de busca ajustado; e (g) processar o pulso secundário para determinar um valor de pico do pulso secundário em que a etapa de ajustar (e) compreende um dentre: (i) identificar porções do pulso secundário na janela de detecção de pulso secundário, e expandir o intervalo de busca para incluir porções do pulso secundário fora da janela de detecção de pulso secundário; e (ii) se um sinal de agitação é introduzido no fluxo de amostra de partícula, detectar características de um sinal de agitação aplicado à primeira partícula, e mudar a janela de detecção de pulso secundário com base em fatores incluindo a janela de detecção de pulso primário e as características do sinal de agitação.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende (h) processar o pulso secundário para determinar um valor de largura do pulso do pulso secundário.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de ajustar (e) compreende a etapa (e)(i) em que a duração da janela de detecção de pulso secundário substancialmente equivale a uma duração da janela de detecção do pulso primário mais a extensão de janela predeterminada.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de ajustar (e) compreende a etapa (e)(i) em que a etapa de processar o pulso secundário (g) compreende: (g)(i) determinar um valor de pico inicial para o pulso secundário com base em porções do pulso secundário dentro da janela de detecção de pulso secundário; (g)(ii) detectar o pulso secundário em um limiar predeterminado do valor de pico inicial; e (g)(iii) armazenar repetitivamente o valor detectado mais elevado para o pulso secundário.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as etapas (g)(ii) e (g)(iii) são realizadas durante o reprocessamento do pulso secundário.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de determinar um intervalo de busca (d) compreende: determinar um momento de ocorrência para a janela de detecção do pulso primário (203); determinar um atraso de laser entre o investigador de disparo e o investigador secundário; e calcular um momento de ocorrência para a janela de detecção de pulso secundário com base no momento de ocorrência para a janela de detecção do pulso primário e no atraso de laser.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a etapa de determinar um intervalo de busca (d) ainda compreende: determinar a duração da janela de detecção do pulso primário; e estabelecer a duração da janela de detecção de pulso secundário com base na duração da janela de detecção do pulso primário.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) compreende: detectar uma primeira e segunda posição no pulso de disparo correspondente a um limiar de pulso predeterminado; e determinar a janela de detecção do pulso primário com base nas primeiras e segundas posições.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sinal de agitação é uma onda senoidal. 19. Método, de acordo com a reivindicação 1, ainda com- preendendo a etapa de: (i) reportar o valor de pico do pulso secundário.

10. Analisador de partículas (100) para partículas fluindo, caracterizado pelo fato de que compreende: pelo menos um processador (102); um investigador de partículas (105) acoplado a pelo menos um processador (102) e configurado para: investigar uma amostra de partículas fluindo no anali-sador de partículas (100) com investigadores posicionados respectivamente ao longo do comprimento de uma área de investigação (114) ao longo de um trajeto de fluxo das partículas, os investigadores compreendendo um investigador de disparo e um ou mais investigadores secundários; cada investigador consistindo de um par de fontes de luz (116) e um detector correspondente (118); e o investigador de partícula (105) ainda compreendendo um gerador de pulso elétrico (120) configurado para gerar pulsos respectivos com base na investigação de uma primeira partícula da amostra de partículas, em que os pulsos compreendem um pulso disparador correspondente ao investigador de disparo (401, 403) e um pulso secundário (407, 408, 410, 411) correspondente a um dos investigadores secundários; e o analisador de partículas (100) ainda compreendendo: um analisador de pulsos (106) acoplado a pelo menos um processador e compreendendo: um criador de janela de detecção de pulso primário configurado para: determinar uma janela de detecção de pulso primário com base no pulso de disparo; um criador de janela de detecção de pulso secundário (506); um gerador de parâmetro de pulso secundário (508) confi- gurado para: identificar o pulso secundário; e processar o pulso secundário para determinar um valor de pico do pulso secundário, caracterizado pelo fato de que o criador de janela de detecção de pulso secundário (506) é configurado para: determinar um intervalo de busca, o intervalo de busca sendo um intervalo de tempo no qual o pulso secundário é esperado para ser detectado, para encontrar o pulso secundário com base em fatores incluindo a janela de detecção do pulso primário e um atraso de laser, o atraso de laser sendo o tempo entre a janela de detecção do pulso primário e uma janela de detecção de pulso secundário; e ajustar o intervalo de busca para a variação do atraso de laser baseando-se dinamicamente na investigação da primeira partícula; e o gerador de parâmetro de pulso secundário (508) é configurado para: identificar o pulso secundário em um intervalo de busca ajustado; em que a etapa de ajuste (e) compreende um dentre: (i) identificar porções do pulso secundário na janela de detecção de pulso secundário, e expandir o intervalo de busca para incluir porções do pulso secundário fora da janela de detecção de pulso secundário; e (ii) em que o analisador compreende um gerador de agitação (124), detectando características de um sinal de agitação aplicado à primeira partícula, e mudar a janela de detecção de pulso secundário com base em fatores incluindo a janela de detecção primária e as características do sinal de agitação.