CN103179940B - 提供牙齿洁白外观的方法和材料 - Google Patents
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Abstract
本文提供了用于提供牙齿洁白外观的方法和材料。例如，提供了方法和材料用于将一种或多种荧光发射多肽（例如蓝色荧光蛋白（BFP））接触牙齿以提供牙齿更白外观。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求2010年8月24日提交的美国临时申请第61/376,523号的权益。在先申请的公开内容被认为是本申请公开的部分内容（且通过引用纳入本文）。
背景技术
1.技术领域
本文涉及参与提供牙齿洁白外观的方法和材料。例如，本文涉及用一种或多种荧光发射多肽（例如蓝色荧光蛋白（BFP））接触牙齿以提供牙齿具有更白外观的方法和材料。
2.背景信息
总的来说，认为白色的牙齿是美容上所需要的。然而，在没有介入的情况下牙齿会变色。引起呈现有色外观的牙齿结构通常是釉质层。很多因素会导致釉质变色。例如，牙齿表面形成的菌斑和牙垢基质会包围污点，因此导致釉质变色。
已研发非处方牙齿增白制品来解决该美容偏好以使被表面包埋物质变色的牙齿釉质恢复光泽。虽然所有的洁齿剂和漱口水含有一些清洁和抛光剂，但一些釉质沉积物变得很顽固，正常使用情况下通过这些试剂无法对其完全去除。吸烟者的釉质经常变色，因为吸入香烟中的焦油和颗粒聚集在牙齿上。在一些情况下，食物和饮料（例如茶）会对牙齿釉质染色或变色。
发明内容
本申请提供了用于提供牙齿洁白外观的方法和材料。例如，本申请提供用一种或多种荧光发射多肽（例如蓝色荧光蛋白（BFP））接触牙齿来提供牙齿更白外观的方法和材料。如本文所述，在使荧光发射多肽直接或间接结合或附着牙齿的条件下，荧光发射多肽（例如BFP多肽）可施加于牙齿。在该情况下，荧光发射多肽可在特定波长发射荧光。在BFP多肽的情况下，BFP多肽可在约440nm-约500nm的范围（例如约450nm-约490nm）发射荧光，其中当从牙齿发射时给予牙齿白色外观。即使当下方的牙齿不是天然地那么白时，该白色外观也可出现。例如，本文提供的方法和材料可使人具有呈现白色的牙齿，即使该牙齿可能被着色。因此，可使用本文提供的方法和材料获得洁白外观的牙齿，不需要刺激的漂白（例如不需要牙齿漂白处理，例如那些包括过氧化氢或过氧化脲的处理）或脱色技术。
总的来说，本文的一个方面阐述了一种改变牙齿外观的方法。该方法包括对牙齿施加荧光发射多肽或基本上由其组成，其中由荧光发射多肽发射的荧光改变牙齿的外观。该牙齿可以是人的牙齿。该方法可包括改变牙齿外观从而牙齿看上去更白。荧光发射多肽可以是BFP多肽。荧光发射多肽能偶联某一分子，该分子具有与牙齿或牙齿组分相互作用或与之结合的能力。该分子可以是多肽。该分子可以是酪蛋白多肽。该分子可以是富酪蛋白（statherin）多肽。该分子可以是具有与釉质、羟基磷灰石或获得性牙齿膜相互作用或与之结合能力的分子。荧光发射多肽可以是酪蛋白多肽氨基酸序列的融合多肽。荧光发射多肽可以是包含富酪蛋白多肽氨基酸序列的融合多肽。荧光放射多肽可以存在于牙膏中，并且施加步骤可包括将该牙膏施加于牙齿。荧光发射多肽可以是聚合物的一个单位，该聚合物包含两个或多个荧光放射多肽。该聚合物可以与酪蛋白多肽结合以形成复合物，其中将该复合物施加于牙齿。
在另一个方面，本文阐述了一种组合物，该组合物包含荧光发射多肽和酪蛋白多肽或基本上由其组成。
在另一个方面，本文阐述了一种组合物，该组合物包含荧光发射多肽和富酪蛋白多肽或基本上由其组成。
在另一方面，本文阐述一种嵌合多肽，该嵌合多肽包含荧光放射多肽的20或更多个残基长度的氨基酸序列以及酪蛋白多肽的20或更多个残基长度的氨基酸序列或基本由其组成。该嵌合多肽可包含全长荧光放射多肽或其片段，该片段与全长荧光发射多肽至少越90％相同。该嵌合多肽可包含全长酪蛋白多肽或其片段，该片段与全长酪蛋白多肽至少约80％相同。该嵌合多肽可包含发射荧光的能力和与牙齿或牙齿组分相互反应或与之结合的能力。
在另一方面，本文阐述一种嵌合多肽，该嵌合多肽包含荧光放射多肽的20或更多个残基长度的氨基酸序列以及富酪蛋白多肽的20或更多个残基长度的氨基酸序列或基本由其组成。该嵌合多肽可包含全长荧光放射多肽或其片段，该片段与全长荧光发射多肽至少约90％相同。该嵌合多肽可包含全长富酪蛋白多肽或其片段，该片段与约全长富酪蛋白多肽至少约80％相同。该嵌合多肽可包含发射荧光的能力和与牙齿或牙齿组分相互反应或与之结合的能力。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。虽然在本发明的实施或测试中可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但是下面描述了合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用全文纳入本文。在抵触的情况下，以本说明书（包括定义在内）为准。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性，并不构成限制。
从下面的详述和所附权利要求很容易了解本发明的其他特征和优点。
附图说明
图1是编码示例性BFP多肽（GenBank登录号：U70497.1；GINo.1619752）的核酸序列表(SEQIDNO:1)。
图2是示例性BFP多肽（GenBank登录号：AAB16959.1;GINo.1619753）的氨基酸序列表(SEQIDNO:2)。
图3是编码示例性α-酪蛋白多肽（GenBank登录号：NM_181029.2;GINo.31341348）的核酸序列表(SEQIDNO:3)。
图4是示例性α-酪蛋白多肽（GenBank登录号：851372.1;GINo.30794348）的氨基酸序列表(SEQIDNO:4)。
图5是编码示例性β-酪蛋白多肽（GenBank登录号：BC111172.1;GINo.83406092）的核酸序列表(SEQIDNO:5)。
图6是示例性β-酪蛋白多肽（GenBank登录号：AAI11173.1;GINo.83406093）的氨基酸序列表(SEQIDNO:6)。
图7是编码示例性富酪蛋白多肽（GenBank登录号：AAH67219.1;GINo.45501309）的核酸序列表(SEQIDNO:7)。
图8是示例性富酪蛋白多肽（GenBank登录号：BC067219.1;GINo.45501308）的氨基酸序列表(SEQIDNO:8)。
图9是示例性BFP多肽的氨基酸序列表(SEQIDNO:9)。
图10包含牙齿在初始（左），施加β-酪蛋白/BFP多肽偶联物后（中），和浮石研磨后（右）的照片。经施加β-酪蛋白/BFP多肽偶联物后，牙齿相比初始显示更白的外观。该更白的外观在浮石研磨后失去。
具体实施方式
本文提供了用于提供牙齿洁白外观的方法和材料。例如，本文提供用一种或多种荧光发射多肽（例如蓝色荧光蛋白（BFP））接触牙齿来提供牙齿更白外观的方法和材料。
如本文所述，可对牙齿施加荧光发射多肽从而荧光从牙齿发射。可对牙齿施加任何合适的荧光发射多肽。例如，当需要拥有更白外观的牙齿时，可对人的牙齿施加发射蓝色荧光的多肽。该蓝色荧光的发射波长可为约440nm-约500nm（例如约450nm-约500nm、约460nm-约500nm、约470nm-约500nm、约480nm-约500nm、约440nm-约490nm、约440nm-约480nm、约440nm-约470nm、约440nm-约460nm、约450nm-约490nm、或约460nm-约480nm）。在一些情况下，可根据本文所述对牙齿施加荧光发射多肽，该荧光发射多肽在以下发射波长发射荧光：约420nm-约450nm、约430nm-约450nm、约440nm-约450nm、约420nm-约440nm、约485nm-约505nm。
当需要具有不同颜色的牙齿时，可对人的牙齿施加发射红色、绿色或黄色光谱的荧光的多肽。红色荧光的发射波长可为约555nm-约655nm（例如，约565nm-约645nm、约575nm-约635nm或约585nm-约625nm）。绿色荧光的发射波长可为约500nm-约525nm（例如，约505nm-约520nm或约510nm-约515nm）。黄色荧光的发射波长可为约525nm-约555nm（例如，约530nm-约550nm或约535nm-约545nm）。在一些情况下，可对人的牙齿施加不同荧光发射多肽的组合。例如，可对人的牙齿施加BFP多肽和红色荧光蛋白(RFP)多肽的组合。在一些情况下，可对人的牙齿施加RFP多肽和绿色荧光蛋白（GFP）多肽的组合。
可根据本文所述使用任何合适的BFP多肽。根据本文所述可使用的BFP多肽的示例包括但不限于：EBFP（例如最大发射为460nm的EBFP）、荧光蛋白SBFP1（登录号：ABM97856；GI号：124264536）、荧光蛋白SBFP2（登录号：ABM97857,GI号：124264538）、EBFP2(登录号：EF517318,GI号：145666498)、Azurite(Mena等,NatureBiotechnology,24:1569-1571(2006))、mKalama1(登录号：EF517317,GI号：145666496)、锌指蛋白383（登录号：EDU39924.1,GI号：187972425）、示于美国专利号7,166,424的SEQIDNO:445(登录号：ABN30727.1；GI号：125148618)、可溶修饰型蓝色荧光蛋白(smBFP)(登录号：U70497.1；GI号：1619752)、具有登录号：CAE00365.1(GI号：32260521)所示序列的多肽、具有登录号：CAE00361.1(GI号：32260509)所示序列的多肽、具有登录号：CAE00361.1(GI号：32260509)所示序列的多肽、ECFP多肽（登录号；ACO48275.1;GI号：226331138）、天蓝色多肽(登录号：ADE48834.1；GI号：293612838)、荧光蛋白Cypet多肽(登录号：3GEX_A；GI号：290789997)、MiCy多肽(登录号：ADE48830.1；GI号：293612833)、和mTFP1荧光蛋白多肽(登录号：ACO48263.1；GI号：226320339)。在一些情况下，根据本文所述可使用美国专利申请号2010/0062460所示的BFP多肽。
可根据本文所述使用任何合适的RFP多肽和GFP多肽。根据本文所述可使用的RFP多肽的示例包括但不限于可溶修饰型红移型绿色荧光蛋白（smSGFP）多肽（登录号：U70496.1；GI号：1619750）、具有登录号：AAG16224.1(GI号：10304307)所示序列的红色荧光蛋白多肽、ABO38175.1(GI号：133753343)、或AAU06852.1(GI号：51593130)、发橙光的Gfp-样蛋白多肽(登录号：2ZMW_D；GI号：209870302)、橘红色(mOrange)荧光蛋白多肽(登录号：ACO48285.1；GI号：226331152)、NLS-dTomato)多肽(登录号：ADC42843.1；GI号：288188779)、红色荧光蛋白tdTomato多肽(登录号：ACQ43939.1；GI号：228484713)、DsRed多肽(登录号：BAE53441.1GI号：83016748)、DsRed2多肽(登录号：AAV73970.1；GI号：56119204)、DsRed-Express多肽(登录号：ACU30027.1；GI号：255689290)、DsRed-单体（DsRed-Monomer）多肽(登录号：ACF35425.1；GI号：194245628)、单体橙红色荧光蛋白多肽(登录号：AAV52170.1；GI号：55420625)、单体橙红色荧光蛋白多肽(登录号：AAV52166.1；GI号：55420617)、mCherry多肽(登录号：ACY24904.1；GI号：262089840)、具有美国专利号7,393,923所示氨基酸序列SEQIDNO:3的多肽(登录号：ACH06540.1；GI号：197013979)和具有美国专利号7,393,923所示氨基酸序列SEQIDNO:5的多肽(登录号：ACH06541.1；GI号：197013980)。
根据本文所述可使用的GFP多肽的示例包括但不限于可溶修饰型绿色荧光蛋白（smGFP）多肽（登录号：U70495.1;GI号：1619748）、修饰型绿色荧光蛋白GFP-ER(mfgp4-ER)多肽(登录号：U87625.1；GI号：1842446)、GFP多肽(登录号：ACJ06700.1,GI号：210076685)、增强型GFP多肽(登录号：ACV20892.1；GI号：256708579)、turboGFP多肽(登录号：ADD23343.1；GI号：290131407)、VisGreenGFP多肽(登录号：ABR26680.1；GI号：149393496)、和Azami-绿色（Azami-Green）多肽(登录号：BAD52001.1；GI号：52839539)。
在一些情况下，可根据本文所述使用荧光发射多肽，例如Subach等（Chem.Biol.,15:1116-1124(2008))所述的那些。也可参见登录号：3M24_A(GI号：296863586)、登录号：3M24_B(GI:296863587)、登录号：3M24_C(GI:296863588)、和登录号：3M24_D(GI:296863589)。根据本文所述可使用的其它荧光发射多肽示例包括但不限于他处(Alieva等，PLoSONE,3(7):e2680(2008)和Chudafov等,Physiol.Rev.,90:1103-1163(2010))所述的那些。例如参见Alieva等参考文献的表1和Chudafov等参考文献的图5、10、12、和14。在一些情况下，可根据本文所述使用珊瑚荧光发射多肽。在一些情况下，可根据本文所述使用一种荧光发射多肽，该多肽具有图2或图9所示的氨基酸序列或具有图1所示序列编码的氨基酸序列。
可使用任何合适的方法来制备荧光发射多肽。例如，可使用多肽表达技术（例如，使用细菌细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞的异源表达技术）来制备荧光发射多肽。在一些情况下，可根据他处（Yakhnin等,ProteinExpr.Purif.,14:382-386(1998)和Jain等,J.ChromatographyA,1035:83-86(2004)）所述制备荧光发射多肽（例如BFP多肽）。在一些情况下，可使用标准多肽合成技术（例如，液相多肽合成技术或固相多肽合成技术）来合成制备荧光发射多肽。
可通过一种分子（例如多肽）将荧光发射多肽结合或附着牙齿，该分子具有与牙齿或牙齿组分（例如，釉质、羟基磷灰石、获得性牙齿膜、牙骨质、牙冠、牙颈、牙骨质与釉质交接处或牙根尖）互相作用或与之结合的能力。例如，荧光发射多肽可与多肽（酪蛋白多肽、富酪蛋白多肽或其片段）共价或非共价结合。根据本文所述可使用的酪蛋白多肽示例包括但不限于：α-酪蛋白多肽（例如α-Sl酪蛋白多肽和α-S2酪蛋白多肽）、β-酪蛋白多肽（例如A1β-酪蛋白多肽和A2β-酪蛋白多肽）、γ-酪蛋白多肽（例如γ1-酪蛋白多肽、γ2-酪蛋白多肽和γ3-酪蛋白多肽）、δ-酪蛋白多肽和ε-酪蛋白多肽。在一些情况下，可根据本文所述使用酪蛋白多肽，该多肽具有图4或6所示的氨基酸序列或者图3或5所示序列编码的氨基酸序列。
在一些情况下，酪蛋白多肽可以是部分的全长酪蛋白多肽，前提是该部分具有与牙齿或牙齿组分相互作用或与之结合的能力。例如，根据本文所述可使用的酪蛋白多肽可以是包含酪蛋白多肽的阴离子结构域（例如：全长牛α-S1酪蛋白多肽的氨基酸残基59-79、全长牛α-S2酪蛋白多肽的氨基酸残基2-20或全长牛β酪蛋白多肽的氨基酸残基1-25）的多肽。
在一些情况下，酪蛋白多肽可以是(a)由全长牛α-S1酪蛋白多肽的氨基酸残基59-79组成的多肽、(b)长度不超过50个氨基酸残基（例如，长度不超过45、40、35、30或25个氨基酸残基）的多肽，前提是该多肽包含全长牛α-S1酪蛋白多肽的氨基酸残基59-79、或(c)包含全长牛α-S1酪蛋白多肽的氨基酸残基59-79的多肽，该多肽相比全长牛α-S1酪蛋白多肽的氨基酸残基59-79具有0、1、2、3、4、5或6个氨基酸取代。在一些情况下，酪蛋白可以是(a)由全长牛β酪蛋白多肽的氨基酸残基1-25组成的多肽、(b)长度不超过50个氨基酸残基（例如，长度不超过45、40、35、或30个氨基酸残基）的多肽，前提是该多肽包含全长牛β酪蛋白多肽的氨基酸残基1-25、或(c)包含全长牛β酪蛋白多肽的氨基酸残基1-25的多肽，该多肽相比全长牛β酪蛋白多肽的氨基酸残基1-25具有0、1、2、3、4、5或6个氨基酸取代。在一些情况下，酪蛋白多肽可制备（例如合成）成包含一个或多个半胱氨酸残基以促进酪蛋白多肽与荧光发射多肽（例如，BFP多肽）的偶联。
根据本文所述可使用的酪蛋白多肽能具有自然存在于任何哺乳动物类型的氨基酸序列。例如，根据本文所述可使用的酪蛋白多肽能具有氨基酸序列，该氨基酸序列自然存在于人、牛、山羊、绵羊、马、小鼠、大鼠、猴、狗、猫、猩猩、黑猩猩、猪、马、象、或负鼠。在一些情况下，将牛酪蛋白多肽与荧光发射多肽偶联以形成酪蛋白多肽/荧光发射多肽偶联物，该偶联物具有与牙齿或牙齿组分相互作用或与之结合的能力。
根据本文所述可使用的富酪蛋白多肽示例包括但不限于：人富酪蛋白多肽，牛富酪蛋白多肽和唾液富酪蛋白。在一些情况下，富酪蛋白多肽可以是部分的全长富酪蛋白多肽，前提是该部分具有与牙齿或牙齿组分相互作用或与之结合的能力。例如，根据本文所述可用的富酪蛋白多肽可以是包含富酪蛋白多肽高度负结构域（例如全长人富酪蛋白多肽的氨基酸残基1-15）的多肽。
在一些情况下，富酪蛋白可以是(a)由全长人富酪蛋白多肽的氨基酸残基1-15组成的多肽、(b)长度不超过50个氨基酸残基（例如，长度不超过45、40、35、25、或20个氨基酸残基）的多肽，前提是该多肽包含全长人富酪蛋白多肽的氨基酸残基1-15、或(c)包含全长人富酪蛋白多肽的氨基酸残基1-15的多肽，该多肽相比全长人富酪蛋白多肽的氨基酸残基1-15具有0、1、2、3、4或5个氨基酸取代。在一些情况下，富酪蛋白多肽可以是(a)由全长人富酪蛋白多肽的氨基酸残基1-25组成的多肽、(b)长度不超过50个氨基酸残基（例如，长度不超过45、40、35或30个氨基酸残基）的多肽，前提是该多肽包含全长人富酪蛋白多肽的氨基酸残基1-25、或(c)包含全长人富酪蛋白多肽的氨基酸残基1-25的多肽，该多肽相比全长人富酪蛋白多肽的氨基酸残基1-25具有0、1、2、3、4、5或6个氨基酸取代。在一些情况下，富酪蛋白多肽可以是(a)由全长人富酪蛋白多肽的氨基酸残基19-43组成的多肽、(b)长度不超过50个氨基酸残基（例如，长度不超过45、40、35、30或25个氨基酸残基）的多肽，前提是该多肽包含全长人富酪蛋白多肽的氨基酸残基19-43、或(c)包含全长人富酪蛋白多肽的氨基酸残基19-43的多肽，该多肽相比全长人富酪蛋白多肽的氨基酸残基19-43具有0、1、2、3、4、5或6个氨基酸取代。在一些情况下，可以用带负电残基（例如天冬氨酸）替代一个或多个带负电磷酸丝氨酸残基制备（例如合成）富酪蛋白多肽。在一些情况下，富酪蛋白多肽可制备（例如合成）成包含一个或多个半胱氨酸残基以促进富酪蛋白多肽与荧光发射多肽（例如，BFP多肽）的偶联。
根据本文所述可使用的富酪蛋白多肽能具有自然存在于任何哺乳动物类型的氨基酸序列。例如，根据本文所述可使用的富酪蛋白多肽能具有某一氨基酸序列，该氨基酸序列自然存在于人、牛、山羊、绵羊、马、小鼠、大鼠、猴、狗、猫、猩猩、黑猩猩、猪、马、象、或负鼠。在一些情况下，人富酪蛋白多肽与荧光发射多肽偶联以形成富酪蛋白多肽/荧光发射多肽偶联物，该偶联物具有与牙齿或牙齿组分相互作用或与之结合的能力。在一些情况下，可根据本文所述使用富酪蛋白多肽，该多肽具有图8所示的氨基酸序列或图7所示序列编码的氨基酸序列。
可使用任何合适的方法来制备多肽，该多肽具有与牙齿或牙齿组分相互作用或与之结合的能力。例如，可使用多肽表达技术（例如，使用细菌细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞的异源表达技术）来制备多肽，该多肽具有与牙齿或牙齿组分相互作用或与之结合的能力。在一些情况下，可根据他处（美国专利号7,666,996、6,797,810、6,558,717、6,121,421、6,080,844、5,834,427和4,713,254，以及美国专利申请公开号2009/0074680和2010/0144598）所述来制备具有与牙齿或牙齿组分相互作用或与之结合能力的多肽，例如酪蛋白多肽或富酪蛋白多肽。在一些情况下，可使用标准多肽合成技术（例如液相多肽合成技术或固相多肽合成技术）来合成制备具有与牙齿或牙齿组分相互作用或与之结合能力的多肽。
可使用任何合适的方法将荧光发射多肽共价或非共价地与一种分子（例如多肽）结合，该分子具有与牙齿或牙齿组分相互作用或与之结合的能力。例如，可用化学方法通过一个或多个配位共价键、共价键、二硫键、高能键、氢建、离子键或肽键将荧光发射多肽（例如BFP多肽）与酪蛋白多肽和/或富酪蛋白多肽偶联。在一些情况下，可通过化学方法将荧光发射多肽与存在于多肽上的胺基偶联，该多肽具有与牙齿或牙齿组分相互作用或与之结合的能力（例如，酪蛋白多肽和/或富酪蛋白多肽）。该胺基可位于多肽的N端、C端或多肽的N端和C端之间。
在一些情况下，待偶联的多肽可在偶联前活化。例如，可通过引入活性巯基来活化多肽（例如，酪蛋白多肽或富酪蛋白多肽）。对于富酪蛋白多肽，例如，可通过在化学合成期间向多肽添加半胱氨酸残基来完成。对于酪蛋白多肽，可根据他处（McCall等,BioconjugateChem.,1:222-226(1990)）所述通过与2-亚氨基四氢噻吩（例如特劳特试剂（Traut’sreagent））反应将酪蛋白多肽巯基化。在α-和β-酪蛋白多肽的情况中，能与特劳特试剂反应的多肽上可存在多个胺基（例如，N端和赖氨酸）。可改变反应条件来最大化用一个或多个巯基活化的分子得率以减少偶联可能干扰牙齿结合的可能性。可根据他处（Lacy等,AnalyticalBiochemistry,382:66-68(2008)）所述采用灵敏的荧光试验测定巯基的引入程度。
可通过多肽的胺与包含马来酰亚胺基团和活性N-羟基琥珀酰亚胺酯的双功能试剂反应，用一个或多个马来酰亚胺基团取代荧光发射多肽。然后可将被马来酰亚胺取代的荧光发射多肽偶联到多肽的巯基上，该多肽具有与牙齿或牙齿组分相互作用或与之结合的能力。可根据他处（Singh,BioconjugateChem.,5:348-351(1994)）所述改变被马来酰亚胺基团取代的荧光发射多肽程度。
可用于偶联荧光发射多肽与分子（例如多肽）的其他偶联方法示例包括但不限于他处（例如，Hermanson,G.T.，BioconjugateTechniques（《生物偶联技术》），第二版，2008，埃尔斯威尔公司(Elsevier)）所述的那些，其中该分子具有与牙齿或牙齿组分相互作用或与之结合的能力。例如参见第I部分第4节和第II部分第5节。
在一些情况下，可通过连接多个荧光发射多肽与单个分子（例如多肽）来增强使用本文所提供方法获得的荧光信号，其中该分子具有与牙齿或牙齿组分相互作用或与之结合的能力。因为位阻效应，该放大效应可通过以下方法有效完成：首先制备含有多个荧光发射多肽的聚合物，然后将该聚合物与分子（例如酪蛋白多肽）连接，该分子具有与牙齿或牙齿组分相互作用或与之结合的能力。可用于形成含有多个荧光发射多肽的聚合物的方法（如聚合方法）示例包括但不限于他处（例如，例如，Hermanson,G.T.，BioconjugateTechniques（《生物偶联技术》），第二版，2008，埃尔斯威尔公司(Elsevier)）所述的那些。例如可参见第II部分第25节。
在一些情况下，荧光发射多肽可制备为融合或嵌合多肽，具有能与牙齿或牙齿组分相互作用或与之结合的多肽。例如，可使用异源多肽表达技术或合成多肽合成技术来生产单一多肽链，该单一多肽链具有荧光发射多肽的氨基酸序列和具有与牙齿或牙齿组分相互作用或与之结合能力的多肽的氨基酸序列。在一些情况下，该单一多肽链可具有(a)荧光发射多肽的氨基酸序列，然后是具有与牙齿或牙齿组分相互作用或与之结合能力的多肽的氨基酸序列，或(b)具有与牙齿或牙齿组分相互作用或与之结合能力的多肽的氨基酸序列，然后是荧光发射多肽的氨基酸序列。在一些情况下，单一多肽链可具有一个或多个（例如，1、2、3、4或5个）氨基酸序列，其中每个序列编码一种荧光发射多肽；并可具有一个或多个（例如，1、2、3、4或5个）氨基酸序列，其中每个序列编码具有与牙齿或牙齿组分相互作用或与之结合能力的多肽。
在一些情况下，本文提供的融合或嵌合多肽可包含其它氨基酸序列（例如间隔子或结合残基）。例如，含有荧光发射多肽的氨基酸序列和具有与牙齿或牙齿组分相互作用或与之结合能力的多肽氨基酸序列的融合或嵌合多肽可包含一个或多个额外氨基酸残基，例如甘氨酸、赖氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、脯氨酸、组氨酸、缬氨酸、丝氨酸、酪氨酸、鸟氨酸、牛磺酸、焦赖氨酸（pyrolysine）或硒代半胱氨酸（seleocysteine）残基、或氨基酸衍生物（例如5-羟色氨酸（5-hydroxytryptophan）、L-二羟基苯丙氨酸或α-二氟甲基鸟氨酸）。该额外氨基酸残基可设计成间隔子（例如5个或更多甘氨酸残基链）或设计成使多肽或其它分子以化学方法偶联到融合或嵌合多肽上。例如，含有荧光发射多肽的氨基酸序列和具有与牙齿或牙齿组分相互作用或与之结合能力的多肽氨基酸序列的融合或嵌合多肽可包含1、2、3、4、5或更多个额外赖氨酸残基从而一个或多个具有与牙齿或牙齿组分相互作用或与之结合能力的多肽（例如酪蛋白多肽和/或富酪蛋白多肽）可通过化学方法偶联到融合或嵌合多肽上。
可对牙齿施加本文提供的包含荧光发射多肽的组合物（例如，包含荧光发射多肽、荧光发射多肽/酪蛋白多肽偶联物、荧光发射多肽/富酪蛋白多肽偶联物、荧光发射多肽/酪蛋白多肽融合多肽、和/或荧光发射多肽/富酪蛋白多肽融合多肽的组合物）以改变该牙齿的外观。例如，可对牙齿施加本文提供的包含BFP多肽（例如，BFP多肽/富酪蛋白多肽偶联物）的组合物以给予该牙齿更白的外观。可使用任何合适的方法来向牙齿递送本文提供的组合物。例如，可将本文提供的组合物纳入牙膏、漱口水、饮料、食品、口香糖、凝胶、粉末或乳膏。
在一些情况下，可将有效量的本文所提供组合物递送到牙齿从而改变该牙齿的外观（例如，该牙齿的外观变得更白）。有效量的本文所提供组合物可以是改变牙齿外观而不诱导显著毒性的任何量。例如，本文提供的组合物可以每克牙膏产生约0.0001mg-约100mg（例如，约0.001mg-约100mg、约0.01mg-约100mg、约0.1mg-约100mg、约0.5mg-约100mg、约0.5mg-约50mg、约0.5mg-约25mg、约1mg-约100mg、约1mg-约50mg或约1mg-约25mg）荧光发射多肽的量纳入牙膏制品。
在一些情况下，可将本文提供的组合物在清洗、吞咽或移除前对牙齿施加一段时间从而改变牙齿的外观（例如，该牙齿外观变得更白）。例如，配置成包含本文所述荧光发射多肽的牙膏可施加于牙齿并保持与那些牙齿接触30秒-10分钟（比如，30秒-5分钟、30秒-2.5分钟、30秒-2分钟、1分钟-10分钟、2分钟-10分钟或1分钟-5分钟）不冲洗。
在一些情况下，可在递送本文提供的组合物前预备人的牙齿。例如，可在递送本文提供的组合物前清洗、刷洗或抛光（例如用浮石抛光）人的牙齿。在一些情况下，可用一种或多种能暴露磷酸钙结合部位的试剂处理待处理的单个牙齿或多个牙齿表面。例如，用本文所提供组合物处理的牙齿可接触EDTA或磷酸以暴露牙齿上存在的磷酸钙结合部位。在磷酸处理的情况中，只可将牙釉质暴露于酸以防止或减少软组织损伤的风险。
在一些情况下，可使用两种或多种步骤方法将荧光发射多肽施加于牙齿。例如，可将包含具有与牙齿或牙齿组分相互作用或与之结合能力的分子（例如多肽）的组合物递送到待处理的牙齿，将上述处理作为一个步骤，后续步骤是递送具有与所递送分子相互作用或与之结合能力的荧光发射多肽。在一些情况下，可使用含有与荧光发射多肽分开的分子的单一组合物或使用单独组合物（其中一种组合物含有分子且另一种组合物含有荧光发射多肽）同时实施这两个步骤。
在一些情况下，可进行试验确定本文提供的组合物或本文提供的组合物组分（例如酪蛋白多肽）具有对牙齿或牙齿组分的结合亲和性。例如，待测试的物质可与羟基磷灰石（HA）基质一起孵育，可将HA结合后溶液中的物质含量与初始浓度作比较，从而通过差异来测定结合物质的量。例如参见Raj等,J.Biol.Chem.,267:5968-5976(1992)。在一些情况下，用EDTA溶解HA基质后能直接测定HA结合的物质（Lamkin等,J.Dent.Res.,75:803-808(1996)）。在多肽物质的情况中，可使用二辛可宁酸试验和/或邻-苯二醛胺试验来测定溶液中的多肽浓度。可使用朗格缪尔模型（Bouropoulos和Moradian-Oldak,Calcif.TissueInt.,72:599-603(2003))）来测定结合常数。在一些情况下，可根据他处所述（Lamkin等,J.Dent.Res.,75:803-808(1996)）用HA基质进行试验，该基质用人唾液预孵育以将蛋白涂覆HA。在一些情况下，可通过清洗去除未结合的唾液蛋白，因为其存在可能干扰多肽的浓度测定。
可使用任何合适的方法评估本文提供的组合物对牙齿或HA基质的亲和性。例如，可通过测定组合物的荧光发射多肽的荧光来定量结合和未结合的组合物。利用荧光来定量的能力可在人唾液存在下测定组合物与HA的结合。在一些情况下，可评估本文提供的组合物在体外结合人牙齿的能力。该牙齿可接受不同程度的清洁，例如用浮石刷洗或抛光。然后可用人唾液处理该牙齿以形成获得性牙齿膜并在有和没有唾液的情况下用本文提供的组合物孵育。可通过测量结合和未结合的荧光来测定与牙齿的结合。可使用温和的方法完成从牙齿提取结合的荧光发射多肽。例如，可根据他处所述（Siqueira和Oppenheim,ArchivesofOralBiology,54:437-444(2009)）用滤纸采集条擦拭牙齿，并在温和的条件下从纸中提取多肽。在一些情况下，可通过荧光显微方法分析牙齿来评估不同情况下结合的荧光发射多肽的相对量。
可使用任何合适的方法来评估本文提供的组合物对于改变牙齿外观的能力。例如，可使用视觉检查技术来测定本文提供的组合物是否能改变牙齿的外观。该视觉检查技术可包括如他处（Paravina等,J.Esthet.Restor.Dent.,19:276-283(2007)）所述使用色板（shadeguide）进行对比。在一些情况下，可使用反射分光光度计测定本文提供的组合物改变牙齿外观（如使牙齿看上去更白）的能力。该情况下，可用白色光源照射牙齿，并分析反射分光光度计（比色法）在不同波长所吸收的光量。然后可用过滤自光源的UV光重复这些测定。包含和排除UV光的情况下所得反射值的差异是牙齿表面的UV荧光谱（例如，可参见Park等,M.DentalMaterials,23:731-735(2007)）。
本文提供的组合物对于使用该组合物的人具有低毒性风险，可以含有一种或多种人来源的多肽，可含有一种或多种天然存在于食品或饮料产品中的多肽，和/或缺少潜在的毒性染料。
以下实施例进一步描述了本发明，这些实施例不限制权利要求书所述的本发明范围。
实施例
实施例1－获得酪蛋白多肽混合物的方法
将酪蛋白、α-酪蛋白和β-酪蛋白与胰蛋白酶反应来生产各酪蛋白磷酸肽（酪蛋白-PP、α-酪蛋白PP和β-酪蛋白PP）。胰蛋白酶和三种酪蛋白购自西格玛奥德里奇公司（Sigma-Aldrich）。用于这些制备的方法改良自他处（Reynolds等,Anal.Biochem.,217:277-284(1994)）所述的那些。简单来说，在含有60mg多肽、0.05MTris缓冲液(pH8)和1.2mg、0.6mg或0.3mg胰蛋白酶的3mL反应中，对酪蛋白、α-酪蛋白和β-酪蛋白多肽进行水解。使该反应在室温下（21°C）过夜进行，此时用1M盐酸将反应混合物调至pH4.6。通过离心（12,000xg15分钟）移除该阶段中的任何沉淀。然后在水中加入10％氯化钙溶液以将钙浓度调至1％，通过加入等体积的100％乙醇来沉淀含有多个磷酸丝氨酸基团的多肽。通过离心（12,000xg15分钟）收集沉淀的多肽。将沉淀物重新溶解于0.5mL磷酸盐缓冲液以用于分析。
通过二辛可宁酸试验使用皮尔斯（Pierce）BCA试验试剂盒中的试剂和方案测定沉淀物中的多肽浓度。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），使用16.5%Tricine凝胶（伯乐公司（BioRad））测定胰蛋白酶水解后多肽的尺寸和相对浓度。将样品（10μL）与等体积的Tricine样品缓冲液（伯乐公司）混合，并在95°C加热5分钟，然后上样到凝胶上，在100伏（恒定）室温电泳100分钟。通过在40%甲醇/10％乙酸溶液中室温温和振摇1小时来固定凝胶，然后通过在50%考马斯亮蓝（伯乐公司）和50％固定溶液中室温孵育30分钟进行染色。最后，通过在1％乙酸中温和振摇过夜对凝胶脱色。
在含有60mg酪蛋白和1.2mg、0.6mg、及0.3mg胰蛋白酶的3mL反应体积中于pH8水解酪蛋白。对于含有1.2mg、0.6mg和0.3mg胰蛋白酶的反应，由水解反应（通过沉淀方法回收）产生的多肽百分数分别为9%、9%和13%。SDS-PAGE分析显示，所有情况下，酪蛋白被水解为较小的多肽复合物。沉淀后，从所有三个反应中回收的物质主要是小分子量多肽。
α-酪蛋白和β-酪蛋白在含有60mg多肽和1.2mg胰蛋白酶的3mL反应中于pH8水解。就α-酪蛋白和β-酪蛋白而言氯化钙/乙醇沉淀分别含有4%和7%的水解多肽。SDS-PAGE分析表明，沉淀样品含有多肽混合物。
实施例2
形成BFP多肽和具有与牙齿组分相互作用或与之结合能力的分子的偶联物
将未标记的β-酪蛋白（西格玛奥德里奇公司）、β-酪蛋白-磷酸肽（根据实施例1制备）和富酪蛋白(1-25)-C(Biomatic公司)与获自生物视野公司（Biovision）的BFP多肽偶联，以此分别形成β-酪蛋白/BFP偶联物、β-酪蛋白-PP/BFP偶联物、和富酪蛋白(1-25)C/BFP偶联物。本实施例描述了β-酪蛋白的偶联，但用相似的方法实施α-酪蛋白和β-酪蛋白磷酸多肽的偶联。简单地说，用3mL含有1mg/mLBFP、0.33mg/mLSM(PEG)4(皮尔斯公司（Pierce），目录号22104)、2mMEDTA、0.05%吐温20和0.05磷酸钠缓冲液（pH7.2）的反应制备经马来酰亚胺活化的BFP。使该反应在室温进行40分钟，然后在经5mMMES缓冲液(pH6)、2mMEDTA、和0.05%吐温平衡的G-25Sephadex柱上脱盐。
在含有4.5mg/mLβ-酪蛋白、5mM2-亚氨基四氢噻吩、2mMEDTA,0.05%吐温20、和0.05M硼酸钠缓冲液(pH8.0)的2mL反应中制备经巯基活化的β-酪蛋白。使该反应在室温进行1小时，然后在经0.05M磷酸钠缓冲液(pH7.0)、2mMEDTA、和0.05%吐温20平衡的G-25Sephadex柱上脱盐。该物质用于制备后立即进行的偶联反应。
在含有0.37mg/mL经马来酰亚胺活化的BFP、1.57mg/mL经巯基活化的β-酪蛋白、2mMEDTA、0.05%吐温20、和0.05M磷酸钠缓冲液(pH7.0)的3.825mL反应中制备β-酪蛋白/BFP偶联物。使该反应在室温反应1小时，然后通过添加在去离子水中新鲜制备的0.038mL0.1MN-甲基马来酰亚胺溶液来淬灭任何剩余的巯基。
通过离心浓缩器（10kDa截断）将偶联物浓缩至1.5mL，然后施加到含有0.05%吐温20的磷酸盐缓冲液平衡的HiLoadSuperdex20016/600柱（GE医疗保健公司（GEHealthcare））上。以1.1mL/分钟洗脱该柱，收集1.5mL组分并通过荧光（320nm激发，445nm发射）和总蛋白浓度（二辛可宁酸试验）对其进行分析。
由于β-酪蛋白和BFP都含有多个活化基团，反应中形成各种大小的偶联物。不同大小的偶联物示例是β-酪蛋白-BFP、β-酪蛋白-BFP-β-酪蛋白、β-酪蛋白-BFP-β-酪蛋白-BFP等。Superdex200柱基于分子大小从偶联物中分离较小的原料。然而，该柱也部分分离反应中产生的不同大小的偶联物。所述柱产物收集在两个库中：先从柱上洗脱较的较高分子量产物和在较高分子量产物之后但在未反应的原料前洗脱的较低分子量产物。通过分子过滤将两个产物库浓缩后，较低分子量库（0.28mg/mLBFP含量）相较高分子量库（0.36mg/mLBFP含量）显示与牙齿结合更高。在下述实施例中使用更高结合的低分子量组分。
将β-酪蛋白磷酸肽巯基化，与经马来酰亚胺活化的BFP连接，在Superdex200柱上纯化，并根据所述浓缩β-酪蛋白。β-酪蛋白磷酸肽-BFP的较高分子量组分的浓度为0.38mg/mL，较低分子量组分的浓度为0.48mg/mL。
在含有1.1mg/mL经马来酰亚胺活化的BFP、1.1mg/mL富酪蛋白(1-25)C、2mMEDTA、0.05%吐温20、和0.05M磷酸钠缓冲液(pH7.0)的1.4mL反应中制备典型的富酪蛋白(1-25)C/BFP偶联物。富酪蛋白(1-25)C含有游离的巯基，不需要活化。虽然每个富酪蛋白分子只有一个活化的基团，但多个富酪蛋白分子能结合单个活化的BFP，产生了产物分布。产物在Superdex200柱上部分互相分离，得到较高分子量组分（0.22mg/mLBFP含量）和较低分子量组分（036mg/mLBFP含量）。在下述结合/提取实施例中使用所述较高分子量组分。
实施例3
对牙齿施加含有偶联物的BFP多肽
将β-酪蛋白/BFP偶联物(约0.09mg/mL)、β-酪蛋白-PP/BFP偶联物(约0.24mg/mL)和富酪蛋白(1-25)C/BFP偶联物(约0.05mg/mL)与未涂覆的牙齿或涂覆唾液的牙齿一起孵育约1小时。孵育1小时后，清洗该牙齿，先用0.4％EDTA再用2％SDS从牙齿上提取结合的蛋白。通过荧光试验（表1）测定各提取溶剂中所提取的蛋白量。
表1.
这些结果证实，β-酪蛋白/BFP偶联物、β-酪蛋白-PP/BFP偶联物和富酪蛋白(1-25)C/BFP偶联物具有与牙齿结合的能力。
使用β-酪蛋白/BFP偶联物进行额外的实验来评估pH和温度对结合的影响。在pH6-pH9的情况下，β-酪蛋白/BFP偶联物与牙齿的结合没有显著的变化。另外，温度（21°C至37°C）对β-酪蛋白/BFP偶联物与牙齿的结合没有显著影响。
在另一个实验中，β-酪蛋白/BFP偶联物在40％乙醇存在下与牙齿一起孵育。在一些情况下，发现相比不存在乙醇时使用β-酪蛋白/BFP偶联物，含有40％乙醇的缓冲液提高β-酪蛋白/BFP偶联物与牙齿的结合水平。
用2％EDTA预处理牙齿1小时，使得β-酪蛋白/BFP偶联物和富酪蛋白(1-25)C/BFP偶联物与牙齿的结合水平增加。
进行以下实验来评估牙齿的增白情况。简单来说，经浮石研磨牙齿用2％SDS孵育30分钟，然后用50％乙醇孵育10分钟。用50％乙醇孵育10分钟后，将该牙齿在含有唾液盐的结合缓冲液中暴露30分钟，然后用2％EDTA孵育1小时。用EDTA孵育1小时后，将该牙齿在含BFP的偶联物中暴露1小时，然后清洗。在37°C用2％SDS对结合偶联物提取30分钟，并进行测定。此时，所述牙齿用浮石研磨并任选地在后续实验中重复使用。通常在以下时间分析样品的增白情况：(a)EDTA处理后并在偶联物结合前，(b)一小时的偶联物结合步骤后，(c)SDS提取步骤后，和(d)浮石研磨后。在各上述步骤中，使用色板分析、荧光成像和/或照相（例如，设置固定相机、照明（6500°K灯泡）和放置样品）分析该牙齿。分析SDS提取样品的荧光。
如色板分析和照相对比（图10）所测定，β-酪蛋白/BFP偶联物在含40％乙醇的缓冲液存在下可重复地增白牙齿。只存在缓冲液时使用色板分析评估β-酪蛋白/BFP偶联物，发现其增白牙齿。如色板分析和照相对比所测定，富酪蛋白(1-25)C/BFP偶联物在40％乙醇的存在下增白牙齿。该增白水平低于β-酪蛋白/BFP偶联物的增白水平。只存在缓冲液时基于色板和照相分析，富酪蛋白(1-25)C/BFP偶联物表现出很少或没有增白。
在一些情况下，用缓冲液清洗该牙齿后进行增白测量来确定偶联物使牙齿增白的能力。这些结果表明，结合的偶联物不易去除。浮石研磨后，该牙齿失去了增白效果。然而，浮石研磨后，用缓冲液清洗该牙齿并用SDS提取以去除偶联物。SDS处理后，该牙齿只是稍微不及它们经缓冲液清洗和SDS提取前那么白。这些结果也表明，结合的偶联物不易去除。
综上所述，本文提供的结果证实偶联物（例如β-酪蛋白/BFP偶联物）具有与牙齿结合的能力和使它们看上去略微更白。
实施例4
对人牙齿施加含有BFP多肽的组合物
使用标准洗刷技术，采用标准牙膏组合物来清洁人的牙齿。一旦清洁完牙齿，该人自己应用含有BFP多肽的牙膏组合物来清洁牙齿。一旦应用，含有BFP多肽的组合物仍能保持接触牙齿至少30秒（例如，约30秒-60秒）。该时段过后，冲洗牙齿。
其他实施方式
应理解虽然本发明已结合其详述进行描述，但以上描述意在说明而不是限制本发明的范围，该范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优势和修改在以下权利要求的范围内。
Claims (11)
1.一种使牙齿看上去更白的方法，所述方法包括对牙齿施加荧光发射多肽，所述荧光发射多肽发射的荧光使牙齿看上去更白，其中所述荧光发射多肽是蓝色荧光蛋白(BFP)多肽，其中，所述荧光发射多肽与一种分子偶联，所述分子具有与牙齿或牙齿组分相互作用或与之结合的能力。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述牙齿是人的牙齿。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分子是多肽。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分子是酪蛋白多肽。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分子是富酪蛋白多肽。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分子是具有与釉质、羟基磷灰石或获得性牙齿膜相互作用或与之结合能力的分子。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光发射多肽是融合多肽，所述融合多肽包含酪蛋白多肽的氨基酸序列。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光发射多肽是融合多肽，所述融合多肽包含富酪蛋白多肽的氨基酸序列。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光发射多肽存在牙膏中，且所述应用步骤包括向所述牙齿应用所述牙膏。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光发射多肽是聚合物的一个单位，所述聚合物包含两个或多个荧光发射多肽。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述聚合物与酪蛋白多肽结合以形成复合物，其中将所述复合物施用于所述牙齿。
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