MX2013002113A - Metodos y materiales para proporcionar a los dientes con una apariencia blanca. - Google Patents
Metodos y materiales para proporcionar a los dientes con una apariencia blanca.Info
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Abstract
Este documento proporciona métodos y materiales para proporcionar a los dientes con una apariencia blanca. Por ejemplo, se proporcionan métodos y materiales para poner en contacto los dientes con uno o más polipéptidos emisores de fluorescencia (por ejemplo, una proteína fluorescente azul BFP)) para proporcionar a los dientes con una apariencia más blanca.
Description
MÉTODOS Y MATERIALES PARA PROPORCIONAR A LOS DIENTES
CON UNA APARIENCIA BLANCA
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Este documento se relaciona con métodos y materiales implicados para proporcionar a los dientes con una apariencia blanca. Por ejemplo, este documento se relaciona con métodos y materiales para poner en contacto los dientes con uno o más polipéptidos emisores de fluorescencia (por ejemplo, una proteina fluorescente azul) para proporcionar a los dientes con una apariencia más blanca.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
En general, los dientes blancos se consideran cosméticamente deseables. Sin embargo, los dientes, se pueden manchar en ausencia de intervención. La estructura ^dental que en general es responsable de presentar una 'apariencia manchada es la capa dé esmalte. Diversos factores pueden contribuir al manchado del esmalte. Por ejemplo, la formación de placa y matrices de sarro en la superficie dental pueden atrapar manchas, conduciendo asi al manchado del esmalte.
Se han desarrollado preparaciones: blanqueadoras dentales que se pueden comprar sin receta para dirigirse a la preferencia cosmética de" muchos para restaurar el Ilustre del esmalte dental manchado por materiales atrapados en la superficie. Mientras que todos los dentífricos y lavados bucales contienen algunos agentes limpiadores y pulidores, algunos depósitos en el esmalte se tornan intratables para ser eliminados totalmente por estos agentes bajo condiciones normales de uso. Los fumadores con frecuencia desarrollan un esmalte manchado debido a que se recolectan en los dientes los sarros y partículas en el humo de cigarrillo exhalado. En algunos casos, alimentos y bebidas (por ejemplo, '.té) pueden teñir o manchar el esmalte dental.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Este documento proporciona métodos y materiales para proporcionar a los dientes con una apariencia blanca. Por ejemplo, este documento proporciona los métodos y materiales para poner en contacto los dientes con : uno o más polipéptidos emisores de fluorescencia (por ejemplo, una proteína fluorescente azul (BFP) ) para proporcionar los dientes con una apariencia más blanca. Como se describe en la presente, los polipéptidos emisores de fluorescencia tales como los polipéptidos de BFP se pueden aplicar- a los dientes bajo condiciones que permitan que los polipéptidos emisores de fluorescencia se unan a adhieran directa o indirectamente a los dientes. En estos casos, los polipéptidos que emiten fluorescencia pueden emitir fluorescencia a una longitud de onda particular. En el caso de los polipéptidos de BFP, los polipéptidos de BFP puede emitir fluorescencia en la variación entre aproximadamente 440 nm hasta aproximadamente 500 nm (por ejemplo, entre aproximadamente 450 nm y aproximadamente 490) , la cual cuando se emite desde los dientes proporciona los dientes con una apariencia blanca. Está apariencia blanca se puede presentar incluso cuando los dientes no son naturalmente tan blancos. Por ejemplo, los métodos y materiales proporcionados en la presente pueden permitir que una persona tenga dientes con apariencia blanca incluso aunque los dientes puedan estar manchados. De esta forma, los dientes con apariencia blanca se pueden obtener utilizando los métodos y materiales proporcionados en la presente sin un blanqueo severo (por ejemplo, sin tratamientos para blanqueo dental tales como aquellos que impliquen peróxido de hidrógeno o peróxido dé carbimida) o técnicas de desmanchado. :
En general, un aspecto de este ' documento caracteriza un método para alterar la apariencia de los dientes. El método comprende, o consiste esencialmente de, aplicar un polipéptido emisor de fluorescencia a los dientes, en donde la fluorescencia emitida del polipéptido emisor de fluorescencia altera la apariencia de los dientes. Los dientes pueden ser dientes humanos. El método puede comprender alterar la apariencia de los dientes de tal forma que los dientes parezcan más blancos. El polipéptido emisor de fluorescencia puede ser un polipéptido de BFP. El polipéptido emisor de fluorescencia puede estar conjugado con una molécula que tenga la capacidad de interactuar con o unirse a un diente o a un componente dental. La molécula puede ser un polipéptido. .La molécula puede ser un polipéptido de caseína. La molécula puede ser' un polipéptido de estaterina. La molécula puede ser una molécula' que tenga la capacidad de interactuar o unirse con el esmalte, hidroxiapatita, o película dental adquirida. El polipéptido emisor de fluorescencia puede ser un polipéptido, de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos de1 un polipéptido de caseína. El polipéptido emisor de fluorescencia puede ser un polipéptido de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de estaterina. El polipéptido emisor de fluorescencia puede estar presente; cori la pasta dental, y el paso de aplicación puede comprender aplicar la pasta dental a los dientes. El polipéptido Remisor de fluorescencia puede ser una unidad de un polímero que comprende dos o ' más polipéptidos emisores de, fluorescencia. El polímero puede estar unido a un polipéptido de caseína para formar un complejo, en donde el complejo !se aplica a los dientes .
En otro aspecto, este documento caracteriza una composición que comprende, o consiste esencialmente de, un polipéptido emisor de fluorescencia y un polipéptido de caseína.
En otro aspecto, este documento caracteriza una composición que comprende, o consiste esencialmente de, un polipéptido emisor de fluorescencia y un polipéptido de estaterina.
En otro aspecto, este documento caracteriza un polipéptido quimérico que comprende, o consiste esencialmente de, una secuencia de aminoácidos de 20 o más residuos de longitud de un polipéptido emisor de fluorescencia y una secuencia de aminoácidos de 20 o más residuos de longitud de un polipéptido de caseína. El polipéptido quimérico puede comprender un polipéptido emisor de fluorescencia de longitud total o un fragmento del mismo que es : al menos aproximadamente 90 por ciento idéntico al polipéptido emisión de fluorescencia de longitud total. El polipéptido quimérico puede comprender un polipéptido de caseína de longitud total o un fragmento del mismo que es al menos aproximadamente 80 por ciento idéntico al polipéptido de caseína longitud total. El polipéptido quimérico puede comprender la capacidad para emitir fluorescencia y la capacidad para interactuar o unirse a un diente o un componente dental.
En otro aspecto, este documento ¡caracteriza un polipéptido quimérico que comprende o consiste esencialmente de, una secuencia de aminoácidos de 20 o más residuos de longitud de un polipéptido emisor de fluorescencia y una secuencia de aminoácidos de 20 o más residuos, de longitud de un polipéptido de estaterina. El polipéptido quimérico puede comprender un polipéptido emisor de fluorescencia de longitud total o un fragmento del mismo que es al menos aproximadamente 90 por ciento idéntico al polipéptido emisión de fluorescencia de longitud total. El polipéptido quimérico puede comprender un polipéptido de estateriha de longitud total o un fragmento del mismo que es 1 al menos aproximadamente 80 por ciento idéntico al (polipéptido de estaterina de longitud total. El polipéptido quimérico puede comprender la capacidad de emitir fluorescencia y la capacidad de interactuar o unirse a un diente o a un componente dental.
A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado según se entiende comúnmente por alguien con experiencia normal en la técnica a la cual pertenece esta invención. Aunque se pueden utilizar1 métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente en la práctica o prueba de la presente ' invención, más adelante se describen los métodos y materiales adecuados. Todas las publicaciones, solicitudes de patentes, patentes y otras referencias mencionadas en la presente se ¦ incorporan como referencia en su totalidad. En caso de conflicto, dominará la presente especificación, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, y a partir de las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1, es un listado de una secuencia de ácido nucleico (SEC ID NO: 1) que codifica para un polipéptido de BFP ilustrativo (Acceso GenBank No. U70497.1; GI No. 1619752) . ! i
La figura 2, es un listado de una secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 2) de un polipéptido de BFP ilustrativo (Acceso GenBank No. AAB16959.1; GI No. 1619753).
La figura 3, es un listado de una secuencia de ácido nucleico (SEC ID NO: 3) que codifica para un polipéptido de a-caseína ilustrativo (Acceso GenBank No. N 181029.2; GI No. 31341348). 1
La figura 4, es un listado de una secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 4) de un polipéptido de caseína ilustrativo (Acceso GenBank No. NP_851372.1 ; GI No. 30794348) .
La figura 5 es un listado de una secuencia de ácido nucleico (SEC ID NO: 5) que codifica para un polipéptido de ß-caseína ilustrativo (Acceso GenBank No. BC 111172,1; GI No. 83406092) .
La figura 6 es un listado de una secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 6) de un polipéptido de ß-caseína ilustrativo (Acceso GenBank No. AAI11173.1; GI No. ' 83406093) .
La figura 7, es un listado de una secuencia de ácido nucleico (SEC ID NO: 7) que codifica para un polipéptido de estaterina ilustrativo (Acceso GenBank No. AAH67219.1; GI No. 45501309).
La figura 8, es un listado de una secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 8) de un polipéptido de> estaterina ilustrativo (Acceso GenBank No. BC067219.1; GI No . 5501308 ) .
La figura 9, es un listado de una secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 9) de un polipéptido de BFP ilustrativo .
La figura 10, ' contiene fotografías de un diente al inicio (izquierda), después de aplicar un conjugado de ß-caseína/polipéptido de BFP (centro) , y después de apomazar (derecha) . El diente exhibió una apariencia más blanca
después de aplicar un conjugado de ß-caseinai/polipéptido de
BFP de lo que fue al inicio. Esta apariencia más: blanca se perdió después de apomazar.
1
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
¦i
Este documento proporciona métodos y materiales
para proporcionar a los dientes con una apariencia blanca.
Por ejemplo, este documento proporciona métodos y materiales
para poner en contacto los dientes con uno o más polipéptidos emisores de fluorescencia (por ejemplo, - una proteina
fluorescente azul (BFP) ) para proporcionar a los dientes con
¦i
una apariencia más blanca.
En el sentido en el que se describe en la presente,
los polipéptidos emisores de fluorescencia se pueden aplicar
a los dientes de tal forma que se emita fluorescencia desde los dientes. Se puede aplicar a los dientes! cualquier
polipéptido emisor de fluorescencia adecuado. Por ejemplo, cuando se desea tener dientes con apariencia; más ; blanca, se
puede aplicar a los dientes de una persona un polipéptido que emita fluorescencia azul. Esta fluorescencia azul puede tener
una longitud de onda de emisión entre aproximadamente 440 nm y aproximadamente 500 nm (por ejemplo, entre aproximadamente 450 nm y aproximadamente 500, entre aproximadamente 460 nm y aproximadamente 500, entre aproximadamente 470 nm y aproximadamente 500, entre aproximadamente 480 nm y alrededor de 500 nm, entre aproximadamente 440 nm y aproximadamente 490, entre aproximadamente 440 nm y aproximadamente 480 nm, entre aproximadamente 440 nm y aproximadamente 470, entre aproximadamente 440 nm y aproximadamente 460, entre aproximadamente 450 nm y aproximadamente 490 nm, o entre aproximadamente 460 nm y aproximadamente 480 nm) . 'En algunos casos, un polipéptido emisor de fluorescencia que emite fluorescencia a una longitud de onda de emisión entre aproximadamente 420 nm y aproximadamente 450, entre aproximadamente 430 nm y aproximadamente 450, entre aproximadamente 440 nm y aproximadamente 450, entre aproximadamente 420 nm y aproximadamente 440 nm, o entre aproximadamente 485 nm y aproximadamente 505 nm se puede aplicar a los dientes como se describe en la presente.
Cuando se desea tener dientes de un color diferente, se puede aplicar a los dientes de una persona un polipéptido que emita fluorescencia en el espectro de rojo, verde o amarillo. La fluorescencia roja puede tener una longitud de onda de emisión entre aproximadamente 555 nm y aproximadamente 655 nm (por ejemplo, entre aproximadamente 565 nm y aproximadamente 645 nm, entre aproximadamente 575 nm y aproximadamente 635 nm, o entre aproximadamente 585 nm y aproximadamente 625 nm) . La fluorescencia verde puede tener
una longitud de onda de emisión entre aproximadamente 500 nm
y aproximadamente 525 nm (por ejemplo, entre aproximadamente
505 nm y aproximadamente 520 nm o entre aproximadamente 510 nm y aproximadamente 515 nm) . La fluorescencia amarilla puede
tener una longitud de onda entre aproximadamente 525 nm y
aproximadamente 555 nm (por ejemplo, entre aproximadamente
530 nm y aproximadamente 550 nm o 535 nm y laproximadamente 545 nm) . En algunos casos, se pude aplicar a ; los 'dientes de
una persona una combinación de diferentes pólipéptidos emisores de fluorescencia. Por ejemplo, se puede1 aplicar a
los dientes de una persona una combinación de pólipéptidos de
BFP y pólipéptidos con proteina fluorescente roja (RFP) . En i
algunos casos, se puede aplicar a los dientes de una persona
una combinación de pólipéptidos de RFP y pólipéptidos con
proteina fluorescente verde (GFP) . :
Cualquier polipéptido de BFP adecuado1 se puede
utilizar como se describe en la presente. Los ejemplos de pólipéptidos de BFP que se pueden utilizar como s;e describe
en la presente incluyen, sin limitación, EBFP (por ejemplo,
un EBFP que tenga una emisión máxima de 460 nm), SBFP1 con
proteina fluorescente (Acceso GenBank® No. ABM97856, GI No. 124264536), SBFP2 con proteina fluorescente (Acceso GenBank® No. ABM97857, GI No. 124264538), EBFP2 (Acceso GenBank® No.
EF517318, GI No. 145666498), Azurita (Mena « et al, Nature Biotechnology, 24:1569-1571 (2006)), mKálamal (Acceso GenBank® No. EF517317, GI No. 145666496),! proteina 383 indicadora de zinc (Acceso GenBank® No. EDU39924.1, GI No. 187972425), SEC ID NO: 445 establecida en la patente de los Estados Unidos No. 7,166,424 (Acceso GenBank® No. ABN30727.1, GI No. 125148618), proteína fluorescente azul soluble-modificada (smBFP) (Acceso GenBank® No. U70497.1, GI No. 1619752), polipéptidos que tienen la secuencia! establecida en el Acceso GenBank® No. CAE00365.1 (GI No. ;32260521), polipéptidos que tienen la secuencia establecida eri el Acceso GenBank® No. CAE00361.1 (GI No. 32260509), polipéptidos que tienen la secuencia establecida en el Acceso GenBank® No. CAE00361.1 (GI No. 32260509), polipéptidos ECFP (Acceso GenBank® No. AC048275.1, GI No. 226331138),, polipéptidos Cerulean (Acceso GenBank® No. ADE48834.1; GI No. 293612838), polipéptidos CyPet de proteínas fluorescentes (Acceso GenBank® No. 3GEX_A; GI No. 290789997), polipéptidos MiCy (Acceso GenBank® No. ADE48830.1; GI No. 293612833), y polipéptidos mTFPl de proteínas fluorescentes (Acceso
GenBank® No. AC048263.1; GI No. 226320339). En algunos casos, un polipéptido de BFP establecido en la publicación de la solicitud de la patente de los Estados Unidos No. 2010/0062460 se puede utilizar como se describe en la presente.
Cualquier polipéptido RFP adecuado y polipéptido GFP se puede utilizar como se describe en la presente. Los ejemplos de polipéptidos RFP que se pueden utilizar como se describe en la presente incluyen, sin limitación, los polipéptidos de la proteina fluorescente verde desplazados al rojo solubles-modificados (smRSGFP) (Acceso GenBank® No. U70496.1; GI No.1619750), polipéptidos de la proteina fluorescente roja que tengan la secuencia establecida en el Acceso GenBank® No. AAG16224.1 (GI No. 10.304.307); AB038175.1 (GI No. 133753343), o AAU06852.1 (IG No. 51593130) , los polipéptidos de la proteina similar a Gfp emisoras de color naranja (Acceso GenBank® No. 2ZMW_D; GI No. 209870302), polipéptidos de la proteina fluorescente mOrange (Acceso GenBank® No. AC048285.1; GI No. 226331152), polipéptidos NLS-dTomato (Acceso GenBank® No. ADC42843.1; GI No. 288188779), polipéptidos tdTomato de la; proteina fluorescente roja (Acceso GenBank® No. ACQ43939.1; GI No. 228484713), polipéptidos DsRed (Acceso GenBank® No. BAE53441.1; GI No. 83016748), polipéptidos DsRed2 (Acceso GenBank® No. AAV73970.1; GI No. 56119204), polipéptidos que expresan DsRed (Acceso GenBank® No. ACU30027.1; GI No. 255689290) , polipéptidos del monómero DsRed (Acceso GenBank® No. ACF35425.1, GI No. 194245628), polipéptidos monoméricos de la proteína fluorescente naranja-rojo (Acceso GenBank® No. AAV52170.1, GI No. 55420625), polipéptidos mohoméricos de la proteína fluorescente naranja-rojo (Acceso1 GenBank® No. AAV52166.1; GI No. 55420617), polipéptidos mCherry (Acceso GenBank® No. ACY24904.1; GI No. 262089840), polipéptidos que tengan la secuencia de aminoácidos de la , SEC ID NO: 3 establecida en la patente de los Estados Unidos No. 7,393,923 (Acceso GenBank® No. ACH06540.1; GI No. 197 013 979), y los polipéptidos que tengan la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 5 establecida en la patente de los Estados Unidos No. 7,393,923 (Acceso GenBank® No. ACH06541.1; GI No. Í97013980).
Los ejemplos de polipéptidos GFP '' que se pueden utilizar como se describe en la presente incluyen, sin limitación, polipéptidos de la proteína fluorescente verde solubles-modificados (smGFP) (Acceso GenBank® No., U70495.1; GI No.1619748), polipéptidos GFP-ER de, la! proteína fluorescente verde modificada (mfgp4-ER) (Acceso GenBank® No. U87625.1; GI No. 1.842.446), polipéptidos GFP (Acceso
GenBank® No. ACJ06700.1, GI No. 210076685), polipéptidos GFP mejorados (Acceso GenBank® No. ACV20892.1; GI No. 256708579), polipéptidos turboGFP (Acceso GenBank® No. ADD23343.1; GI No. 290131407), polipéptidos VisGreen GFP (Acceso GenBank® No. ABR26680.1; GI No. 149393496), y polipéptidos Azami-Green (Acceso GenBank® No. BAD52001.1; GI No. 52839539). :
En algunos casos, un polipéptido emisor de fluorescencia tal como aquellos descritos por Subach et al. (Chem. Biol., 15:1116-1124 (2008)) se puede utilizar como se describe en la presente. Véase, también, el Acceso GenBank® No. 3M24_A (GI No. 296863586), el Acceso GenBank® No. 3M24_B (GL296863587) , Acceso GenBank® No. 3M24_C (GL296863588) , y Acceso GenBank® No. 3M24_D (GL296863589) . ; Ejemplos adicionales de polipéptidos emisores de fluorescencia que se pueden utilizar como se describe en la presente, incluyen, sin limitación, aquellos descritos en otra parte (Alieva et al. PLoS ONE, 3(7):e2680 (2008) y Chudafov et al., Physiol Rev., 90:1103-1163 (2010)). Véase, por ejemplo, la' Tabla 1 de la referencia de Alieva et al. y las figuras 5, 10, 12 y 14 de la referencia Chudafov et al. En algunos casos, un polipéptido emisor de fluorescencia color coral se puede utilizar como se describe en la presente. En algunos casos, un polipéptido emisor de fluorescencia que tenga la secuencia de aminoácidos establecida en la figura 2 ó 9 o que tenga una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia establecida en la figura 1 se puede utilizar como se describe en la presente.
Cualquier método adecuado se puede utilizar para producir un polipéptido emisor de fluorescencia. Ppr ejemplo, las técnicas para expresión de polipéptidos (por e:j:emplo, las técnicas de expresión heteróloga utilizando células bacterianas, células de insectos o células de mamíferos) se pueden utilizar para producir un polipéptido ¦ emisor de fluorescencia. En algunos casos, los polipéptidos emisores de fluorescencia tales como los polipéptidos de BFP se pueden elaborar como se describe en otra parte (Yakhnin et al., Protein Expr. Purif., 14:382-386 (1998) y J;ain et al., J.
Chromatography A, 1035:83-86 (2004)). En algunos casos, se pueden utilizar técnicas para síntesis de polipéptidos estándar (por ejemplo, técnicas para síntesis de polipéptidos en fase líquida técnicas para síntesis de polipéptidos en fase sólida) para producir sintéticamente los polipéptidos emisores de fluorescencia.
Un polipéptido emisor de fluorescencia puede estar unido o estar adherido a los dientes vía una molécula (por ejemplo, un polipéptido) que tenga la capacidad de interactuar o unirse a un diente o un componente dental (por ejemplo, esmalte, hidroxiapatita, película dental' adquirida, cemento, corona, cérvix, unión cemento-esmalte,, o ápice) . Por ejemplo, un polipéptido emisor de fluorescencia puede estar unido covalente o no covalentemente a un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido de caseína, un polipéptido de estaterina, o un fragmento de la misma) . Los ejemplos de polipéptidos de caseína que se pueden utilizar como se i
describe en la presente incluyen, sin limitación, polipéptidos a-caseína (por ejemplo, los polipéptidos de oc-Sl caseína y los polipéptidos a-S2-caseína) , polipéptidos de ß-caseína (por ejemplo, polipéptidos de Al ß-caseína y polipéptidos de A2 ß-caseína), polipéptidos de ?-caseína (por ejemplo, polipéptidos de ??-caseína, polipéptidos de ?2-caseína, y polipéptidos de y3-caseína) , polipéptidos de d-caseína, y polipéptidos de e-caseína. En algunos, casos, un polipéptido de caseína que tenga la secuencia de aminoácidos establecida en la figura 4 ó 6 o que tenga una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia establecida en la figura 3 ó 5 se puede utilizar como se describe en la presente .
En algunos casos, un polipéptido de caseína puede ser una porción de un polipéptido de caseína longitud total con la condición de que la porción tenga la cápacidad de interactuar o unirse a un diente o un componente dental. Por ejemplo, una polipéptido de caseína que se pueda utilizar como se describe en la presente puede ser un polipéptido que incluya un dominio aniónico (por ejemplo, los residuos de aminoácidos 59 hasta 79 o un polipéptido dé a-Sl caseína bovino de longitud total, los residuos de aminoácidos 2 hasta 20 de un polipéptido de a-S2 caseína bovina de longitud total, o los residuos de aminoácidos 1 hasta : 25 de un polipéptido de ß-caseina de bovino de longitud total) de un polipéptido de caseína.
En algunos casos, un polipéptido de caseína puede ser (a) un polipéptido que consista de los residuos de aminoácidos 59 hasta 79 de un polipéptido de a-Sl-caseína bovino de longitud total, (b) un polipéptido que no tenga más de 50 residuos de aminoácidos de longitud (por ejemplo, no más de 45, 40, 35, 30 ó 25 residuos de ¡ aminoácidos de longitud) con la condición de que el polipéptido incluya los residuos de aminoácidos 59 hasta 79 de un poilipéptido de ct-Sl-caseína bovino de longitud total, o (c) un polipéptido que incluya los residuos de aminoácidos 59 hasta ' 79 de un polipéptido a-Sl caseína bovino de longitud total con cero, uno, dos, tres, cuatro, cinco, o seis sustituciones de aminoácidos en comparación con los residuos de aminoácidos 59 hasta 79 de un polipéptido a-Sl-caseína bovino de longitud total. En algunos casos, un polipéptido de caseína puede ser (a) un polipéptido que consista de los residuos de aminoácidos 1 hasta 25 de un polipéptido ß caseína bovino de longitud total, (b) un polipéptido que no tenga más de 50 residuos de aminoácidos de longitud (por ejemplo,; no más de 45, 40, 35 ó 30 residuos de aminoácidos de longitud) con la condición de que el polipéptido incluya los residuos de aminoácidos 1 hasta 25 de un de un polipéptido ß caseína bovino de longitud total, o (c) un polipéptido que incluya los residuos de aminoácidos 1 hasta 25 de un polipéptido ß caseína bovino de longitud total con cero, uno, dos, tres, cuatro, cinco, o seis sustituciones de aminoácidos en comparación con los residuos de aminoácidos 1 hasta 25 de un polipéptido ß caseína bovino de longitud total. En algunos casos, un polipéptido de caseína se puede producir (por ejemplo, sintetizada) para que incluya uno o más residuos de cisteína para facilitar la conjugación del polipéptido de caseína a un polipéptido emisor de fluorescencia (por ejemplo, un polipéptido de BFP) .
Un polipéptido de caseína que se puede utilizar como se describe en la presente puede tener una secuencia de aminoácidos que se presenta en la naturaleza en cualquier tipo de mamífero. Por ejemplo, un polipéptido de caseína que se puede utilizar como se describe en la presente o tener una secuencia de aminoácidos que se presente en la naturaleza en un ser humano, vaca, cabra, oveja, caballo, ratón, rata, mono, perro, gato, orangután, chimpancé, cerdo, caballo, elefante o zarigüeya. En algunos casos, un polipéptido de caseína de bovino se conjuga con un polipéptido; emisor de fluorescencia para formar un conjugado de polipéptido de I
caseína/polipéptido emisor de fluorescencia que tenga la capacidad de interactuar o unirse a un diente o un componente dental.
Los ejemplos de polipéptidos de estaterina que se pueden utilizar como se describe en la presente incluyen, sin limitación, polipéptidos de estaterina humana, polipéptidos de estaterina bovina, y polipéptidos de estaterina salival.
En algunos casos, el polipéptido de estaterina puede ser una porción de un polipéptido de estaterina de longitud total con la condición de que la porción tenga la capacidad de interactuar o unirse a un diente o un componente dental. Por ejemplo, un polipéptido de estaterina que se puede utilizar como se describe en la presente puede ser un ; polipéptido que incluya un dominio altamente negativo (por ejemplo, los residuos de aminoácidos 1 hasta 15 de un polipéptido de estaterina humana de longitud total) de un" polipéptido de estaterina. ;
En algunos casos, un polipéptido de : estaterina puede ser (a) un polipéptido que consista de los residuos de aminoácidos 1 hasta 15 de un polipéptido de estaterina humana de longitud total, (b) un polipéptido que no tenga más de 50 residuos de aminoácidos de longitud (por ejemplo,: no más de 45, 40, 35, 30, 25 ó 20 residuos de aminoácidos de longitud) con la condición de que el polipéptido incluya los residuos de aminoácidos 1 hasta 15 de un polipéptido de estaterina humana de longitud total, o (c) un polipéptido gue incluye los residuos de aminoácidos 1 hasta 15 de un polipéptido de estaterina humana de longitud total con cero, uno, dos, tres, cuatro, o cinco sustituciones de aminoácidos en comparación con los residuos de aminoácidos 1 hasta 15 de un polipéptido de estaterina humana de longitud total. En algunos casos, el polipéptido de estaterina puede ser (a) un polipéptido que consista de los residuos de aminoácidos 1 hasta 25 de un polipéptido de estaterina humana de longitud total, (b) un polipéptido que no tenga más de 50 residuos de aminoácidos de longitud (por ejemplo, no más de 45, 40, 35 ó 30 residuos de aminoácidos de longitud) con la condición de que el polipéptido incluya los residuos de aminoácidos 1 hasta 25 del polipéptido de estaterina humana de longitud total, o (c) un polipéptido que incluya los residuos de aminoácidos 1 hasta 25 de un polipéptido de estaterina humana de longitud total con cero, uno, dos, tres, cuatro, cinco, o seis sustituciones de aminoácidos en comparación con los residuos de aminoácidos 1 hasta 25 de un polipéptido de estaterina humana de longitud total. En algunos casos, un polipéptido de estaterina puede ser (a) un polipéptido que consista de los residuos de aminoácidos 19 hasta 43 de un polipéptido de estaterina humana de longitud total, (b) un polipéptido que no tenga más de 50 residuos de aminoácidos de longitud (por ejemplo, no más de 45, 40, 35, 30 ó 25 residuos de aminoácidos de longitud) con la condición de que el polipéptido incluya los residuos de aminoácidos 19 hasta 43 de un polipéptido de estaterina humana de longitud total, o (c) un polipéptido que incluya los residuos de aminoácidos 19 hasta 43 de un polipéptido de estaterina humana de longitud total con cero, uno, dos, tres, cuatro, cinco, o seis sustituciones de aminoácidos en comparación con los residuos de aminoácidos 19 hasta 43 de un polipéptido de estaterina humana de longitud total. En algunos casos, un polipéptido de estaterina se pueden producir (por ejemplo, sintetizar) con un residuo negativo (por ejemplo, un ácido aspártico) sustituido con uno o más residuos de fosfoserina negativa. En algunos casos, un polipéptido de estaterina se pueden producir (por ejemplo, sintetizar) para que incluya uno o más residuos de cisteina para facilitar la conjugación del polipéptido de estaterina con un polipéptido emisor de fluorescencia (por ejemplo, un polipéptido de BFP) .
Un polipéptido de estaterina que se puede utilizar como se describe en la presente puede tener una secuencia de aminoácidos que se presenta en la naturaleza en cualquier tipo de mamífero. Por ejemplo, un polipéptido de estaterina que se puede utilizar como se describe en la presente puede tener una secuencia de aminoácidos que se presente en la naturaleza en un ser humano, vaca, cabra, oveja, caballo, ratón, rata, mono, perro, gato, orangután, chimpancé, cerdo, caballo, elefante o zarigüeya. En algunos casos, un polipéptido de estaterina humana se conjuga con un polipéptido emisor de fluorescencia para formar un conjugado de polipéptido de estaterina/polipéptido emisor de fluorescencia que tenga la capacidad de interactuar o unirse a un diente o un componente dental. En algunos casos, un polipéptido de estaterina que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la figura 8, o que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia establecida en la figura 7 se puede utilizar como se describe en la presente.
Cualquier método adecuado se puede utilizar para producir un polipéptido que tenga la capacidad de interactuar o unirse a un diente o un componente dental. Por ejemplo, se pueden utilizar técnicas para expresión de polipéptidos (por ejemplo, técnicas de expresión heteróloga utilizando células bacterianas, células de insectos o células de mamiferas) para producir un polipéptido que tenga la capacidad de interactuar o unirse con un diente o un componente dental. :En algunos casos, un polipéptido que tenga la capacidad de interactuar o unirse a un diente o un dental tal como un1 polipéptido de caseína o un polipéptido de estaterina se producir como se describe en otra parte (las patentes de los^ Estados Unidos Nos. 7,666,996, 6,797,810, 6,558,717, 6, 121, 421, 6, 080, 844, 5,834,427, 5,391,497 y 4,713,254, y las publicaciones de las solicitudes de patente de los Estados¡ Unidos Nos. 2009/0074680 y 2010/0144598). En algunos casos, se pueden utilizar técnicas para síntesis de polipéptidos estándar (por ejemplo, técnicas para síntesis de polipéptidos en fase líquida o técnicas para síntesis de polipéptidos en fase sólida) para producir los polipéptidos sintéticamente que tengan la capacidad para interactuar o unirse a un diente o un componente dental.
Cualquier método adecuado se puede utilizar para unir covalente o no covalentemente un polipéptido emisor de fluorescencia a una molécula (por ejemplo, un polipéptido) que tenga la capacidad de interactuar o se unirse á un diente o un componente dental. Por ejemplo, un polipéptido emisor de fluorescencia tal como un polipéptido de BFP \ se puede conjugar químicamente con un polipéptido de caseína y/o un polipéptido de estaterina vía uno o más enlaces ; covalentes coordinados, enlaces covalentes, enlaces disulfuro, enlaces de alta energía, enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos, o enlaces peptídicos. En algunos casos, un polipéptido emisor de fluorescencia se puede conjugar químicamente con un grupo amina presente en un polipéptido que tenga la capacidad de interactuar o unirse a un diente o un componente dental (por ejemplo, un polipéptido de caseína y/o un polipéptido de estaterina) . Este grupo amina puede estar ubicado en el término N del polipéptido, el término C del polipéptido, o entre los términos N y C del polipéptido.
En algunos casos, los polipéptidos pueden estar conjugados para que se activen antes de la conjugación. Por ejemplo, un polipéptido (por ejemplo, una polipéptido de caseína o un polipéptido de estaterina) se pueden activar mediante la incorporación de un grupo tiol reactivo. Para un polipéptido de estaterina, por ejemplo, esto se puede llevar a cabo al agregar de un residuo de cisteína al polipéptido durante la síntesis química. Para un polipéptido de caseína, un polipéptido de caseína se puede tratar con tiol mediante la reacción con 2-iminotiolano (por ejemplo, un reactivo Traut) como se describe en otra parte (McCall et al., Bioconjugate Chem. , 1:222-226 (1990)). En los casos de polipéptidos a- y ß-caseína, puede haber múltiples aminas (por ejemplo, el término N y lisinas) en el polipéptido que pueden reaccionar con el reactivo Traut. Las condiciones de reacción se pueden variar para aumentar al (máximo el rendimiento de las moléculas activadas con uno o dos tioles para disminuir la posibilidad de que la conjugación puede interferir con la unión a los dientes. El grado de incorporación de tiol se puede medir utilizando un análisis de fluorescencia sensible como se describe en otra parte (Lacy et al., Analytical Biochemistry, 382:66-68 (2008)).
Un polipéptido emisor de fluorescencia puede estar sustituido con uno o más grupos maleimida vía la reacción de las aminas del polipéptido con un reactivo bifuncional que contenga un grupo maleimida y un éster de N-hidroxisuccinimida reactivo. El polipéptido emisor de fluorescencia sustituido con maleimida entonces' se puede conjugar con los grupos tiol del polipéptido que tenga la capacidad de interactuar o unirse a un diente o un componente dental. El grado al cual el polipéptido emisor de fluorescencia está sustituido con los grupos maleimida se puede variar como se describe en otra parte (Singh, Bioconjugate Chem. , 5:348-351 (1994)). ;
Los ejemplos adicionales de los métodos de conjugación que se pueden utilizar para conjugar un polipéptido emisor de fluorescencia con una molécula (por ejemplo, un polipéptido) que tenga la capacidad de interactuar o unirse a un diente o un componente dental incluyen, sin limitación, aquellos descritos en otra parte (por ejemplo, Hermanson, G.T. Bioconjugate Techniques, Segunda Edición, 2008, Elsevier). Véase, por ejemplo, la Parte I, Sección 4 y la Parte II, Sección 5.
En algunos casos, la señal fluorescente que se obtiene utilizando los métodos y materiales proporcionado en la presente se pueden mejorar al enlazar múltiples polipéptidos emisores de fluorescencia con una sola molécula (por ejemplo, un polipéptido) que tenga la capacidad de interactuar o unirse a un diente o un componente dental. Debido a los efectos estéricos, esta amplificación se puede llevar a cabo efectivamente en primer lugar al preparar un polímero que contenga múltiples polipéptidos emisores de fluorescencia y luego enlazar este polímero a una molécula (por ejemplo, un polipéptido de caseína) que tenga la capacidad de interactuar o unirse a un diente o un componente dental. Los ejemplos de los métodos (por ejemplo, métodos de polimerización) que se pueden usar para formar polímeros que contengan múltiples polipéptidos emisores de fluorescencia incluyen, sin limitación, aquellos descritos en otra parte (por ejemplo, Hermanson, G.T. Bioconjugate Techniques, Segunda Edición, 2008, Elsevier) . Véase, por ejemplo, la parte II, sección 25.
En algunos casos, un polipéptido emisor de fluorescencia se puede producir como un polipéptido de fusión o quimérico con un polipéptido que tenga la capacidad de interactuar o unirse a un diente o un componente dental. Por ejemplo, las técnicas para expresión de polipéptidos heterólogos o las técnicas para síntesis de polipéptidos sintéticos se pueden utilizar para producir una sola cadena de polipéptidos que tenga una secuencia de aminoácidos de un polipéptido que emite fluorescencia y una secuencia de aminoácidos de un polipéptido que tenga la capacidad de interactuar o unirse a un diente o un componente dental. En algunos casos, la única cadena de polipéptidos puede tener (a) una secuencia de aminoácidos de un polipéptido que emite fluorescencia seguida por una secuencia de aminoácidos de un polipéptido que tenga la capacidad de interactuar o unirse a un diente o un componente dental o (b) una secuencia de aminoácidos de un polipéptido que tenga la capacidad de interactuar o unirse a un diente o un componente dental seguido por una secuencia de aminoácidos de un polipéptido que emite fluorescencia. En algunos casos, la única cadena de polipéptidos puede tener una o más (por ejemplo,, una, dos, tres, cuatro o cinco) secuencias de aminoácidos con cada codificación de un polipéptido emisor de fluorescencia y una o más (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, o cinco) secuencias de aminoácidos con cada codificación de un polipéptido que tenga la capacidad de interactuar o unirse a un diente o un componente dental.
En algunos casos, un polipéptido de fusión o quimérico proporcionado en la presente puede incluir otras
¦I
secuencias de aminoácidos (por ejemplo, residuos separadores
o de unión) . Por ejemplo, un polipéptido de fusión o
quimérico que tenga una secuencia de aminoácidos o un
polipéptido emisor de fluorescencia y una secuencia de
aminoácidos de un polipéptido que tenga la capacidad de
interactuar o unirse a un diente o un componente .dental que
incluya uno o más residuos de aminoácidos adicionales tales
como glicina, lisina, alanina, arginina, asparagina, ácido
aspártico, cisteina, glutamina, ácido ¡de glutamina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina , ' treonina,
triptófano, prolina, histidina, valina sefina, ' tirosina,
ornitina, taurina, pirolisina o residuos de seleocisteina o
derivados de aminoácidos (por ejemplo, 5-hidroxitriptófano,
L-dihidroxifenilalanina o a-difluorometilornitina) . Estos
residuos de aminoácidos adicionales se pueden diseñar para
que sean separadores (por ejemplo, una cadena de cinco o más
residuos de glicina) o se pueden diseñar para permitir que
los polipéptidos u otras moléculas se conjuguen químicamente con el polipéptido de fusión o quimérico. Por ejemplo, un polipéptido de fusión o quimérico que tenga una secuencia de
aminoácidos de un polipéptido emisor de fluorescencia y una
secuencia de aminoácidos de un polipéptido que tenga la capacidad de interactuar o unirse a un diente o un. componente dental puede incluir uno, dos, tres, cuatro ', cinco, o más residuos de lisina adicionales, de tal forma que uno o más polipéptidos que tengan la capacidad de interactuar o unirse a un diente o un componente dental (por ejemplo, los polipéptidos de caseína y/o polipéptidos de estaterina) se pueden conjugar químicamente con el polipéptido de fusión o quimérico.
Una composición proporcionada en la presente que contenga un polipéptido emisor de fluorescencia (Por ejemplo, una composición que contenga un polipéptido emisor de fluorescencia, un conjugado de polipéptido emisor de fluorescencia/polipéptido de caseína, conjugado de polipéptido emisor de fluorescencia/polipéptido de estaterina, un polipéptido emisor de fluorescencia/polipéptido de fusión y un polipéptido de caseína, y/o un polipéptido emisor de fluorescencia/polipéptido de fusión de un .polipéptido de estaterina) se puede aplicar a los dientes para alterar la apariencia de los dientes. Por ejemplo, una composición proporcionada en la presente que contenga un polipéptido de BFP (por ejemplo, un conjugado de polipéptido de BFP/polipéptido de estaterina) se puede aplicar a los dientes para proporcionar a los dientes una apariencia mas blanca. Cualquier método adecuado se puede utilizar para suministrar
j
una composición proporcionada en la presente a los dientes. Por ejemplo, una composición proporcionada en la presente se incorporar en una pasta dental, enjuague bucal, una bebida, un producto alimenticio, goma, geles, polvos o cremas.
En algunos casos, una cantidad efectiva de una composición proporcionada en la presente se puede suministrar a los dientes de tal forma que se altere la apariencia de los dientes (por ejemplo, la apariencia de los dientes se torna más blanca) . Una cantidad efectiva de una composición proporcionada en la presente puede ser cualquier cantidad que altere la apariencia de los dientes sin inducir toxicidad significativa. Por ejemplo, una composición proporcionada en la presente se puede incorporar en un producto de pasta dental en una cantidad que resulte entre aproximadamente
0.0001 mg y aproximadamente 100 (por ejemplo, entre aproximadamente 0. 001 mg y aproximadamente 100 mg, entre aproximadamente 0. 01 mg y aproximadamente 100 : mg, entre aproximadamente 0. , 1 mg y aproximadamente 100 :mg, entre aproximadamente 0. .5 mg y aproximadamente 100 mg, entre aproximadamente 0 .5 mg y aproximadamente 50 mg, entre aproximadamente 0 .5 mg y aproximadamente 25 mg, entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 100 ¦mg, entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 50 mg , o entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 25 mg) del polipéptido emisión de fluorescencia por gramo de pasta de(ntal.
En algunos casos, una composición proporcionada en la presente se puede aplicar a los dientes durante un período de tiempo antes de lavar, tragar, o eliminar de tal forma que se altere la apariencia de los dientes (por ejemplo, la apariencia de los dientes se torna más blanca) . Pór ejemplo, una pasta dental configurada para incluir un polipéptido emisor de fluorescencia como se describe en la presente se puede aplicar a los dientes y permanecer en contacto con esos dientes, sin enjuagar, durante entre 30 segundos y 10 minutos (por ejemplo, entre 30 segundos y 5 minutos,' entre 30 segundos y 2.5 minutos, entre 30 segundos y dos minutos, entre 1 minuto y 10 minutos, entre 2 minutos y 10 minutos, o entre un minuto y 5 minutos) .
En algunos casos, los dientes de una persona se pueden preparar antes de suministrar una composición proporcionada en la presente. Por ejemplo, los dientes de una persona se pueden lavar, cepillar, o pulir, (po,r ejemplo, pulirse con piedra pómez) antes de suministrar una composición suministrada en la presente. En algunos casos, la superficie dental o dientes que serán tratados se pueden tratar con uno o más agentes capaces de exponer los sitios de unión con fosfato de calcio. Por ejemplo, los dientes que serán tratados con una composición proporcionada en la presente se pueden poner en contacto con EDTA o ácido fosfórico para exponer los sitios de unión de fosfato de calcio presentes en los dientes. En el caso del tratamiento con ácido fosfórico, sólo el esmalte del diente puede estar expuesto al ácido para evitar o reducir el riesgo de daño a un tejido suave.
En algunos casos, se puede utilizar un proceso de dos o más pasos para aplicar a los dientes un polipéptido emisor de fluorescencia. Por ejemplo, una composición que contiene una molécula (por ejemplo, un polipéptido) que tenga la capacidad de interactuar o unirse a un diente o un componente dental se puede suministrar a los dientes que serán tratado como un paso seguido por el paso de suministrar un polipéptido emisor de fluorescencia que tenga la capacidad de interactuar con o unirse a la molécula administrada. En algún caso, estos dos pasos se pueden realizar al mismo tiempo utilizando una sola composición que contenga la molécula por separado del polipéptido emisor de fluorescencia o al utilizar composiciones por separado donde una composición contenga la molécula y otra composición contenga el polipéptido emisor de fluorescencia.
En algunos casos, se puede realizar un análisis para confirmar que una composición proporcionada en la presente o un componente de una composición proporcionada en la presente (por ejemplo, un polipéptido de caseína) tenga afinidad de unión para los dientes o un componente dental. Por ejemplo, un material que será probado se puede incubar con una matriz de hidroxiapatita (HA) y la cantidad del material en solución después de la unión de HA se puede comparar con la concentración inicial para determinar, por diferencia, la cantidad de material unido. Véase, por ejemplo, Raj et. al., J. Biol. Chem., 267:5968-5976 (1992). En algunos casos, el material unido de HA se puede medir directamente después de disolver la matriz de HA con EDTA (Lamkin et. al., J. Dent . Res., 75:803-808 (1996)). En el caso de un material polipeptídico, la concentración de polipéptidos en solución se pueden medir utilizando un análisis con ácido bicinconínico y/o un análisis de ortoftalaldehido-amina . Las constantes de unión se pueden determinar utilizando el modelo Langmuir (Bouropoulos and oradian-Oldak Calcif. Tissue Int., 72:599-603 (2003)). En algunos casos, un análisis se puede realizar con : una matriz de HA que fue pre-incubada con saliva humana para recubrir la HA con las proteínas como se describe en otra parte (Lamkin et al., J. Dent. Res., 75:803-808 (1996)). En estos casos, las proteínas sueltas de saliva se pueden eliminar mediante ¦lavado, ya que su presencia puede interferir con las determinaciones de la concentración de polipéptidos.
Se puede utilizar cualquier método adecuado para evaluar la afinidad de una composición proporcionada en la presente para los dientes o una matriz de HA. Por ejemplo, las composiciones unidas y sueltas se pueden cuantificar al medir la fluorescencia del polipéptido emisor de fluorescencia de la composición. La capacidad para utilizar la fluorescencia para la cuantificación puede permitir que se pueda medir la unión de la composición a HA en presencia de saliva humana. En algunos casos, una composición proporcionada en la presente se puede evaluar para la capacidad de unirse in vitro a dientes humanos. Los dientes se pueden someter a diferentes grados de limpieza, tal como, cepillado o pulido con piedra pómez. Los dientes luego se pueden tratar con saliva humana para formar Ta película dental adquirida e incubar con una composición proporcionada en la presente en presencia y ausencia de saliva. La unión a los dientes se puede determinar al medir la fluorescencia tanto unida como suelta. La extracción de los polipéptidos emisores de fluorescencia unidos de los dientes se puede completar utilizando procedimientos leves. Por ejemplo, los dientes se pueden limpiar con torunda con tiras para recolección con papel filtro, y los polipéptidos: se pueden extraer del papel bajo condiciones leves como se describe en otra parte (Siqueira y Oppenheim, Archives of Oral Biology, ? ;
54:437-444 (2009)) . En algunos casos, los dientes se pueden analizar mediante microscopía de fluorescencia para evaluar la cantidad relativa del polipéptido emisor de fluorescencia unido bajo diferentes condiciones.
Se puede utilizar cualquier método adecuado para evaluar una composición proporcionada en la presente por la capacidad para alterar la apariencia de los dientes. Por ejemplo, se pueden utilizar técnicas de inspección visual para determinar si la composición proporcionada en la presente puede alterar o no la apariencia de los dientes. Estas técnicas de inspección visual pueden incluir utilizar guías de tonos para comparación, como se describe en otra parte (Paravina et. al., J. Esthet. Restor. Dent . , 19:276-283 (2007)). En algunos casos, la capacidad de una composición proporcionada en la presente para alterar la apariencia de los dientes (por ejemplo, para hacer que los dientes parezcan más blancos) se pueden medir utilizando espectrofotometría por reflectancia . En estos casos, los dientes se pueden iluminar con una fuente de luz blanca y analizar para la cantidad de luz absorbida a diferentes longitudes de onda mediante espectrofotometría por reflectancia (colorimetría ) . Estas mediciones luego se pueden repetir con la luz UV filtrada de la fuente de luz. La diferencia en los! valores de reflectancia obtenidos con la inclusión y exclusión de luz UV es el espectro fluorescencia UV de la superficie dental (véase, por ejemplo, Park et. al., M. Dental Materials, 23:731-735 (2007)).
Una composición proporcionada en la presente pueden tener un bajo riesgo de toxicidad para la persona que está utilizando la composición, puede contener uno o más polipéptidos de origen humano, puede contener uno o más polipéptidos de presentes en la naturaleza en productos alimenticios o de bebidas y/o puede carecer potencialmente de tintes tóxicos.
La invención se describirá adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 - Métodos para obtener mezclas de polipeptido y caseína
La caseína, a-caseína, y ß-caseína se hicieron reaccionar con tripsina para producir los fosfopéptidos de caseína respectivos (caseína-PP, a-caseína-PP,, y ß-??-caseína) . La tripsina y las tres caseínas se adquirieron de Sigma-Aldrich. Los métodos utilizados en estas preparaciones se adaptaron de aquellos descritos en otra parte (Reynolds et. al., Anal. Biochem., 217:277-284 (1994)). En resumen, se realizó una hidrólisis de los polipéptidos de caseína, ct-caseína, y ß-caseína en reacciones de 3 mL que contuvieron 60 mg del polipéptido, del tampón Tris 0.05 M (pH 8), y, ya sea 1.2 mg, 0.6 mg o 0.3 mg de tripsina. Las reacciones se dejaron proseguir durante la noche a temperatura ambiente (21°C) en cuyo tiempo se ajustó el pH de las mezclas de reacción a pH 4.6 con ácido clorhídrico 1 M. Cualquier precipitado en esta etapa se retiró mediante centrifugación (12,000 x g durante 15 minutos). Luego se agregó una solución de cloruro de calcio al 10% en agua para ajustar la concentración de calcio al 1%, y los polipéptidos que contuvieron múltiples grupos de fosfoserina se precipitaron mediante la adición de un volumen igual de etanol al 100%. Los polipéptidos precipitados se recolectaron mediante centrifugación (12,000 x g durante 15 minutos). Los precipitados se volvieron a disolver en 0.5 mi ;de fosfato amortiguado con solución salina para análisis.
La concentración de polipéptido en los precipitados se determinó mediante un análisis con ácido bicinconinico utilizando los reactivos y el protocolo en el kit para análisis Pierce BCA. Los tamaños y concentraciones relativas de los polipéptidos después de la hidrólisis con tripsina se determinaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) utilizando geles de tripsina al 16.5% (BioRad) . Las muestras (10 yl) se mezclaron con un volumen igual de tampón con una muestra de Tricina (BioRad) y se calentaron a 95°C durante 5 minutos antes de ser cargados en un gel y tratados con electroforesis durante 100 minutos a 100 voltios (constante) a temperatura ambiente. Los geles se fijaron al agitarlos suavemente durante 1 hora a temperatura ambiente en una solución de metanol al 40%/ácido acético al 10% y luego se tiñeron mediante incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente en una solución de azul Coomassie Brilliant al 50% (BioRad) y 50% de la solución de fijación. Por último, los geles se destiñeron mediante agitación suave durante la noche en ácido acético al 1%.
La caseína se hidrolizó a pH 8 en reacciones de 3 mi que contuvieron 60 mg de caseína y 1.2 mg, 0.6 mg y 0.3 mg de tripsina. El porcentaje de los polipéptidos producidos mediante las reacciones de hidrólisis que se recuperaron mediante el procedimiento de precipitación fueron 9%, 9%, y 13% para las reacciones que contuvieron 1.2 mg, 0.6 mg, y 0.3 mg de tripsina, respectivamente. El análisis mediante SDS-PAGE indicó que, en todos los casos, la caseína se hidrolizó a una mezcla de polipéptidos más pequeños. Después de la precipitación, el material recuperado de las tres reacciones fue principalmente polipéptidos de peso molecular pequeño.
La a-caseína y la ß-caseína se hidrolizaron en reacciones de 3 mi a pH 8 que contuvo 60 mg de polipéptidos y 1.2 mg de tripsina. Los precipitados de cloruro de calcio/etanol para a-caseína y ß-caseína contuvieron 4% y 7% de los polipéptidos hidrolizados, respectivamente. El análisis mediante SDS-PAGE indicó que las muestras precipitadas contuvieron mezclas de polipéptidos.
Ejemplo 2 - Formación de conjugados de los polipéptidos de BFP y moléculas que tienen la capacidad de interactuar o unirse a un componente dental
La ß-caseína sin marcar (Sigma-Aldrich) , los fosfopéptidos de ß-caseína (producida de acuerdo con el Ejemplo 1), y la estaterina (1-25) -C (Biomatic) se conjugaron para los polipéptidos de BFP obtenidos de Biovision para formar conjugados de ß-caseína/BFP, conjugados de ß-caseína-PP/BFP y conjugados de estaterina ( 1-25) C/BFP, respectivamente. Este ejemplo describe la conjugación de ß-caseína, aunque la conjugación de los fosfopéptidos de a-caseína y ß-caseína se realizó utilizando procedimientos similares. En resumen, se preparó BFP activada por maleimida en una reacción de 3 mi que contuvo 1 mg/ml de BFP, 0.33 mg/mL SM(PEG)4 (Pierce, cat # 22104), 2 mM EDTA, ween 20 al 0.05% y tampón de fosfato de sodio 0.05 M (pH 7.2). La reacción se dejó proseguir durante 40 minutos a temperatura ambiente y luego se desaló en una columna G-2,5 Sephadex equilibrada con tampón MES 5 mM (pH 6) , EDTA 2 mM, y Tween 20 al 0.05%.
La ß-caseina activada con tiol se preparó en una reacción de 2 mi que contuvo 4.5 mg/ml de ß-caseina, 2-iminotiolano 5 mM, EDTA 2 mM, Tween 20 al 0.0,5%, y tampón de borato de sodio 0.05 M (pH 8.0) . La reacción se dejó proseguir durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se desaló en una columna G-25 Sephadex equilibrada en tampón de fosfato de sodio 0.05 M (pH 7.0), EDTA 2 mM, y Tween 20 0.05%. Este material se utilizó en la reacción de conjugación inmediatamente después de la preparación.
El conjugado de ß-caseina/BFP se preparó en una reacción de 3.825 mi que contuvo 0.37 mg/ml de BFP activada con maleimida, 1.57 mg/ml de ß-caseina activada . con tiol, EDTA 2 mM, Tween 20 al 0.05%, y tampón de fosfato de sodio 0.05 M (pH 7.0). La reacción se dejó proseguir durante 1 hora a temperatura ambiente y luego cualesquiera tioles restantes
i ;
se inactivaron mediante la adición de 0.038 mi de una solución recién preparada de N-metilmaleimida 0.1: M en agua desionizada.
El conjugado se concentró a 1.5 mi vía un concentrador centrifugo (corte 10 kDa) y luego se aplicó a una columna HiLoad Superdex 200 16/600 (GE Healthcare) equilibrada en solución salina amortiguada con fosfato que contuvo Tween 20 al 0.05%. La columna se eluyó a 1.1 ml/minuto, y se recolectaron fracciones de 1.5 mi y se analizaron mediante fluorescencia (320 nm de ;excitación, 445 nm de emisión) y la concentración total de proteína (análisis con ácido bincinconínico) .
Debido a que tanto ß-caseína como BFP contuvieron múltiples grupos de activación, se formaron en la reacción diversos conjugados de varios tamaños. Los ejemplos de conjugados de tamaño diferente son ß-caseína-BFP, ß-caseína-BFP- -caseína; ß-s33ß??3-?G?-ß-?33?1?3-?G?, etc. La columna Superdex 200 separada de los materiales de partida más pequeños provenientes de los conjugados se basan en el tamaño molecular. Sin embargo, la columna támbién, separó parcialmente los conjugados de tamaño diferente producidos en la reacción. Los productos de la columna se recolectaron en dos agrupaciones: los productos de mayor peso molecular que eluyeron primero de la columna y los productos de menor peso molecular que se eluyeron después de los productos de mayor peso molecular, aunque antes que los materiales de partida sin reaccionar. Después de que las dos agrupaciones de producto se concentraron mediante filtración molecular, la agrupación de menor peso molecular (0.28 mg/ml de contenido de BFP) exhibió mayor unión a los dientes que la , agrupación de mayor peso molecular (0.36 mg/ml de contenido de BFP) . La fracción de bajo peso molecular con mayor unión se utilizó en los ejemplos mostrados más adelante.
El fosfopéptido de ß-caseina se trató con tiol, se acopló a la BFP activada por maleimida, se purificó en una columna Superdex 200, y se concentró como se describió para ß-caseina. La fracción de mayor peso molecular del fosfopéptido-BFP de ß-caseina tuvo una concentración de 0.38 mg/ml y la fracción de menor peso molecular tuvo una concentración de 0.48 mg/ml.
Se preparó un conjugado típico de estaterina ( 1-25)C/BFP en una reacción de 1.4 mi que contuvo 1.1 mg/ml de BFP activada con maleimida, 1.1 mg/ml de estaterina ( 1-25 ) C, EDTA 2 mM, Tween 20 al 0.05% y tampón de fosfato de sodio 0.05 M (pH 7.0). La estaterina ( 1-25 ) C contuvo un tiol libre y no requirió activación. Aunque existe sólo un grupo activo por molécula de estaterina, múltiples moléculas de estaterina se pueden unir a una sola BFP activada, creando una distribución del producto. Los productos se 1 separaron parcialmente entre sí en la columna de Superdex 200 dando por resultado en una fracción de mayor peso molecular (0.22 mg/ml de contenido BFP) y una fracción de menor peso molecular (036 mg/mL de contenido BFP) . La fracción de mayor peso molecular se utilizó en el ejemplo de unión/extracción mostrado más adelante. ?
Ejemplo 3 - Aplicación de los conjugados que contienen el polipeptido de BFP a los dientes
Los conjugados ß-caseína/BFP (aproximadamente 0.09 mg/ml) , los conjugados de ß-caseína-PP/BFP (aproximadamente 0.24 mg/ml), y los conjugados de estaterina ( 1-25 ) C/BFP (aproximadamente 0.05 mg/ml) se incubaron con dientes no recubiertos o dientes recubiertos con saliva durante aproximadamente una hora. Después de una hora' de incubación, los dientes se lavaron, y las proteínas unidas se¦ extraj eron de los dientes con EDTA al 0.4 por ciento seguido por SDS al 2 por ciento. La cantidad de proteína extraída en cada solvente de extracción se determinó vía un análisis de fluorescente (Tabla 1) . 1 :
Tabla 1
5
10
15
Estos resultados demuestran que los conjugados de ß-caseína/BFP, los conjugados de ß-caseín-PP/BFP y los conjugados de estaterina (1-25) C/BFP tuvieron la capacidad de unirse a los dientes.
Se realizaron experimentos adicionales utilizando conjugados de ß-caseina/BFP para evaluar los efectos del pH y la temperatura en la unión. No hubo cambio significativo en la unión de los conjugados de ß-caseina/BFP a los dientes a partir de un pH 6 hasta pH 9. Además, no hubo un efecto significativo de la temperatura (21°C hasta 37 °C) sobre la unión de los conjugados de ß-caseina/BFP a los dientes.
En otro experimento, los conjugados de ß-caseina/BFP se incubaron con los dientes en presencia de etanol al 40 por ciento. En algunos casos, se encontró que un tampón que contuvo etanol al 40 por ciento aumenta el nivel de unión de los conjugados de ß-caseina/BFP a los! dientes en comparación con el uso de conjugados de ß-case'ina/BFP en ausencia de etanol.
El pre-tratamiento de los dientes con EDTA al 2 por ciento durante una hora dio por resultado en un aumento en el nivel de unión de los conjugados de ß-caseina/BFP y los conjugados de estaterina (1-25) C/BFP a los dientes.
Lo siguiente se realizó para evaluar el blanqueo de los dientes. En resumen, se incubaron dientes apomazados con SDS al 2 por ciento durante 30 minutos, seguido de una incubación con etanol al 50 por ciento durante 10 minutos. Después de 10 minutos de incubación con etanol al 50 por ciento, los dientes se expusieron a un tampón de unión que contuvo sales de saliva durante 30 minutos y luego se incubaron con EDTA al 2 por ciento durante una hora. Después de una hora de incubación con EDTA, los dientes se expusieron al conjugado que contiene BFP durante una hora ,y luego se lavaron. El conjugado unido se extrajo con SDS al 2 por ciento durante 30 minutos a 37°C y se midió. En este punto, los dientes se apomazaron y opcionalmente se volvieron a utilizar en un experimento posterior. Las muestras se analizaron generalmente para blanqueo (a) después del tratamiento con EDTA y antes de la unión deí conjugado, (b) después del paso de unión con el conjugado de una hora, (c) después del paso de extracción de SDS, y (d) después del apomazado. En cada uno de estos pasos, los 'dientes se analizaron utilizando un análisis con guia de tonos, formación de imágenes de fluorescencia y/o fotografía (por ejemplo, un ajuste de cámara fija, iluminación , (bulbos de 6226.85°C (6500°K)), y colocación de la muestra). Las muestras del extracto de SDS se analizaron para fluorescencia. ,
Los conjugados de ß-caseína/BFP en presencia de tampón que contuvo etanol al 40 por ciento1 blanquearon de manera reproducible los dientes según se determinó mediante el análisis con guia de tonos y comparaciones fotográficas (figura 10) . Los conjugados de ß-caseína/BFP ,en presencia de tampón solo, se evaluaron utilizando el análisis de guia de tonos y se encontró que blanquearon los dientes. Los conjugados de estaterina (1-25) C/BFP en presencia dé etanol al 40 por ciento blanquearon los dientes según se determinó mediante análisis con guia de tonos y comparaciones fotográficas. El nivel de blanqueo fue menor que el de los conjugados de ß-caseina/BFP . Los conjugados de estaterina ( 1-25) C/BFP en presencia de tampón solo exhibieron poco o ningún blanqueo con base en la guia de tonos y análisis fotográficos. ¡
En algunos casos, las mediciones de blanqueo que confirmaron la capacidad de los conjugados para blanquear los dientes se realizaron después de que los dientes se lavaron con tampón. Estos resultados indican que el conjugado unido no se retiró fácilmente. Después de apomazar, los dientes perdieron su blancura. Antes de apomazar, sin embargo, los dientes se lavaron con tampón y se extrajo con SDS para retirar el conjugado. Después de este tratamiento con SDS, los dientes fueron sólo marginalmente menos blancos que antes del lavado con tampón y la extracción con SDS. Estos resultados también indican que el conjugado unido no se retiró fácilmente.
Tomados conjuntamente, los resultados proporcionados en la presente demuestran que los conjugados tales como los conjugados de ß-caseina/polipéptido de BFP tienen la capacidad de unirse a los dientes y hacer que parezcan modestamente más blancos.
Ejemplo 4 - Aplicación de una composición que contiene polipéptidos de BFP a dientes humanos
Una composición de pasta dental estándar se utilizó para limpiar un diente de humano utilizando técnicas estándar de cepillado. Una vez que los dientes se limpiaron, el humano auto-aplicó una composición de pasta que contiene los polipéptidos de BFP a los dientes limpiados. Una vez aplicada, la composición que contiene los polipéptidos de BFP se dejó permanecer en contacto con los dientes durante al menos 30 segundos (por ejemplo, entre aproximadamente 30 segundos y 60 minutos) . Después de este periodo de tiempo, los dientes se enjuagaron.
Otras modalidades
Se debe entender que mientras que la invención se ha descrito junto con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la invención, que se define por eí alcance de las reivindicaciones anexas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones quedan dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.
Claims (20)
1. Un método para alterar la apariencia de los dientes, caracterizado porque el método comprende aplicar un polipéptido emisor de fluorescencia a los dientes, en donde la fluorescencia emitida del polipéptido emisor de fluorescencia altera la apariencia de los dientes.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los dientes son dientes humanos.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el método comprende alterar la apariencia de los dientes de tal forma que los dientes parezcan más blancos.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido emisor de fluorescencia es un polipéptido de BFP.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido emisor de fluorescencia está conjugado a una molécula que tiene la capacidad de interactuar o unirse a un diente o un componente dental .
6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la molécula es un polipéptido.
7. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la molécula es 1 un polipéptido caseína .
8. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la molécula es un1 polipéptido de estaterina.
9. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la molécula es una molécula que tiene la capacidad de interactuar o unirse, al esmalte, hidroxiapatita, o película dental adquirida.
10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido emisor de fluorescencia es un polipéptido de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de caseína.
11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido emisor de fluorescencia es un polipéptido de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de estaterina.
12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido emisor de fluorescencia está presente dentro de la pasta dental, , y él paso de aplicación comprende aplicar la pasta dental a los dientes.
13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido emisor de fluorescencia es una unidad de un polímero que comprende dos 1 o más polipéptidos emisores de fluorescencia.
14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el polímero está unido a un polipéptido de caseína para formar un complejo, en donde el complejo se aplica a los dientes.
15. Una composición caracterizada porque comprende i : un polipéptido emisor de fluorescencia y un: polipéptido de caseína .
16. Una composición caracterizada porque comprende un polipéptido emisor de fluorescencia y un polipéptido de estaterina.
17. Un polipéptido quimérico caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos de 20 o más residuos de longitud de un polipéptido emisor de fluorescéncia y una secuencia de aminoácidos de 20 o más residuos de longitud de un polipéptido de caseína.
18. El polipéptido quimérico de la reivindicación 17, caracterizado porque el polipéptido quimérico comprende un polipéptido emisor de fluorescencia de longitud' total o un fragmento del mismo que es al menos aproximadamente 90 por ciento idéntico al polipéptido emisor de fluorescencia de longitud total, en donde el polipéptido quimérico comprende una polipéptido de caseína de longitud total! o un fragmento del mismo que es al menos aproximadamente el 80 por ciento idéntico al polipéptido de caseína de longitud total, en donde el polipéptido quimérico comprende ija capacidad de emitir fluorescencia y la capacidad de interactuar o unirse a un diente o un componente dental.
19. Un polipéptido quimérico caracterizado porque I ¡ i comprende una secuencia de aminoácidos de 20j o más residuos de longitud de un polipéptido emisor una secuencia de aminoácidos de 20 o más de un polipéptido de estaterina.
20. reivindicación quimérico compr longitud total aproximadamente 90 por ciento idéntico al pojlipéptido emisor de fluorescencia de longitud total, en donde el ; polipéptido quimérico comprende una polipéptido de estatejrina ; de longitud total o un fragmento del mismo que es al menos aproximadamente 80 por ciento idéntico al polipéptido de estaterina de longitud total, en donde el polipéptido quimérico comprende la capacidad de emitir fluorescencia y la capacidad de interactuar o unirse a un diente o un componente dental.
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