CN102448483A - 用于口腔护理体系的肽组合物 - Google Patents
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Abstract
提供了口腔护理组合物、口腔护理体系、口腔表面结合肽和将微粒施用到口腔表面的方法。所述口腔护理体系包括至少一种肽组分,所述肽组分包含对口腔表面具有亲和力的第一结合元件和对微粒的配体部分具有亲和力的第二结合元件。
Description
本专利申请要求于2009年3月30日提交的美国临时专利申请61/164,476的权益。
发明领域
本文提供肽基组合物、口腔护理体系、以及将微粒施用到口腔表面的方法。
发明背景
牙齿的美容外观,对许多人来说非常重要。这些人通常期望“闪亮的”笑容和亮白的牙齿。遗憾的是,牙齿的表面颜色一般发暗,并且由于牙齿材料的吸收性质,会随时间而变色。
牙齿颜色受内在因素如年龄和遗传,以及外在因素如使用多种食品、饮料、药物和烟草导致的变色等影响。甚至在进行定期刷牙和牙线洁齿的情况下,暴露于变色和褪色的物质可导致明显的变色。因此,需要快速并安全地增白牙齿的产品和方法。
牙齿变色问题的一个解决方案是施用由瓷、复合材料或陶瓷制成的贴面。然而,施用贴面费用昂贵并且需要培训的牙科专业人员的帮助。
可使用漂白剂增白牙齿。一些漂白剂的施用可能需要牙科专业人员(即,施用浓缩的氧化剂)的帮助和/或多次施用,并且可能达不到期望的增白程度。非处方漂白产品通常使用较低浓度的漂白剂,并且常常需要多次施用该产品以达到期望的效应。然而,使用漂白剂已经与若干个不期望的副效应相关联,包括化学烧伤、对牙龈的刺激和增加牙齿敏感度。
也可使用增白着色剂增白牙齿。无毒着色剂通常是白色颜料或白色颜料与其它非白色颜料的组合以达到较“天然的”白色外观。然而,使用颜料微粒改善牙齿美容外观一般缺乏达到期望美容效应所需的耐久性。
已经进行了各种尝试以提高牙齿增白剂的结合耐久性。授予Ibrahim等人的美国专利公开申请公布2005-0069501描述了使用硅氧烷粘合剂和增白微粒(羟基磷灰石粉末)作为牙齿增白组合物。Shimako等人的PCT公开WO2006/068011公开了牙齿增白组合物,其包含(A)一种或多种颜料,所述颜料选自二氧化钛、二氧化硅、氧化锌、氧化铝、氧化镁和氧化锆,(B)普鲁兰多糖,和(C)选自溶菌酶、阳离子纤维素和聚赖氨酸的一种或多种成分,其中组分(B)和(C)用于将金属氧化物粉末连结到牙齿表面上。无参考文献公开包含肽基试剂的牙齿增白体系,所述试剂包含对牙齿表面具有强亲和力的第一结合元件和能够非共价地结合到微粒有益剂的配体部分的第二结合元件,如白色颜料。
共同拥有的美国专利7,220,405公开了与毛发、皮肤和指/趾甲以高亲和力结合的肽序列和肽基护发素以及毛发、皮肤和指/趾甲的着色剂。共同未决的和共同拥有的美国专利申请公布2005-0226839、2008-0152600和2008-0280810公开了通过生物淘选鉴定的若干个牙齿结合肽。
除了使用颜料增白牙齿之外,还可以使用微粒向口腔表面递送多种其它有益剂。非限制性实例可包括酶、抗斑剂、防污剂、抗微生物剂、防龋剂、调味剂、凉爽剂、或流涎剂。因此,一般需要提供组合物和方法以提高施用于口腔表面(如牙齿表面)的微粒有益剂的耐久性。
所要解决的问题是提供口腔护理体系、口腔护理肽和使用此类组合物用于肽介导的施用或将口腔护理有益效剂施用到口腔表面的方法。
发明概述
本文提供的是口腔护理体系、口腔护理肽、包含口腔护理肽的口腔护理组合物和将口腔护理有益剂施用到口腔表面的方法。
本文提供的口腔护理体系包括:
(a)肽组合物,其包含
(i)第一结合元件,其与口腔表面的亲和力具有10-5摩尔或更低的MB50值;和
(ii)第二结合元件;和
(b)包含微粒的组合物,所述微粒包含:
(i)有益剂;和
(ii)配体部分(ligand property);其中所述微粒具有在0.01微米至10微米范围内的平均粒度;并且
其中所述第二结合元件和配体部分非共价地或通过螯合而彼此缔合。
在一个实施方案中,包含微粒的组合物是所述微粒的稳定分散体。在一些实施方案中,提供的口腔护理体系具有稳定分散体,其中所述稳定分散体是电荷稳定的。还提供了其中稳定分散体的zeta电位绝对值为至少25mV的体系。稳定分散体可为空间稳定的。稳定分散体可包含分散剂,如离子分散剂、非离子分散剂或它们的组合。
在一个实施方案中,第二结合元件和配体部分之间的缔合是基于离子键的、基于氢键的、基于螯合的、基于生物亲和力的、基于静电的或它们的组合。
在一个实施方案中,第二结合元件和配体部分选自生物素和亲和素、生物素和链霉亲和素、链霉亲和素标记和链霉亲和素、麦芽糖结合蛋白和麦芽糖、麦芽糖结合蛋白和淀粉酶、聚组氨酸标记和包含金属离子的亲和介质、谷胱甘肽S-转移酶和谷胱甘肽、表位标记和抗体、以及它们的组合。
在另一个实施方案中,第一结合元件包含多个口腔表面结合肽,并且在一些方面,多个口腔表面结合肽包含一种以上的相同口腔表面结合肽。
在另一个实施方案中,口腔表面是牙齿表面,并且所述牙齿表面是釉质或表膜。在一些方面,第一结合元件对口腔表面的结合亲和力比它对微粒具有的结合亲和力更大。
在另一个实施方案中,有益剂包含着色剂、增白剂、酶、抗斑剂、防污剂、抗微生物剂、防龋剂、调味剂、凉爽剂、流涎剂或它们的任意组合。
在另一个实施方案中,有益剂为着色剂,并且所述着色剂可为颜料如TiO2。在一些方面,在分开的容器中提供肽组合物和微粒。
在另一个实施方案中,口腔护理体系包含钛,所述钛具有的氨基酸序列选自SEQ ID NO:64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、120、121、122、123、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143和144。
在另一个实施方案中,口腔护理体系包含钛,所述钛具有的氨基酸序列选自SEQ ID NO:145、146、147、148、149、150和151。
在另一个实施方案中,肽组合物包含钛,所述钛具有的氨基酸序列选自SEQ ID NO:161、162、163和166。
在另一个实施方案中,肽组合物包括第二结合元件,所述第二结合元件具有的氨基酸序列选自SEQ ID NO:116、117、119、152、153、154、155、156、157、165和168。
本文提供了多钛,所述多钛包含的氨基酸序列选自SEQ ID NO:64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、120、121、122、123、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143和144。
在一个方面,提供了多钛,所述多钛包含的氨基酸序列选自SEQ IDNO:161、162、163和166。
还提供了包含一种或多种上述多肽的口腔护理组合物。
本文还提供了将口腔护理有益剂施用到口腔表面的方法,所述方法包括:
(a)提供口腔护理体系,所述口腔护理体系包括
(i)肽组合物,其包含
(1)第一结合元件,其与口腔表面的亲和力具有10-5摩尔或更低的MB50值;和
(2)第二结合元件;和
(ii)包含微粒的组合物,所述微粒包含
(1)有益剂;和
(2)配体部分;其中所述微粒具有在0.01微米至10微米范围内的平均粒度;并且其中第二结合元件和配体部分非共价地或通过螯合而彼此缔合;以及
(b)使口腔表面与(a)的口腔护理体系接触,从而将所述有益剂施用到所述口腔表面。
在本发明方法的一个实施方案中,使口腔表面首先与肽组合物接触,然后与包含微粒的组合物接触。
在本发明方法的一个实施方案中,包含微粒的组合物是所述微粒的稳定分散体。在一些实施方案中,稳定分散体是电荷稳定的。
还提供了口腔护理体系和方法,其中所述稳定分散体的zeta电位绝对值为至少25mV。稳定分散体可为空间稳定的。稳定分散体可包含分散剂,如离子分散剂、非离子分散剂或它们的组合。
生物序列简述
根据下面的发明详述和附带的序列描述可以更充分地理解本发明,下面的发明详述和所附的序列描述形成本申请的一部分。
下列序列符合37C.F.R.1.821-1.825(“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求-序列规则”),并且与世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)和EPO和PCT的序列列表要求(规则5.2和49.5(a-bis),以及行政指导的208节和附录C)相一致。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中所列出的规定。
SEQ ID NO:1-40是口腔表面结合肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:41-44、46、48、50-62和160是肽接头的氨基酸序列。
SEQ ID NO:45、47和49是空白。
SEQ ID NO:63是引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:64-94是口腔表面结合肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:95是合成对照肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:96-115是口腔表面结合肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:116是组氨酸亲和标记“HAT”多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:117是带电肽嵌段的氨基酸序列。
SEQ ID NO:118是加到如实施例10所述的若干个序列N-末端的氨基酸序列。
SEQ ID NO:119是聚组氨酸氨基酸序列。
SEQ ID NO:120-123是用于展示肽介导的将钴-NTA聚苯乙烯小珠粘附到釉质上的肽组合物的氨基酸序列。
SEQ ID NO:124是二氧化硅结合肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:125-144是包含表膜结合肽的第一结合元件的氨基酸序列。
SEQ ID NO:145-151是设计用于静电结合到带负电的颜料上的表膜结合缀合物的氨基酸序列。
SEQ ID NO:152-157是第二结合元件的氨基酸序列。
SEQ ID NO:158是柔性的、不带电的肽接头的氨基酸序列。
SEQ ID NO:159是载体pKSI(C4)E-HC77643的核苷酸序列。
SEQ ID NO:161是肽DenP03-C的氨基酸序列。
SEQ ID NO:162是肽DenP03-D的氨基酸序列。
SEQ ID NO:163是肽DE118的氨基酸序列。
SEQ ID NO:164是肽DE118的第一结合元件的氨基酸序列。
SEQ ID NO:165是肽DE118的第二结合元件的氨基酸序列。
SEQ ID NO:166是肽DE101的氨基酸序列。
SEQ ID NO:167是肽DE101的第一结合元件的氨基酸序列。
SEQ ID NO:168是肽DE101的第二结合元件的氨基酸序列。
发明详述
本文提供了组合物、口腔护理体系、以及它们非共价地将微粒耦合到口腔表面的用途。本文所述的口腔护理体系包括有利于口腔表面和微粒之间相互作用的肽基组合物。
在本公开中,使用了大量的术语和缩写。除非另外特别说明,下述定义适用。
如本文所用,在本发明的元件或组分之前的词语“一个”、“一种”和“所述”旨在表明元件或组分的实例(即出现的事物)数量为非限制性的。因此,应将“一个”和“一种”和“所述”理解为包括一个(种)或至少一个(种),并且元件或组分的词语单数形式也包括复数指代,除非该数字明显表示单数。
如本文所用,术语“包含”是指如权利要求中提及的所述特征、整数、步骤、或组分的存在,但不预先排除一种或多种其它特征、整数、步骤、组分或其组的存在或添加。术语“包含”旨在包括由术语“基本上由…组成”和“由…组成”涵盖的实施方案。类似地,术语“基本上由…组成”旨在包括由术语“由…组成”涵盖的实施方案。
如本文所用,用术语“约”修饰成分或反应物的数量时是指数值量的变化,该变化可能发生在例如典型的测量和用于制备浓缩液或实际使用溶液的液体处理程序中;这些程序中的偶然误差中;制造、来源、或用于制备组合物或实施方法的成分的纯度的差异中;等。术语“约”还包括因特定起始混合物所产生的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰,权利要求包括量的等同量。
当存在时,所有的范围均包括端值以及其中的组合。例如,当列出范围“1至5”时,所列范围应视为包括范围“1至4”、“1至3”、“1-2”、“1-2和4-5”、“1-3和5”、等等。
如本文所用,术语“口腔护理体系”指包括一种或多种肽试剂的体系,所述肽试剂有利于将微粒和包含微粒的组合物施用(即,非共价地结合)到口腔表面。在一个实施方案中,包含微粒的组合物是所述微粒的稳定分散体。口腔表面包括存在于口腔内的那些表面,包括软组织如牙龈、舌头和面颊。在一个实施方案中,口腔表面包括牙釉、羟基磷灰石、牙齿表膜和表膜包被的羟基磷灰石。在一个优选的实施方案中,口腔表面包括牙釉或牙齿表膜。
如本文所用,术语“口腔护理组合物”指包含口腔护理体系以及通常存在于口腔护理产品中的组分的组合物,所述组分如口部可接受的载体介质。
本文涉及将微粒施用到口腔表面以在所述表面上产生期望效应。可将此类效应考虑为有益效果,因此该微粒包含“有益剂”。在一个实施方案中,有益效果是增白。在一个优选的实施方案中,微粒包含产生增白效应的有益剂。此类有益剂可为增白剂或着色剂。优选的着色剂包括颜料如TiO2。在一个实施方案中,有益剂可为包含TiO2的微粒或包被二氧化硅的TiO2微粒。
如本文所用,术语“体系的肽基部分”指口腔护理体系的肽组分,所述口腔护理体系包括至少一种肽,其具有耦合到至少一种第二结合元件上的至少一种第一结合元件。在一个实施方案中,口腔护理体系的肽基部分包含共价耦合到第二结合元件上的第一结合元件。
如本文所用,术语“肽组合物”指口腔护理体系的肽基部分。肽组合物优选地包含“第一结合元件”和“第二结合元件”。“第一结合元件”是缺乏骨架蛋白并缺乏免疫球蛋白折叠的单链肽。因此,第一结合元件不包括骨架蛋白、抗体、抗体片段(Fab)以及单链可变片段(scFv;免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)可变区融合)和单结构域羊驼抗体(Muyldermans,S.,Rev.Mol.Biotechnol.(2001)74:277-302)。据一些实施方案的设想,第一结合元件和第二结合元件彼此共价连结。例如,就本文所述的或例示的某些实施方案而言,肽组合物是包括两个结合元件的直链肽,前提条件是第二结合元件不是生物淘选的肽。
第一结合元件
如本文所用,术语“第一结合元件”指包含对口腔表面具有强亲和力的一种或多种口腔表面结合肽的直链肽。在一个实施方案中,第一结合元件包含多个口腔表面结合肽,如牙齿结合肽(例如选择的对牙釉和/或表膜具有强亲和力的肽)。
如本文所用,术语“口腔表面结合肽”指结合到口腔表面上的肽。在一个实施方案中,口腔表面结合肽是非天然存在的肽,其通过生物淘选展示库鉴定和/或获得。在另一个实施方案中,获取自生物淘选的两种或更多种口腔表面结合肽可组合形成第一结合元件。组合两种或更多种口腔表面结合肽以形成较长的结合区域在本文可称为“结合域”。在一个实施方案中,口腔表面结合肽的长度为7个氨基酸至60个氨基酸,更优选地7个氨基酸至25个氨基酸,最优选7个氨基酸至20个氨基酸。在一个优选的实施方案中,口腔表面肽是组合生成的肽。
第一结合元件优选地包含通过生物淘选鉴定的一种或多种口腔表面结合肽。第一结合元件包含多个口腔表面结合肽,它们可为多个具有相同序列的肽或具有不同序列的肽的组合,其任选地被肽间隔区予以分开。在使用具有不同序列的多个肽的情况下,它们均可以被选择结合到相同的口腔表面(例如,所有表膜结合肽)。然而,也考虑加入结合到其它表面或基质的肽。在一些实施方案中,第一结合元件包含下文所述的至少一种“牙齿结合肽”。在一些实施方案中,第一结合元件包含单个口腔表面结合肽或由单个口腔表面结合肽组成。
第一结合元件的长度可在7至600个氨基酸的范围内,优选地在14至600个氨基酸的范围内,更优选地在7至200个氨基酸的范围内,最优选地在14至200个氨基酸的范围内。
应当理解,口腔表面结合肽包括“牙齿结合肽”,它是结合到牙齿表面上的肽。术语“牙齿表面”指由牙釉(通常在专业的清洁或打磨后暴露出来)或牙齿表膜(包括唾液蛋白的获得性表面)构成的口腔表面。因此,也包括“表膜结合肽”或“釉质结合肽”。羟基磷灰石可涂覆有唾液糖蛋白以模拟天然牙齿表膜表面。
如本文所用,术语“表膜”或“牙齿表膜”来源于唾液糖蛋白的薄膜(通常约20nm至约200μm厚),唾液糖蛋白在牙冠表面上形成。日常的刷牙往往仅移除一部分牙齿表膜表面,而研磨清洁牙齿和/或打磨(通常由职业牙医进行)将使更多的牙釉表面暴露出来。
如本文所用,术语“釉质”和“牙釉”将指形成牙齿外层的高度矿化的组织。釉质层主要由结晶磷酸钙(即羟基磷灰石)与水和一些有机材料构成。
牙齿结合肽的实例已经在共同未决的和共同拥有的美国专利公开申请公布2008-0280810-A1中公开并在表A中提供。本文例示了附加的牙齿结合肽。
表A:
口腔表面结合肽的实例
目标表面 | 肽序列 | SEQ ID NO | 参考文献 |
牙齿(表膜) | AHPESLGIKYALDGNSDPHA | 1 | US 2008-0280810 |
牙齿(表膜) | ASVSNYPPIHHLATSNTTVN | 2 | US 2008-0280810 |
牙齿(表膜) | DECMEPLNAAHCWR | 3 | US 2008-0280810 |
牙齿(表膜) | DECMHGSDVEFCTS | 4 | US 2008-0280810 |
牙齿(表膜) | DLCSMQMMNTGCHY | 5 | US 2008-0280810 |
牙齿(表膜) | DLCSSPSTWGSCIR | 6 | US 2008-0280810 |
牙齿(表膜) | DPNESNYENATTVSQPTRHL | 7 | US 2008-0280810 |
牙齿(表膜) | EPTHPTMRAQMHQSLRSSSP | 8 | US 2008-0280810 |
牙齿(表膜) | GNTDTTPPNAVMEPTVQHKW | 9 | US 2008-0280810 |
牙齿(表膜) | NGPDMVQSVGKHKNS | 10 | US 2008-0280810 |
牙齿(表膜) | NGPEVRQIPANFEKL | 11 | US 2008-0280810 |
牙齿(表膜) | NNTSADNPPETDSKHHLSMS | 12 | US 2008-0280810 |
牙齿(表膜) | NNTWPEGAGHTMPSTNIRQA | 13 | US 2008-0280810 |
牙齿(表膜) | NPTATPHMKDPMHSNAHSSA | 14 | US 2008-0280810 |
牙齿(表膜) | NPTDHIPANSTNSRVSKGNT | 15 | US 2008-0280810 |
牙齿(表膜) | NPTDSTHMMHARNHE | 16 | US 2008-0280810 |
牙齿(表膜) | QHCITERLHPPCTK | 17 | US 2008-0280810 |
牙齿(表膜) | TPCAPASFNPHCSR | 18 | US 2008-0280810 |
牙齿(表膜) | TPCATYPHFSGCRA | 19 | US 2008-0280810 |
牙齿(表膜) | WCTDFCTRSTPTSTSRSTTS | 20 | US 2008-0280810 |
牙齿(釉质) | APPLKTYMQERELTMSQNKD | 21 | US 2008-0280810 |
牙齿(釉质) | EPPTRTRVNNHTVTVQAQQH | 22 | US 2008-0280810 |
牙齿(釉质) | GYCLRGDEPAVCSG | 23 | US 2008-0280810 |
牙齿(釉质) | LSSKDFGVTNTDQRTYDYTT | 24 | US 2008-0280810 |
牙齿(釉质) | NFCETQLDLSVCTV | 25 | US 2008-0280810 |
牙齿(釉质) | NTCQPTKNATPCSA | 26 | US 2008-0280810 |
牙齿(釉质) | PSEPERRDRNIAANAGRFNT | 27 | US 2008-0280810 |
牙齿(釉质) | THNMSHFPPSGHPKRTAT | 28 | US 2008-0280810 |
牙齿(釉质) | TTCPTMGTYHVCWL | 29 | US 2008-0280810 |
牙齿(釉质) | YCADHTPDPANPNKICGYSH | 30 | US 2008-0280810 |
牙齿(釉质) | AANPHTEWDRDAFQLAMPPK | 31 | US 2008-0280810 |
牙齿(釉质) | DLHPMDPSNKRPDNPSDLHT | 32 | US 2008-0280810 |
牙齿(釉质) | ESCVSNALMNQCIY | 33 | US 2008-0280810 |
牙齿(釉质) | HNKADSWDPDLPPHAGMSLG | 34 | US 2008-0280810 |
牙齿(釉质) | LNDQRKPGPPTMPTHSPAVG | 35 | US 2008-0280810 |
牙齿(釉质) | NTCATSPNSYTCSN | 36 | US 2008-0280810 |
牙齿(釉质) | SDCTAGLVPPLCAT | 37 | US 2008-0280810 |
牙齿(釉质) | TIESSQHSRTHQQNYGSTKT | 38 | US 2008-0280810 |
牙齿(釉质) | VGTMKQHPTTTQPPRVSATN | 39 | US 2008-0280810 |
牙齿(釉质) | YSETPNDQKPNPHYKVSGTK | 40 | US 2008-0280810 |
第一结合元件可进一步包含接头(“L”)和/或间隔区(“S”)。间隔区可为有机物间隔区和/或肽间隔区。在一个实施方案中,间隔区选自胆胺、乙二醇、链长为6个碳原子的聚乙烯、具有3至6个重复单位的聚乙二醇、苯氧基乙醇、丙醇酰胺、丁二醇、丁二醇酰胺、丙基苯酯、乙基烷基链、丙基烷基链、己基烷基链、甾酰基烷基链、鲸蜡基烷基链和棕榈酰烷基链。在另一个实施方案中,间隔区是肽间隔区。本领域已经描述了合适的间隔区和接头,例如在美国专利公开7,220,405和美国专利公开申请公布2005-0226839、2007-0196305、2006-0199206、2007-0065387、2008-0107614、2008-0280810、2007-0110686、2006-0073111、2006-0222609、2008-0175798和2007-0265431中描述的那些。表B中提供了合适的肽接头/间隔区的一些实例。
表B:
间隔区和接头的实例
如授予Cheng等人的共同未决的美国专利公开申请12/632,831所述的刚性肽接头也是合适的;其以引用方式并入本文。刚性接头可包括但不限于盐桥稳定的α-螺旋形成序列,其通式为:(Xaa1-Xaa1-Ala-Ala-Xaa2-Xaa2)d(SEQ ID NO:57)或(Xaa1-Ala-Ala-Ala-Xaa2)d(SEQ ID NO:58)或(Xaa1-Ala-Ala-Ala-Xaa2-Xaa3-Xaa3)d(SEQ ID NO:59),其中Xaa1=Glu或Asp;Xaa2=Lys或Arg;并且Xaa3=Leu、Val、Ile、Phe、Trp、Met或Tyr;并且其中d=2至10。也包括延长的脯氨酸二肽,其通式为:(Xaa4-Pro)e(SEQ ID NO:60)或(Pro-Xaa4)e(SEQ ID NO:61)或[(Xaa4-Pro)6-Gly-Gly]e(SEQ ID NO:62),其中e=2至20,并且Xaa4是酸性或碱性氨基酸。
有益剂
如本文所用,术语“有益剂”是应用于向口腔表面提供期望/有益效果或属性的化合物或物质的一般术语。在一个实施方案中,口腔表面的有益剂可包含着色剂,其包括但不限于增白颜料如二氧化钛和增白矿物质如羟基磷灰石或锆石。在另一个实施方案中,有益剂也可包括增白剂和酶例如氧化酶、过氧化物酶、蛋白酶、脂肪酶、糖苷酶、酯酶和多糖水解酶。在另一个方面,有益剂可包括抗斑剂、防污剂和抗微生物剂。抗微生物剂可包括但不限于抗微生物肽、爪蟾抗菌肽、抗菌肽、杀菌剂、三氯生、氯己定、十六烷基氯化吡啶季铵化合物、氯二甲苯酚、氯乙醇、邻苯二甲酸及其盐、百里酚、以及它们的组合。有益剂也可包括防龋剂如氟化钠或单氟磷酸钠,以及调味剂如冬青、胡椒薄荷、或留兰香的油,或水杨酸甲酯、桉叶油素、或香草醛。有益剂也可包括凉爽剂如琥珀酸盐基的凉爽剂化合物,以及流涎剂等等。如本文所用,术语“流涎剂”指当存在于口腔护理组合物中时促使使用者流涎更多的材料。在一个实施方案中,有益剂是批准用于口腔护理产品的口部可接受的材料。在另一个实施方案中,口部可接受的有益剂用于改善牙齿的美容外观。
在一些实施方案中,有益剂可为粒状的。在其它实施方案中,有益剂可与微粒缔合或加到微粒上,然后将通过配体部分与第二结合元件缔合。在任何一种情况下,无论有益剂是天然微粒还是与微粒缔合,粒度优选地保持在上述的平均粒度范围内。
就本文所述的口腔护理体系而言,有益剂优选地是粒状的,其平均粒度至少为约0.01微米至约10微米。甚至更优选地,有益剂的平均粒度为约0.1微米至约10微米或约0.1微米至约1微米。动态光散射可用于测量小于约10微米的粒度。
“平均粒度”是用于描述一组微粒的特性的专门术语,无论这组微粒的形状和尺寸是规则的还是不规则的。通过本领域已知的方法测定平均粒度,如光散射方法。本领域的技术人员应当理解本文提到的“粒度”将指使用光散射方法如本领域已知的激光衍射(参见ISO 13320-1:1996;International Organization for Standards,Geneva,Switzerland)和/或动态光散射(参见ISO 13321:1996)方法测量获得的粒度。示例性的体系得自Malvern Instruments Ltd.Worcestershire,United Kingdom。在一个实施方案中,使用动态光散射测量粒度。
第二结合元件和配体部分亲和配对
如本文所用,术语“第二结合元件”指已经被选择作为对施用的有益剂的配体部分具有亲和力的肽组合物部分。不受理论的约束,第二结合元件作为“饵料”使用,以有利于肽组合物与微粒经由“捕获”配体部分发生的相互作用。本发明的一个目的是提供无需通过生物淘选方法(噬菌体展示、mRNA展示等)进行选择、通过配体部分结合到微粒上的第二结合元件。第二结合元件和配体部分通常将彼此具有亲和力,这种亲和力不基于对微粒或配体部分进行的生物淘选。
如本文所用,术语“配体部分”指与有益剂(即,“饵料和捕获组”的“捕获”组分)相缔合的部分,其缔合有益剂与肽组合物的第二结合域(即,“饵料和捕获组”的“饵料”组分;本文也称为“亲和组”)。在一些实施方案中,配体部分可为有益剂固有的,例如有益剂可为带负电的颜料并且第二结合域与负电荷缔合,或者又如,有益剂可为金属或金属离子并且第二结合域(“饵料”)与该金属或金属离子缔合(“捕获”)。在其它实施方案中,可将配体部分赋予有益剂,例如,有益剂可共价连结到链霉亲和素上,并且第二结合域是生物素,其与链霉亲和素缔合(“捕获”),或者有益剂自身可与肽片段耦合并且第二结合域(“饵料”)与耦合的肽片段缔合(“捕获”)。甚至与缔合的配体部分一起,有益剂优选地保持约0.01微米至约10微米的平均粒度。甚至更优选地,平均粒度为约0.1微米至约1微米。
合适的第二结合元件和配体部分组包括那些通过离子键、氢键、疏水相互作用、静电相互作用、螯合、或它们的组合相互作用的组。具体地讲,前提条件是不包括通过共价键物理缔合的第二结合元件和配体部分(即,有益剂的第二元件和配体部分不通过共价键彼此缔合)。因此,合适的缔合是基于离子键的、基于氢键的、基于疏水性键的、基于静电相互作用的、或基于螯合的组分、或是基于它们的组合。在一些实施方案中,第二结合元件和配体部分组基于生物素对亲和素、生物素对链霉亲和素,链霉亲和素标记对链霉亲和素、麦芽糖结合蛋白对麦芽糖、麦芽糖结合蛋白对淀粉酶、聚组氨酸标记对金属(例如,固化于基质如IMAC树脂中的金属离子)、谷胱甘肽S-转移酶对谷胱甘肽、表位标记对抗体、或它们的组合。
在一个优选的方面,第二结合元件和有益剂配体部分之间的缔合是螯合。如本文所用,术语“基于螯合的”配对指路易斯酸和路易斯碱的配位共价键络合物,其中所述路易斯碱向路易斯酸提供两个或更多个电子对。基于螯合的配对的实例是多种氨基酸侧链和金属离子的相互作用。用于基于螯合的配对的示例性金属包括二价金属如镍、铜、钴和锌。
聚组氨酸标记常用于结合固化金属离子如镍(Ni2+)、铜(Cu2+)、钴(Co2+)、或锌(Zn2+)。通常将金属离子加入到介质/树脂如氨三乙酸(NTA)-琼脂糖、HisPur钴树脂、亚氨基二乙酸(IDA)树脂、羧甲基天门冬氨酸(CMA)树脂、TALON(或任何其它固化金属亲和色谱(IMAC)树脂)中。金属亲和树脂可从多个供应商如Thermo FisherScientific(Rockford,IL)、EMD BioSciences(Madison,WI)和Clontech(Palo Alto,CA)商购获得。聚组氨酸亲和标记可为合成的或天然存在的组氨酸亲和标记,如“HAT”标记(KDHLIHNVHKEFHAHAHNK;SEQ ID NO:116)(Clontech Laboratories,Mountain View,CA)。在一个实施方案中,聚组氨酸标记包含6至10个组氨酸残基,优选地6至8个组氨酸残基,最优选地6个组氨酸残基。在另一个实施方案中,聚组氨酸标记的长度为6个至约10个,6个至约8个,或约6个连续的组氨酸残基。
在一个实施方案中,肽组分包含至少一个聚组氨酸标记(例如,第二结合元件),其能够结合到粒状有益剂表面上固化的金属离子(即,配体部分)上。在另一个实施方案中,粒状有益剂包含微粒表面上的有效量的适用介质(例如,金属螯合树脂)。可将金属螯合树脂施用于部分或完全地涂覆粒状有益剂的表面。在另一个实施方案中,施用于粒状有益剂表面上的树脂包含四配位基金属螯合剂(美国专利5,962,641;以引用方式并入本文)。在另一个实施方案中,亲和配对是螯合配对,其包括聚组氨酸标记,即,包含有效数目的组氨酸残基的氨基酸基序,其能够通过微摩尔浓度亲和力结合到树脂固化的金属离子上。将聚组氨酸标记作为第二结合元件掺入到肽组分中,并且将固化金属离子掺入到粒状有益剂中,其中金属离子选自镍、铜、钴、锌、以及它们的混合物。
在一个实施方案中,第二结合元件和有益剂的配体部分可包括离子键或静电相互作用。例如,亲和组可包括离子键配对。如本文所用,术语“离子键”配对指两部分的缔合络合物,其中一部分具有净正电荷,而另一部分具有净负电荷。静电相互作用属于最强键,强度上可与共价键相比,并且是远距的,大约50nm。(Isrealachvili,J.N.,Intermolecularand Surface Forces,第2版;Academic Press:New York,NY(1992)第32-34页)。
某些氨基酸包含可电离的侧链基团,例如天门冬氨酸和谷氨酸侧链中的羧基以及位于赖氨酸、精氨酸和组氨酸残基上的氨基。当任何带电荷的氨基酸位于肽序列中时,一些肽常包含净电荷(正电荷或负电荷)和固定的电荷分布。全部或(一部分)第二结合元件的净电荷能够诱导静电吸引有益剂上电荷相反的配体部分,或者诱导与有益剂上亲和配对第二部分相似电荷的静电相斥。
离子(静电)结合配对的实例包括但不限于带负电的肽耦合到带正电的粒状有益剂上、带负电的肽耦合到包括或涂覆有带正电的涂层(例如阴离子交换树脂)的粒状有益剂上、带正电的肽耦合到带负电的粒状有益剂(例如云母、二氧化硅)上、以及带正电的肽耦合到包含提供负电荷的涂层(例如具有如SO4 -2的基团的阳离子交换树脂)的粒状有益剂上。
可通过合适的表面处理和pH条件获得并调节粒状有益剂配体部分的第二部分上的电荷和电荷密度。电荷可来源于:1)表面功能基团如氨基、羧基、磺酸基和羟基的离子化或2)离子从溶液中的特异吸附性。在这种情况下,“特异吸附性”暗示吸附部分不带电的性质,以便吸附的离子能够产生净表面电荷。就惰性有益剂而言,可使用本领域的多个表面处理方法产生可电离的功能基团:1)使用氧等离子体氧化表面或等离子体聚合特定气体以制备表面羟基和其它基团(C.L.Rinsch等人,Langmuir(1996),12(2995-3002);2)形成具有末端功能基团的自组装单层,例如氨基丙基硅烷在金属氧化物表面上形成硅氧烷单层(Xia,Y.N.和Whitesides,G.M.,Angew.Chem.Int.Ed.(1998),37:551-575);3)使用层-层组装方法以吸附聚电解质多层到任何表面上以提供带电荷的表面,其具有期望的电荷标记和电荷密度(Decher,G.,Science(1997),277:1232-1237);和4)沉淀-涂层带电聚合物或溶胶-凝胶。粒状有益剂的表面电荷能够通过其表面等电点(IEP)进行表征,所述等电点是表面净电荷为零时的pH值。在低于其IEP的pH时,粒状有益剂,具体地讲粒状有益剂上的亲和组的第二部分,带正电荷;而在大于其IEP的pH时,有益剂带负电荷。
可通过离子浓度进一步调节静电相互作用的距离:较低的离子浓度提供较远距的相互作用,而较高的离子浓度提供较近距的相互作用。可应用对相互作用距离的调节以获得低离子浓度下稳定的肽-有益剂加合物,但是在较高离子浓度下促进有益剂递送到口腔表面。
亲和组的第一部分的净电荷可为负电荷或正电荷,这取决于体系的pH。在一个实施方案中,在指定pH下第二结合域的净电荷是正电荷,其中所述pH可在3.0至约10的范围内。在另一个实施方案中,在指定pH下第二结合域的净电荷是负电荷,其中所述pH可在3.0至约10的范围内。
例如,第二结合元件可为带正电的并包含KQPN(SEQ ID NO:117)重复序列或GK重复序列,并且可物理地与带负电的颜料缔合。在一个优选的方面,带负电的颜料是二氧化硅包被的颜料。在另一个方面,带负电的微粒是硅质微粒,如中孔二氧化硅微粒。
在一个优选的实施方案中,第二结合元件是带正电的氨基酸结构域,已知其与带负电的颜料(包被的或未包被的)缔合。应当理解,就基于静电的相互作用而言,第二结合元件和配体部分应带相反的电荷。
在一个方面,第二结合元件和配体部分组可为如本文所述的生物配对并可包括但不限于生物素:亲和素、生物素:链霉亲和素、链霉亲和素标记:链霉亲和素、麦芽糖结合蛋白(MBP):麦芽糖或淀粉酶、以及谷胱甘肽S-转移酶(GST):谷胱甘肽。所述组可包括表位标记:抗体配对以便肽组分的第二结合元件包含表位标记并且粒状有益剂包含对应的抗体或抗体片段。可商购获得的表位标记的实例包括但不限于HA-tag、FLAG-tag、E-tag、S-tag和myc-tag。在另一个实施方案中,第二结合元件和配体部分对不包括表位标记:抗体对。
在另一个实施方案中,第二结合元件和配体部分可在本文所述的体系中互换。例如,可认为生物素是第二结合元件或者是配体部分,这取决于它是否与肽组合物缔合或是否为如本文所述的结合剂。相反地,可认为链霉亲和素是结合元件或配体部分,这取决于其缔合。
就本文所述的口腔护理体系的实施方案而言,肽组合物和有益剂将分别通过结合域和配体部分彼此结合。优选地,第二结合域和配体部分的缔合仅仅是肽组合物和有益剂之间的缔合,并且如上所述,就第二结合元件和配体部分组而言,缔合是基于离子键的、基于氢键的、基于疏水性键的、基于静电的、或基于螯合的、或它们的组合。
在一些实施方案中,第一结合域与口腔表面的结合比它与包含具有配体部分的有益剂的微粒的结合更强。在一些实施方案中,第一结合域与口腔表面的结合比它与微粒的结合(即,更强的结合)低至少一个数量级的MB50值。在其它实施方案中,第一结合域与口腔表面的MB50值比第一结合域与微粒的该值低至少两个数量级。
稳定的微粒分散体和zeta电位
如本文所用,“稳定分散体”指其中微粒被分散、并且其中平均粒度随时间保持相当恒定的基质。就本文所述的目的而言,如果样品的平均粒度经过若干天后提高不超过50%,可认为样品(即,微粒分散体)是稳定分散的。在另一个实施方案中,如果样品中微粒的平均粒度在分散体形成2天内比微粒的初始粒度提高不超过50%,样品可为稳定分散的。在某些实施方案中,在分散体形成后3天内平均粒度有不超过50%的提高。在另一个实施方案中,在分散体形成后至少5天内平均粒度有不超过50%的提高。在其它实施方案中,在分散体形成后7天内平均粒度有不超过50%的提高。在另一个实施方案中,当平均粒度经至少7天后提高不超过50%、未检测到大于50个初级微粒的任何凝聚,可认为该微粒分散体是稳定的。本领域的技术人员将认识到,既然微粒能够用最小量的能量轻易地进行再分散(例如,轻轻地手摇/搅拌,通常是手动混合/摇动以再形成在口腔护理组合物或口腔护理体系内的微粒均匀分散体),则稳定的微粒分散体经过一段时间后可具有一些沉降。
可使用本领域已知的技术获得稳定分散体。在一些实施方案中,稳定分散体是电荷稳定的或空间稳定的。在一些实施方案中,稳定分散体包含分散剂。如本文所用,术语“分散剂”指稳定溶于液体介质中的固体颜料的胶态溶液形成的物质。在一些实施方案中,分散剂是离子分散剂或非离子分散剂。分散剂可包括但不限于月桂基硫酸钠、甲基椰油基牛磺酸钠、泊洛沙姆(poloxomer)407、n-月桂酰肌氨酸钠、十二烷基基苯磺酸钠、PEG-40篦麻油、TWEEN20、椰油酰氨基丙基甜菜碱、月桂基醚硫酸钠。
分散体的稳定性可与zeta电位相关。zeta电位指示在分散体中邻近的、电荷相似的微粒之间的相斥程度。具有高zeta电位(负的或正的)的胶体是电稳定的,而具有低zeta电位的胶体趋于凝结或絮凝(“ZetaPotential of Colloids in Water and Waste Water”,ASTM Standard D4187-82,American Society for Testing and Materials,1985)。
可使用本领域已知的方法/设备测量zeta电位。简言之,在应用电场中测量分散体溶液。使用激光光散射测量在电场中的分散微粒的流动性。使用溶液粘度的已知常数将流动性转化成zeta电位。在一些实施方案中,电稳定分散体的zeta电位绝对值为至少25mV。高绝对zeta电位指示电荷稳定的分散体,其将抗凝并且抗平均粒度的时间依赖性的增长。
结合亲和力
术语“MB50”指结合肽的浓度提供的信号为在基于ELISA的结合测定法中获得的最大信号的50%(参见本发明实施例11和美国公布专利申请2005-0226839)。MB50值指示络合物组分的结合相互作用或亲和力的强度。MB50值越低,肽与其对应基质的相互作用越强。术语“结合亲和力”指结合肽与给定基质的相互作用强度。本文根据以基于ELISA的结合测定法测定的MB50值来定义结合亲和力。
可使用本领域熟知的组合方法选择或可凭经验生成对目标表面具有亲和力的肽(即,目标表面结合肽)。优选地,通过MB50值测得的肽组合物(无论它是否包含一个或多个口腔表面结合肽)的第一结合元件结合到口腔表面上的结合亲和力为小于或等于约10-5M,更优选小于或等于约10-6M,甚至更优选小于或等于约10-7M,甚至更优选小于或等于约10-8M。
在一个实施方案中,术语“高亲和力”或“强亲和力”将用于描述具有结合亲和力的口腔表面结合肽,其通过MB50值进行测量,小于或等于约10-5M,优选小于或等于约10-6M,更优选小于或等于约10-7M,甚至更优选小于或等于约10-8M。
方法和口腔护理体系的使用
本文提供并例示了将微粒施用(即,非共价地结合)到口腔表面的方法,所述方法包括使口腔表面接触肽组合物并随后使肽组合物接触包含配体部分的微粒。在一些实施方案中,微粒也包含口腔有益剂。在一个实施方案中,微粒是有益剂。着色剂和增白剂是优选的口腔有益剂。在一个优选的方面,增白剂包含颜料TiO2。
为了实施提供的某些方法,有必要提供如本文所述的肽组合物和微粒。可将肽组合物施用于口腔表面,随后施用粒状有益剂。可在分开的容器中提供肽组合物和包含粒状有益剂的组合物。应当理解,在施用粒状有益剂之前,优选地施用肽组合物并使其接触口腔表面足够长的时间以结合到口腔表面上。优选地施用粒状有益剂自身并使其接触口腔表面足够长的时间以结合到肽组合物上。
提供的肽组合物和第一结合域也可用于口腔护理体系。在一些实施方案中,肽组合物包含MB50值为约10-5M或更低的、结合到口腔表面上的第一结合元件,并且还包含第二结合元件。口腔护理体系可进一步包含微粒或微粒的稳定分散体、包含有益剂的微粒和配体部分。在优选的体系中,肽组合物和微粒分别通过第二结合元件和配体部分缔合。
口腔表面结合肽的生物淘选和鉴定
在一个实施方案中,口腔表面结合肽是组合产生的,并且其长度在7个氨基酸至60个氨基酸的范围内,更优选地长度在7个氨基酸至25个氨基酸的范围内,最优选地长度在7个氨基酸至20个氨基酸的范围内。由于它们的长度短和直链性质,本发明的口腔表面结合肽前提条件是不包括目标表面结合抗体和目标表面结合单链抗体。口腔表面结合肽可随机生成,然后对目标表面(例如选自牙釉和牙齿表膜的牙齿表面)进行选择。
生成肽随机库的方法是熟知的并且可通过多种技术完成,包括但不限于细菌展示(Kemp,D.J.;Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(7):4520-4524(1981);酵母展示(Chien等人,Proc Natl Acad Sci USA 88(21):9578-82(1991))、组合固相肽合成(美国专利公开5,449,754;美国专利公开5,480,971;美国专利公开5,585,275和美国专利公开5,639,603)、噬菌体展示技术(美国专利公开5,223,409;美国专利公开5,403,484;美国专利公开5,571,698;和美国专利公开5,837,500)、核糖体展示(美国专利公开5,643,768;美国专利公开5,658,754;和美国专利公开7,074,557)、以及mRNA展示技术(PROFUSIONTM;美国专利公开6,258,558;美国专利公开6,518,018;美国专利公开6,281,344;美国专利公开6,214,553;美国专利公开6,261,804;美国专利公开6,207,446;美国专利公开6,846,655;美国专利公开6,312,927;美国专利公开6,602,685;美国专利公开6,416,950;美国专利公开6,429,300;美国专利公开7,078,197;和美国专利公开6,436,665)。用于生成此类生物肽文库的技术在Dani,M.,J.Receptor & Signal Transduction Res.,21(4):447-468(2001)中进行了描述。此外,噬菌体展示库可商购自公司如New England BioLabs(Beverly,MA)。
用于获取目标表面结合肽的优选方法是噬菌体展示。噬菌体展示是一种体外选择技术,其中将肽或蛋白质基因融合到噬菌体的包被蛋白中,导致在噬菌体病毒粒子的外部展示融合肽,而编码融合肽的DNA位于病毒粒子内部。在展示肽和编码它的DNA之间的这种物理连锁允许通过称为“生物淘选”的简单的体外选择程序筛选大量的肽变体,每个肽变体与对应的DNA序列连锁。在它最简单的形式中,生物淘选通过培养具有已经被固化在平板或小珠上的受关注目标的收集噬菌体展示变体、洗涤除去未结合的噬菌体、并且通过破坏噬菌体和目标之间的结合相互作用洗脱特异结合的噬菌体来进行。然后体内扩增洗脱的噬菌体并重复该过程,导致与最牢固结合序列相关的收集噬菌体逐步增多。在3轮或更多轮选择/扩增后,通过DNA测序表征单克隆。
更具体地讲,在已经生成或购买合适的肽库后,使该库接触适量的测试基质。肽库溶解于合适溶液中以接触目标表面,其通常悬浮在溶液中或者可被固定在平板或小珠上。优选的溶液是包含表面活性剂的缓冲盐水溶液。合适的溶液是含有0.5%TWEEN20的Tris缓冲液(TBS)。为了提高肽到目标样品/表面的传质速率,可通过任何装置附加地搅拌溶液,从而缩短达到最大结合所需的时间。
因此,可使用以下方法制备目标表面-结合肽。使组合生成的噬菌体-肽库接触受关注的目标表面(即,口腔表面如牙齿表面)以形成噬菌体肽-目标表面络合物。将噬菌体-肽-目标表面络合物与未络合的肽和未结合的基质分开,并且优选地使用酸性溶液将得自噬菌体-肽-目标表面络合物的结合噬菌体-肽从络合物中洗脱。然后鉴定洗脱的噬菌体-肽并对其测序。要鉴定与一个基质结合但不与另一个基质结合的肽序列,例如结合到另一个表面上的肽(所述表面即,“非目标”表面;例如,另一种材料表面如毛发、皮肤、指/趾甲等),可使用消减淘选步骤。具体地讲,使组合生成的噬菌体-肽库首先接触非目标表面以除去结合到其上的噬菌体-肽。然后使非结合噬菌体-肽接触期望的基质并进行上述过程。作为另外一种选择,组合生成的噬菌体肽库可同时接触非目标表面和期望基质。然后,将噬菌体-肽-目标表面络合物与噬菌体-肽-非目标表面络合物分开,并且按照上述方法处理期望的噬菌体-肽-目标表面络合物。
在一个实施方案中,可使用用于分离对目标表面具有较高亲和力的肽的修改噬菌体展示筛选方法。在该修改方法中,如上所述形成噬菌体-肽-目标表面络合物。然后用洗脱缓冲液处理这些络合物。可使用上述任何洗脱缓冲液。优选地,洗脱缓冲液是酸性溶液。然后,剩余的抗洗脱噬菌体-肽-目标表面络合物用于直接感染细菌宿主细胞如大肠杆菌ER2738。使感染后的宿主细胞在合适的培养基如LB(Luria-Bertani)培养基中生长,并且将这种培养物涂布在琼脂上,所述琼脂包含合适的培养基如带IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖苷)和S-GALTM的LB培养基。在生长后,采集噬菌斑进行DNA分离并测序DNA以鉴定对所关注的目标表面具有高结合亲和力的肽序列。
在另一个实施方案中,可使用如Janssen等人在美国专利公开申请公布2003-0152976中所述的PCR方法,通过直接在噬菌体-肽-目标表面络合物上使用合适引物进行PCR鉴定从上述修改的噬菌体展示筛选方法中获得的抗洗脱噬菌体-肽。
肽生产
可使用标准肽合成方法制备本文所述的肽,该方法是本领域熟知的(参见例如Stewart等人,Solid Phase Peptide Synthesis,Pierce ChemicalCo.,Rockford,IL,1984;Bodanszky,Principles of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,New York,1984;以及Pennington等人,Peptide SynthesisProtocols,Humana Press,Totowa,NJ,1994)。此外,许多公司提供常规的肽合成服务。
作为另外一种选择,本文所述的肽可使用重组DNA和分子克隆技术进行制备。编码所述肽的基因可在异源宿主细胞中制备,尤其是在微生物宿主细胞中制备。
用于表达本发明的肽的优选异源宿主细胞是存在于真菌或细菌家族中并在宽温度、pH值和溶剂耐受性范围内生长的微生物宿主。因为转录、翻译和蛋白生物合成装置一样与细胞给料无关,功能基因的表达与用于生成细胞生物量的碳给料无关。宿主菌株的实例包括但不限于来自真菌或酵母属如曲霉属、木霉属、酿酒酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属、耶氏酵母属、汉逊酵母属的菌种,或来自细菌属如沙门氏菌属、芽孢杆菌属、不动杆菌属、红球菌属、链霉菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、甲基单胞菌属、甲基细菌属、产碱菌属、集胞藻属、淡水藻属、硫杆菌属、甲烷杆菌属和克雷伯氏菌属的菌种。
能够使用多种表达系统制备本发明的肽。此类载体包括但不限于染色体、附加型和病毒驱动的载体、例如来源于细菌质粒、噬菌体、转座子、插入元件、酵母附加体、病毒如杆状病毒、逆转录病毒的载体、以及来源于它们的组合的载体如来源于质粒和噬菌体基因元件(例如粘粒和噬菌粒)的那些载体。表达系统构建体可包含调节以及导致表达的调控区。就这一点而言,一般来讲,适于在宿主细胞中保持、繁殖或表达多核苷酸或多肽的任何系统或载体可用于表达。微生物表达系统和表达载体包含引导相对于宿主细胞生长高水平表达外源蛋白的调控序列。调控序列是本领域技术人员熟知的,实例包括但不限于响应化学或物理刺激引起基因表达开始或关闭的那些调控序列,包括载体中存在的调控元件,例如增强子序列。这些序列中的任何一种可用于构建嵌合基因以制备本发明的任何结合肽。然后可以将这些嵌合基因通过转化导入到合适的微生物中以提供所述肽的高水平表达。
可用于转化合适的宿主细胞的载体或盒是本领域熟知的。通常载体或盒含有引导相关基因的转录和翻译的序列、一种或多种选择标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含含有转录起始控制的基因5′区域和控制转录终止的DNA片段3′区域。最优选的是,这两个控制区都来源于与转化的宿主细胞同源的基因,但应该了解这种控制区不必源自选作生产宿主的特定物种的天然基因。选择性标记基因提供用于选择转化过的宿主细胞的表型性状,如大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
可用于驱动嵌合基因在期望宿主细胞中表达的起始控制区或启动子有很多,并且为本领域技术人员所熟悉。实际上能够驱动所述基因的任何启动子都适用于生产本发明的结合肽,包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(用于在糖酵母属中表达);AOX1(用于在毕赤酵母属中表达);和lac、pBAD、tet、trp、lPL、lPR、T7、tac和trc(用于在大肠杆菌中表达)以及amy、apr、npr启动子,和多种用于在芽孢杆菌属中表达的噬菌体启动子。
终止控制区也可源于优选宿主的天然的多种基因。任选地,终止位点可能是不必要的。然而,如果含有终止位点则是最优选的。
可使用包含合适的DNA序列以及合适的启动子或控制序列的载体来转化合适的宿主,使得宿主表达本发明的肽。也能够使用无细胞翻译系统,使用来源于本发明的DNA构建体的RNA制备此类肽。任选地,可能期望制备本发明的基因产物作为转化的宿主的分泌产物。将期望的蛋白分泌到培养基中具有简化纯化程序和降低成本的优点。本领域熟知的是,分泌信号序列常用于促使将表达的蛋白活化运输通过细胞膜。制备能够分泌的转化宿主可通过导入编码在生产宿主中有功能的分泌信号的DNA序列来完成。用于选择合适信号序列的方法是本领域熟知的(参见例如欧洲专利EP546049B1和WO 93/24631)。
口腔护理组合物
本文涉及包括有效量的一种或多种本发明肽组合物的口腔护理体系和包含有效量的具有(或作为)有益剂的一种或多种微粒的组合物。如本文所用,术语“有效量”是至少一种本发明肽组合物的量,或加入口腔护理组合物以获得期望有益效果如牙齿增白效果的至少一种或多种包含有益剂的微粒的量。
口腔护理组合物可为粉末、糊料、凝胶、液体、油膏剂、或片剂的形式。示例性的口腔护理组合物可包括但不限于牙膏、牙科用乳膏、凝胶或牙粉、漱口水、口气清新剂和牙线。口腔护理组合物在口部可接受的载体介质中包含本发明的有效量肽组合物。用于口腔护理组合物的有效量肽组合物和包含微粒的组合物(即,口腔护理体系)可根据产品类型而不同。通常有效量的口腔护理体系相对于口腔护理组合物总重量的比例按重量计为约0.01%至约90%。此外,不同的口腔护理体系(例如包含不同的有益剂)的混合物可用于口腔护理组合物。应当理解,选择混合物中的组分以便在减轻期望效应的肽组合物之间无相互作用。本文所公开的口腔护理体系的合适混合物可由本领域的技术人员使用常规实验来测定。如果口腔护理体系的混合物用于所述组合物,则各试剂(肽组合物和粒状有益剂)的总浓度相对于口腔护理组合物的总重量按重量计为约0.01%至约90%。
口部可接受的载体介质的组分在White等人的美国专利公开6,740,311;Lawler等人的美国专利公开6,706,256;Fuglsang等人的美国专利公开6,264,925;和Ibrahim等人的美国专利公开申请公布2005-0069501中进行了描述,上述每个文献均全文以引用方式并入本文。例如,口腔护理组合物可包含一种或多种以下物质:研磨剂、表面活性剂、抗氧化剂、螯合剂、氟化物源、增稠剂、缓冲剂、溶剂、保湿剂、载体、膨化剂和口腔有益剂如酶、抗斑剂、防污剂、抗微生物剂、防龋剂、抗炎剂、脱敏剂、甜味剂、调味剂、口气清新剂、凉爽剂、营养物质和流涎剂。
术语“氨基酸”是指蛋白质或多肽的基本化学结构单元。在本文中使用下列缩写来表示具体的氨基酸:
实施例
一般方法:
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的,并且描述于以下文献中:Sambrook,J.和Russell,D.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第三版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY(2001);和Silhavy,T.J.,Bennan,M.L.和Enquist,L.W.,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor LaboratoryCold Press Spring Harbor,NY(1984);以及Ausubel,F.M.等人,ShortProtocols in Molecular Biology,第5版,John Wiley and Sons,Inc.,N.Y.,2002。
适合细菌培养物维持及生长的材料和方法在领域内也是众所周知的。适用于下面实施例的技术可存在于以下文献中:Manual of Methodsfor General Bacteriology,Phillipp Gerhardt,R.G.E.Murray,Ralph N.Costilow,Eugene W.Nester,Willis A.Wood,Noel R.Krieg和G.BriggsPhillips,编辑,American Society for Microbiology,Washington,DC.,1994,或者Thomas D.Brock,Biotechnology:A Textbook of IndustrialMicrobiology,第二版,Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA,1989。使用的用于细菌细胞生长和维持的所有试剂、限制性内切酶和材料均得自Aldrich Chemicals(Milwaukee,WI)、BD Diagnostic Systems(Sparks,MD)、Life Technologies(Rockville,MD)或Sigma-Aldrich ChemicalCompany(St.Louis,MO),除非另外说明。
使用的缩写词的含义如下:“min”指分钟,“h”指小时,“μL”指微升,“mL”指毫升,“L”指升,“nm”指纳米,“mm”指毫米,“cm”指厘米,“μm”指微米,“mM”指毫摩尔每升,“μM”指微摩尔每升,“M”指摩尔,“mmol”指毫摩尔,“μmole”指微摩尔,“g”指克,“μg”指微克,“mg”指毫克,“g”指万有引力常数,“RCF”指相对离心力,“rpm”指每分钟转数,“pfu”指噬菌斑形成单位。
实施例1:
使用标准生物淘选方法选择牙齿(表膜)结合肽
该实施例的目的是使用标准噬菌体展示生物淘选方法鉴定与牙齿表膜结合的噬菌体肽。
使用压实的羟基磷灰石盘(HAP盘,直径3mm),通过将该盘在人口腔中孵育1.5小时形成表膜,随后用TBS冲洗。然后在SUPERBLOCK封闭液(Pierce Chemical Company,Rockford,IL;Prod.#37535)中室温孵育所述盘1小时,然后用TBST(TBS,0.05%TWEEN20)洗涤3次。将包含14至20个氨基酸的随机肽插入序列的噬菌体库(1011pfu)加入到每个管中。在室温、50rpm振荡条件下孵育60分钟后,通过将液体抽吸出每个孔来除去未结合的噬菌体,随后用包含终浓度0.05%的洗涤剂TWEEN20(TBST)的1.0mL TBS洗涤6次。
然后将样品盘转移到洁净管中并将在0.2M甘氨酸-HCl中包含1mg/mL BSA、pH 2.2的200μL洗脱缓冲液加入到每个孔中,孵育10分钟以洗脱结合的噬菌体。然后将由1M Tris-HCl组成的、pH 9.2的32μL中和缓冲液加入到每个孔中。在洗脱缓冲液中以及样品盘上的噬菌体微粒通过与稀释的大肠杆菌ER2738细胞一起在37℃下培养4.5小时进行扩增,所述稀释细胞来自在LB培养基中1∶100稀释的过夜培养物。在这段时间后,将细胞培养物离心30秒并将上部80%的上清液转移到新管中,加入1/6体积的PEG/NaCl(20%聚乙二醇-800,2.5M氯化钠),使噬菌体在4℃下沉淀过夜。通过在10,000×g、4℃条件下离心收集沉淀物并将所得沉淀物重悬在1mL TBS中。这是第一轮扩增原液。然后按照标准规程滴定扩增的第一轮噬菌体原液。就第2、第3和第4轮生物淘选而言,使用来自前一轮的大于2×1011pfu的噬菌体原液。在如上所述的相同条件下重复生物淘选过程2轮以上。使用相同的生物淘选条件进行第4轮淘选,不同的是洗涤溶液含有0.5%TWEEN20的TBS而不是含有0.05%TWEEN20。
在第4轮生物淘选后,按照制造商的说明书(New England Biolabs)制备95个随机单噬菌体噬菌斑溶解产物,并且使用QIAprep Spin M13试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)纯化单链噬菌体基因组DNA并用-96gIII测序引物(5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’;SEQ ID NO:63)在DuPont Sequencing Facility中测序。展示肽位置紧随基因III信号肽之后。基于第3和第4轮分析中存在的肽序列,选择20个候选噬菌体进行进一步的表膜结合分析。
实施例2:
表征表膜表面上的候选牙齿(表膜)结合肽
在噬菌体ELISA实验中使用总计20个选择的候选噬菌体(实施例1)。纯化的噬菌体溶解产物用于结合表膜包被的HAP盘,使用抗-M13噬菌体抗体缀合到辣根过氧化物酶,随后加入显色剂TMB(3,3′,5,5′-四甲基对二氨基联苯),其得自Pierce Biotechnology(Item #34021;Rockford,IL)。平板在A450nm处读数。
就待测试的每个候选噬菌体而言,将表膜包被的HAP盘(直径3mm)在室温下与200μL封闭液一起孵育1小时,所述封闭液由在TBS中的2%无脂奶粉组成(Schleicher & Schuell,Inc.)。通过将液体抽吸出每个管来移除封闭液。使用由TBST-0.05%组成的洗涤缓冲液漂洗管6次。所述孔填充有包含1mg/mL BSA(牛血清白蛋白)的200μLTBST-0.5%,然后加入10μL(超过1010pfu)纯化的噬菌体原液。样品在缓慢振荡条件下室温孵育60分钟。用TBST-0.5%洗涤未结合噬菌体6次。然后加入在封闭液中以1∶500稀释的100μL辣根过氧化物酶/抗-M13抗体缀合物(Amersham USA,Piscataway,NJ)并在室温下孵育1小时。除去缀合物溶液并用TBST-0.5%洗涤6次。将TMB底物(200μL)加入到每个孔中并在室温下显色5至30分钟,通常10分钟。然后将终止溶液(200μL 2M H2SO4)加入到每个孔中并将该溶液转移到96孔板上,并且使用微板分光光度计(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)测量A450。表1给出了所得的吸光度值。
表1:
牙齿(表膜)-结合肽的氨基酸序列
噬菌体ID | 氨基酸序列 | SEQ ID NO. | O.D.450 |
对照物 | 无噬菌体 | -------- | 0.218 |
Pell 1 | AHPESLGIKYALDGNSDPHA | 1 | 0.739 |
Pell 2 | ASVSNYPPIHHLATSNTTVN | 2 | 0.75 |
Pell 3 | DECMEPLNAAHCWR | 3 | 0.49 |
Pell 4 | DECMHGSDVEFCTS | 4 | 0.664 |
Pell 5 | DLCSMQMMNTGCHY | 5 | 0.83 |
Pell 6 | DLCSSPSTWGSCIR | 6 | 0.735 |
Pell 7 | DPNESNYENATTVSQPTRHL | 7 | 0.831 |
Pell 8 | EPTHPTMRAQMHQSLRSSSP | 8 | 0.712 |
Pell 9 | GNTDTTPPNAVMEPTVQHKW | 9 | 0.755 |
Pell 10 | NGPDMVQSVGKHKNS | 10 | 0.729 |
Pell 11 | NGPEVRQIPANFEKL | 11 | 0.607 |
Pell 12 | NNTSADNPPETDSKHHLSMS | 12 | 0.521 |
Pell 13 | NNTWPEGAGHTMPSTNIRQA | 13 | 0.598 |
Pell 14 | NPTATPHMKDPMHSNAHSSA | 14 | 0.7 |
Pell 15 | NPTDHIPANSTNSRVSKGNT | 15 | 0.567 |
Pell 16 | NPTDSTHMMHARNHE | 16 | 0.578 |
Pell 17 | QHCITERLHPPCTK | 17 | 0.614 |
Pell 18 | TPCAPASFNPHCSR | 18 | 0.416 |
Pell 19 | TPCATYPHFSGCRA | 19 | 0.731 |
Pell 20 | WCTDFCTRSTPTSTSRSTTS | 20 | 0.715 |
本文涉及的口腔表面包括牙齿和更具体地讲表膜。在一个实施方案中,肽组合物或第一结合元件包含至少一个肽,其具有序列SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20。在一些实施方案中,肽组合物或第一结合元件包含多个肽,其中至少一个肽具有序列SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20。
实施例3:
使用标准生物淘选方法选择牙齿(釉质)结合肽
该实施例的目的是使用噬菌体展示生物淘选方法鉴定与牙釉结合的噬菌体肽。
将来自牛门牙(3mm平方)的未打磨过的釉质块和来自牛门牙(直径3mm的盘)的打磨过的釉质盘插入蜡中以形成孔,仅有目标表面暴露出。然后在SUPERBLOCK封闭液(PIERCE CHEMICAL Company,Rockford,IL;Prod.#37535)中在室温(~22℃)下孵育釉质表面1小时,然后用TBST(TBS,0.05%TWEEN20)洗涤3次。将包含14至20个氨基酸的随机肽插入序列(1011pfu)的噬菌体库加入到釉质孔中进行10分钟的预吸收以滴定蜡表面,通过将液体抽吸出每个孔来除去未结合的噬菌体。然后将100μL的相同噬菌体库(1011pfu)加入到釉质孔中,在50rpm的缓慢振荡条件下在室温下孵育60分钟,随后用包含终浓度0.05%的洗涤剂TWEEN20(TBST)的1.0mL TBS洗涤6次。
然后将釉质块从蜡孔中切出并转移到洁净管中,将在0.2M甘氨酸-HCl中由1mg/mL BSA组成的、pH 2.2的200μL洗脱缓冲液加入到每个孔中并孵育10分钟以洗脱结合的噬菌体。然后将由1M Tris-HCl组成的、pH 9.2的32μL中和缓冲液加入到每个管中。在洗脱缓冲液中以及釉质块上的噬菌体微粒通过与稀释的大肠杆菌ER2738细胞一起在37℃下孵育4.5小时进行扩增,所述稀释细胞来自在LB培养基中1∶100稀释的过夜培养物。在这段时间后,将细胞培养物离心30秒并将上部80%的上清液转移到新管中,加入1/6体积的PEG/NaCl(20%聚乙二醇-800,2.5M氯化钠),使噬菌体在4℃下沉淀过夜。通过在10,000×g、4℃条件下离心收集沉淀物并将所得沉淀物重悬在1mL TBS中。这是第一轮扩增原液。然后按照标准规程滴定扩增的第一轮噬菌体原液。就第2轮生物淘选而言,使用来自前一轮的大于2×1011pfu的噬菌体原液。在如上所述的相同条件下重复生物淘选过程1轮以上。使用相同的生物淘选条件进行第3轮淘选,不同的是洗涤溶液含有0.5%TWEEN20的TBS而不是含有0.05%TWEEN20。
在第3轮生物淘选后,按照制造商的说明书(New England Biolabs)制备95个随机单噬菌体噬菌斑溶解产物,并且使用QIAprep Spin M13试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)纯化单链噬菌体基因组DNA并用-96gIII测序引物(5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’,称为SEQ ID NO:63)在DuPont Sequencing Facility中测序。展示肽位置紧随基因III信号肽之后。基于肽序列,选择20个候选噬菌体用于进一步的表膜结合分析(表2)。“BoEn”指牛釉质,“BoEn P”指打磨过的牛釉质。
表2:
牛釉质牙齿结合肽序列
噬菌体ID | 氨基酸序列 | SEQ ID NO: |
BoEn P1 | APPLKTYMQERELTMSQNKD | 21 |
BoEn P2 | EPPTRTRVNNHTVTVQAQQH | 22 |
BoEn P3 | GYCLRGDEPAVCSG | 23 |
BoEn P4 | LSSKDFGVTNTDQRTYDYTT | 24 |
BoEn P5 | NFCETQLDLSVCTV | 25 |
BoEn P6 | NTCQPTKNATPCSA | 26 |
BoEn P7 | PSEPERRDRNIAANAGRFNT | 27 |
BoEn P8 | THNMSHFPPSGHPKRTAT | 28 |
BoEn P9 | TTCPTMGTYHVCWL | 29 |
BoEn P10 | YCADHTPDPANPNKICGYSH | 30 |
BoEn 1 | AANPHTEWDRDAFQLAMPPK | 31 |
BoEn 2 | DLHPMDPSNKRPDNPSDLHT | 32 |
BoEn 3 | ESCVSNALMNQCIY | 33 |
BoEn 4 | HNKADSWDPDLPPHAGMSLG | 34 |
BoEn 5 | LNDQRKPGPPTMPTHSPAVG | 35 |
BoEn 6 | NTCATSPNSYTCSN | 36 |
BoEn 7 | SDCTAGLVPPLCAT | 37 |
BoEn 8 | TIESSQHSRTHQQNYGSTKT | 38 |
BoEn 9 | VGTMKQHPTTTQPPRVSATN | 39 |
BoEn 10 | YSETPNDQKPNPHYKVSGTK | 40 |
本文涉及的口腔表面包括牙齿和更具体地讲釉质表面。在一个实施方案中,肽组合物或第一结合元件包含至少一个肽,其具有序列SEQ IDNO:21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40。在一些实施方案中,肽组合物或第一结合元件包含多个肽,其中至少一个肽具有序列SEQ ID NO:21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40。
实施例4:
表征釉质表面上的候选牙齿(釉质)结合肽
在噬菌体ELISA实验中使用总计11个选择的候选噬菌体(实施例3)。使用缀合到辣根过氧化物酶上的抗-M13噬菌体抗体,纯化的噬菌体溶解产物用于结合釉质块,随后加入显色剂TMB。平板在A450nm处读数。
就待测试的每个候选噬菌体而言,将打磨过的和未打磨过的釉质块在室温下与200μL封闭液一起孵育1小时,所述封闭液由在TBS中的2%无脂奶粉组成(Schleicher & Schuell,Inc.)。通过将液体抽吸出每个管来移除封闭液。用包含TBST-0.05%的洗涤缓冲液漂洗管6次。所述孔填充有包含1mg/mL BSA的200μL TBST-0.5%,然后加入10μL(超过1010pfu)纯化噬菌体原液。样品在缓慢振荡条件下室温孵育60分钟。用TBST-0.5%洗涤6次以除去未结合噬菌体。然后加入在封闭液中以1∶500稀释的100μL辣根过氧化物酶/抗-M13抗体缀合物(AmershamUSA,Piscataway,NJ)并在室温下孵育1小时。除去缀合物溶液并用TBST-0.5%洗涤6次。将TMB底物(200μL)加入到每个孔中并在室温下显色5至30分钟,通常10分钟。然后将终止溶液(200μL 2M H2SO4)加入到每个孔中并将该溶液转移到96孔板,并且使用微板分光光度计(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)测量A450。表3和4给出所得吸光度值。BoEn P指打磨过的釉质,BoEn指牛釉质。
表3:
选择的候选噬菌体对打磨过的牛釉质结合测定的噬菌体ELISA结
果
噬菌体ID | 氨基酸序列 | SEQ ID NO: | O.D.450 |
对照物 | 无噬菌体 | ------ | 0.112 |
BoEn P2 | EPPTRTRVNNHTVTVQAQQH | 22 | 0.641 |
BoEn P3 | GYCLRGDEPAVCSG | 23 | 0.665 |
BoEn P5 | NFCETQLDLSVCTV | 25 | 0.797 |
BoEn P6 | NTCQPTKNATPCSA | 26 | 0.83 |
BoEn P8 | THNMSHFPPSGHPKRTAT | 28 | 2.02 |
表4:
选择的候选噬菌体对牛釉质结合测定的噬菌体ELISA结果
噬菌体ID | 氨基酸序列 | SEQ ID NO. | O.D.450 |
对照物 | 无噬菌体 | ------ | 0.193 |
BoEn 1 | AANPHTEWDRDAFQLAMPPK | 31 | 1.402 |
BoEn 5 | LNDQRKPGPPTMPTHSPAVG | 35 | 0.944 |
BoEn 6 | NTCATSPNSYTCSN | 36 | 2.38 |
BoEn 7 | SDCTAGLVPPLCAT | 37 | 0.892 |
BoEn 9 | VGTMKQHPTTTQPPRVSATN | 39 | 0.568 |
BoEn 10 | YSETPNDQKPNPHYKVSGTK | 40 | 3.942 |
本文涉及的口腔表面包括牙齿表面和更具体地讲釉质或打磨过的釉质表面。在一个实施方案中,肽组合物或第一结合元件包含至少一个肽,其具有序列SEQ ID NO:22、23、25、26、或28。在一些实施方案中,肽组合物或第一结合元件包含多个肽,其中至少一个肽具有序列SEQ ID NO:22、23、25、26、或28。在一个实施方案中,肽组合物或第一结合元件包含至少一个肽,其具有序列SEQ ID NO:31、35、36、37、39、或40。在一些实施方案中,肽组合物或第一结合元件包含多个肽,其中至少一个肽具有序列SEQ ID NO:31、35、36、37、39、或40。
实施例5:
使用标准生物淘选方法选择牙齿(表膜)结合肽
本实施例的目的是使用噬菌体展示生物淘选法鉴定在牛釉质上结合体内形成的牙齿表膜的噬菌体肽。
牛釉质门牙获取自SE Dental(Baton Rouge,LA)。将牙齿切成大约5mm平方的大小并进行打磨以除去表面碎屑。为了使釉质表面暴露于人口腔环境,将釉质块灭菌并缝入口内保持器中。将带有2至4个釉质块的保持器置于人口中30分钟以在釉质上形成表膜层。在孵育后,从保持器中移出釉质块,用水冲洗并插入包含模塑材料的具孔板中以便仅将表膜包被的釉质表面暴露在孔中。将所述板用UV光照10分钟灭菌。
然后将基质在室温下在封闭液中孵育1小时(~22℃;包含1mg/mL牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液,pH 7.2(Pierce BUPHTM#28372),含有0.1%TWEEN20(PBST),随后用PBST洗涤2次。将包含15至20个氨基酸的随机肽插入序列的噬菌体库(1011pfu)加入到每个孔中。在37℃、50rpm振荡条件下孵育30分钟后,通过将液体抽吸出每个孔除去未结合的噬菌体,随后用1.0mL PBST洗涤6次。
然后将釉质块转移到洁净管中并将在0.2M甘氨酸-HCl中由1mg/mL BSA组成的、pH 2.2的1mL洗脱缓冲液加入到每个孔中,孵育10分钟以洗脱结合的噬菌体。然后将由1M Tris-HCl组成的、pH 9.1的167μL中和缓冲液加入到每个孔中。在洗脱缓冲液中以及釉质块上的噬菌体微粒通过与20mL稀释的大肠杆菌ER2738细胞一起在37℃下孵育4.5小时进行扩增,所述稀释细胞来自在LB培养基中1∶100稀释的过夜培养物。在这段时间后,将细胞培养物离心2分钟并将上部15mL的上清液转移到新管中,加入2.5mLPEG/NaCl(20%聚乙二醇-800,2.5M氯化钠),使噬菌体在4℃下沉淀过夜。通过在10,000×g、4℃条件下离心收集沉淀物并将所得沉淀物重悬在1mL PBS中。这是第一轮扩增原液。然后按照标准规程滴定扩增的第一轮噬菌体原液。为了进行随后多轮的生物淘选,使用来自前一轮的超过2×1011pfu的噬菌体原液。在第一轮之后附加的每轮也包括用0.5%月桂基硫酸钠水溶液(Spectrum)进行的附加洗涤、用pH 9.4的碳酸盐缓冲液(Pierce BUPHTM碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液#28382)进行的两次洗涤以及用pH 2.5的50mM磷酸盐缓冲液进行的2次洗涤。
在如上所述的相同条件下重复附加的生物淘选过程不少于3轮,同时附加地将噬菌体原液暴露于口腔软组织。从第2轮扩增得到的噬菌体原液首先暴露于EPIORALTM和EPIGINGIVALTM软组织,(MatTek Corp,Ashland,MA),这通过孵育8μL第2轮噬菌体原液+42μL封闭液(PBST+1mg/mL BSA)60分钟进行。从该组织中移出溶液,并将附加的50μLPBS与该组织一起孵育30分钟。合并所述溶液并用于如上所述的附加轮次生物淘选。
在第3轮生物淘选和其后每轮之后,分离95个随机单噬菌体噬菌斑,并且使用Illustra Templiphi 500扩增试剂盒(GE Healthcare,Piscataway,NJ)制备单链噬菌体基因组DNA并用-96gIII测序引物(5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’;SEQ ID NO:63)在DuPontSequencing Facility测序。展示肽位置紧随基因III信号肽之后。基于肽序列,鉴定31个候选噬菌体用于进一步的表膜结合分析。
表5:
从对30分钟的体内表膜进行的生物淘选中鉴定的牙齿结合肽
肽ID | 氨基酸序列 | SEQ ID NO: |
DenP 01 | NGNNHTDIPNRSSYTGGSFA | 64 |
DenP 02 | TMTNHVYNSYTEKHSSTHRS | 65 |
DenP 03 | TTYHYKNIYQESYQQRNPAV | 66 |
DenP 04 | VEPATKNMREARSSTQMRRI | 67 |
DenP 05 | YLLPKDQTTAPQVTPIVQHK | 68 |
DenP 06 | ASNLDSTFTAINTPACCT | 69 |
DenP 07 | EFPYYNDNPPNPERHTLR | 70 |
DenP 08 | GMPTRYYHNTPPHLTPKF | 71 |
DenP 09 | HKNAIQPVNDATTLDTTM | 72 |
DenP 10 | AVVPADLNDHANHLS | 73 |
DenP 11 | DLGTFPNRTLKMAAH | 74 |
DenP 12 | FDGIGLGTATRHQNR | 75 |
DenP 13 | QAAQVHMMQHSRPTT | 76 |
DenP 14 | SEARARTFNDHTTPMPII | 77 |
DenP 15 | ELDHDSRHYMNGLQRKVT | 78 |
DenP 16 | GPQHVLMQDTHQGYAFDN | 79 |
DenP 17 | TTGSSSQADTSASMSIVPAH | 80 |
DenP 18 | KAPIANMLQPHSYQYSVA | 81 |
DenP 19 | TYQGVPSWPAVIDDAIRR | 82 |
DenP 20 | VNPNWVETQALHQPPGNT | 83 |
DenP 21 | DHNNRQHAVEVRENKTHTAR | 84 |
DenP 22 | IYPNESMSTSNVRGPYHP | 85 |
DenP 23 | HDPNHLTHQARTIYRNANHT | 86 |
DenP 24 | SNATMYNIQSHSHHQ | 87 |
DenP 25 | ANELSTYAQTNPGSG | 88 |
DenP 26 | DTIHPNKMKSPSSPL | 89 |
DenP 28 | APPTYQTASYPHNLPSKRKM | 90 |
DenP 29 | QVPDYLSPTHQKKAFLEIPT | 91 |
DenP 30 | TNDLHANPFTGTYIAPDPTS | 92 |
DenP 32 | HKNENIMQYNVNDRWHITPA | 93 |
DenP 33 | IDGPHHSPVHRYHTPSIT | 94 |
本文涉及的口腔表面包括牙齿和更具体地讲表膜表面。在一个实施方案中,肽组合物或第一结合元件包含至少一个肽,其具有序列SEQ IDNO:64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、.或94。在一些实施方案中,肽组合物或第一结合元件包含多个肽,其中至少一个肽具有序列SEQ ID NO:64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、或94。
实施例6:
表征表膜表面上的候选牙齿(表膜)结合物
表5中的总计29个选择的候选噬菌体用于噬菌体ELISA实验以测定每个噬菌体对表膜基质的结合亲和力和覆盖百分比。使用缀合到辣根过氧化物酶上的抗-M13噬菌体抗体,纯化的噬菌体溶解产物用于结合包被表膜的釉质,随后加入显色剂TMB。平板在A450nm处读数。
将釉质基质切成大约7mm平方的大小并安装在蜡底座上用于在口中孵育30分钟以形成包被表膜的表面。从蜡背衬中移出表膜包被的釉质基质并置于具孔板中,表膜表面如实施例5所述暴露。将每个表膜包被的基质在室温下与1mL封闭液一起孵育1.5小时,所述封闭液由在PBST(Pierce BUPHTM#28372,含有0.1%的TWEEN20)中的1mg/mLBSA组成。通过将液体抽吸出每个孔来移除封闭液。用包含PBST的洗涤缓冲液冲洗管2次。孔中填充有1mL 1011pfu纯化噬菌体原液,其通过在封闭液中稀释进行制备。样品在37℃、缓慢振荡条件下孵育30分钟。用PBST洗涤5次以除去未结合噬菌体。然后加入在封闭液中以1∶500稀释的500μL辣根过氧化物酶/抗-M13抗体缀合物(Amersham USA,Piscataway,NJ)并在室温(~22℃)下孵育1小时。除去缀合物溶液并用PBST洗涤3次。从孔中移出每个釉质基质并在15mL测试管中用5mLPBST再次洗涤。然后将每个釉质基质安装在洁净具孔板中,仅有釉质表面暴露。将TMB底物和H2O2(200μL)的1∶1溶液加入到每个孔中并在室温(~22℃)下显色5至30分钟,通常10分钟。然后将终止溶液(100μL 2M H2SO4)加入到每个孔中并将该溶液转移到96孔板,并且使用微板分光光度计(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)测量A450。表6给出了所得的吸光度值。在两天时间里分析全部30个表膜结合候选肽并将结果对内部对照物进行归一化。
表6:
获取自生物淘选的表膜结合候选肽的噬菌体ELISA结果
本文涉及的口腔表面包括牙齿和更具体地讲表膜表面。在一个实施方案中,肽组合物或第一结合元件包含至少一个肽,其具有序列SEQ IDNO:64、65、66、67、68、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、或93。在一些实施方案中,肽组合物或第一结合元件包含多个肽,其中至少一个肽具有序列SEQ ID NO:64、65、66、67、68、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、或93。
实施例7:
使用标准生物淘选方法选择表膜结合肽
这个实施例的目的是使用标准噬菌体展示生物淘选鉴定结合到牙齿表膜上的噬菌体肽,所述牙齿表膜通过长期暴露在口腔中获得。
牛釉质门牙获取自SE Dental(Baton Rouge,LA)。将牙齿切成大约7mm平方的大小并进行打磨以除去表面碎屑。为了使釉质表面暴露于人口腔环境,将釉质块灭菌并缝入口内保持器中。将具有4个釉质块的保持器置于人口腔中大约8小时。从受试者口腔内移出保持器并用牙膏和软毛牙刷及水手动刷洗每个釉质块。将保持器再插入受试者口腔持续另外1分钟。从保持器中移出釉质块,用水冲洗并插入包含模塑材料的具孔板中以便仅暴露孔中包被表膜的釉质表面。将所述板用UV光照10分钟灭菌。
然后将基质在室温下在封闭液中孵育1小时(~22℃)(包含1mg/mL牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液,pH 7.2(Pierce BUPHTM#28372),含有0.1%TWEEN20(PBST)),随后用PBST(含0.1%Tween20的PBS)洗涤2次。将包含16至20个氨基酸的随机肽插入序列的噬菌体库(1011pfu)加入到每个孔中。在37℃、50rpm振荡条件下孵育30分钟后,通过将液体抽吸出每个孔来除去未结合的噬菌体,随后用1.0mLPBST洗涤2次。
然后将釉质块转移到洁净管中并将在0.2M甘氨酸-HCl中由1mg/mL BSA组成的、pH 2.2的1mL洗脱缓冲液加入到每个孔中,孵育10分钟以洗脱结合的噬菌体。然后将由1M Tris-HCl组成的、pH 9.1的167μL中和缓冲液加入到每个孔中。在洗脱缓冲液中以及釉质块上的噬菌体微粒通过与20mL稀释的大肠杆菌ER2738细胞一起在37℃下孵育4.5小时进行扩增,所述稀释细胞来自在LB培养基中1∶100稀释的过夜培养物。在这段时间后,将细胞培养物离心2分钟并将上部15mL的上清液转移到新管中,加入2.5mL PEG/NaCl(20%聚乙二醇-800,2.5M氯化钠),使噬菌体在4℃下沉淀过夜。通过在10,000×g、4℃条件下离心收集沉淀物并将所得沉淀物重悬在1mL PBS中。这是第一轮扩增原液。然后按照标准规程滴定扩增的第一轮噬菌体原液。就第2、第3、第4和第5轮生物淘选而言,使用来自前一轮的大于2×1011pfu的噬菌体原液。在这些随后的轮次中,在初始孵育噬菌体后包括附加的洗涤过程。这些洗涤包括用0.5%月桂基硫酸钠水溶液(Spectrum)进行的洗涤、用pH 9.4的碳酸盐缓冲液(Pierce BUPHTM碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液#28382)进行的两次洗涤以及用pH 2.5的50mM磷酸盐缓冲液进行的2次洗涤、随后用PBST洗涤5次。
在第3轮生物淘选和其后每轮之后,分离95个随机单噬菌体噬菌斑,并且使用Illustra Templiphi 500扩增试剂盒(GE Healthcare,Piscataway,NJ)制备单链噬菌体基因组DNA并用-96gIII测序引物(5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’;SEQ ID NO:63)在DuPontSequencing Facility测序。展示肽位置紧随基因III信号肽之后。基于肽序列,选择23个候选噬菌体用于进一步的表膜结合分析。这些候选肽包括以前在实施例5的淘选中发现的3个序列。
表7:
从对刷洗的8小时体内表膜进行的生物淘选中鉴定的结合序列
肽ID | 氨基酸序列 | SEQ ID NO |
DenP101 | AIEYQHSATTPWTMRTRLPP | 96 |
DenP102 | EFYPFAEVPPEKSGIGRQVF | 97 |
DenP103 | GVHQYSRPTVPSYLWTSGQH | 98 |
DenP104 | GYQPHYVDHTIGWQPMIRPN | 99 |
DenP105 | QFNQTSHSFMHGTSGYVPGK | 100 |
DenP106 | SFSWHRGDWELGHQSKTMGM | 101 |
DenP107 | SMWHDITKRYRNPSEMVSAY | 102 |
DenP108 | THGNKHQSWTYPSEINHKNY | 103 |
DenP109 | WHEPHQFSGENTDYSSSMGT | 104 |
DenP110 | THGNKHQSWTYPSEINHKNY | 105 |
DenP111 | DGYKLQTSLDWQMWNP | 106 |
DenP 112 | FPSKWYNHHRHITGHV | 107 |
DenP 113 | GGMGALESYRQWNHLA | 108 |
DenP114 | GINKGQRPPWESWHEN | 109 |
DenP115 | GYGQYVSQQTWAHSNK | 110 |
DenP116 | HDHLSWWGQFDRQNLL | 111 |
DenP117 | MPGHQESIKVQNWNRV | 112 |
DenP118 | NLHSPWPSHAAHHWST | 113 |
DenP119 | NQQMKLVPQHWHRAQP | 114 |
DenP120 | SEKWFNPGPWPKLATQ | 115 |
DenP11 | DLGTFPNRTLKMAAH | 74 |
DenP07 | EFPYYNDNPPNPERHTLR | 70 |
DenP08 | GMPTRYYHNTPPHLTPKF | 71 |
本文涉及的口腔表面包括牙齿和更具体地讲表膜、以及甚至更具体地讲刷洗的表膜。在一个实施方案中,肽组合物或第一结合元件包含至少一个肽,其具有序列SEQ ID NO:96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、74、70、或71。在一些实施方案中,肽组合物或第一结合元件包含多个肽,其中至少一个肽具有序列SEQ ID NO:96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、74、70、或71。
实施例8:
表征表膜表面上的候选牙齿表膜结合物
在噬菌体ELISA实验中使用总计18个选择的候选噬菌体。使用缀合到辣根过氧化物酶上的抗-M13噬菌体抗体,纯化的噬菌体溶解产物用于结合包被表膜的釉质,随后加入显色剂TMB。平板在A450nm处读数。
将釉质基质切成大约4mm平方的大小、清洁灭菌并安装在蜡底座上用于在口中孵育30分钟以形成包被表膜的表面。从蜡背衬中移出表膜包被的釉质基质并置于具孔板中,表膜表面如实施例5所述暴露。将每个表膜包被的基质在室温(~22℃)下与0.5mL封闭液一起孵育1小时,所述封闭液由在pH 7.2的PBST(Pierce BUPHTM#28372,含有0.1%的TWEEN20)中的1mg/mL BSA组成。通过将液体抽吸出每个孔来移除封闭液。用包含PBST的洗涤缓冲液冲洗孔2次。孔中填充有1mL1011pfu纯化噬菌体原液,其通过在封闭液中稀释进行制备。样品在37℃、缓慢振荡条件下孵育30分钟。用PBST洗涤5次以除去未结合噬菌体。然后加入在封闭液中以1∶500稀释的500μL辣根过氧化物酶/抗-M13抗体缀合物(Amersham USA,Piscataway,NJ)并在室温下孵育45分钟。除去缀合物溶液并用PBST洗涤5次。从孔中移出每个釉质基质并在15mL测试管中用10mL PBST再次洗涤。然后将每个釉质基质安装在洁净具孔板中,仅有釉质表面暴露。将TMB底物和H2O2(200μL)的1∶1溶液加入到每个孔中并在室温下显色5至30分钟,通常10分钟。然后将终止溶液(100μL 2M H2SO4)加入到每个孔中并将该溶液转移到96孔板,并且使用微板分光光度计(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)测量A450。表8给出了所得的吸光度值。在两天时间里分析全部18个表膜结合候选肽并将结果对在两天里测得的DenP3的结果进行归一化。
表8:
获取自对刷洗8小时的表膜、30分钟筛选的体内表膜进行的生物淘
选的表膜结合候选肽的噬菌体ELISA结果
本文涉及的口腔表面包括牙齿和更具体地讲表膜表面。在一个实施方案中,肽组合物或第一结合元件包含至少一个肽,其具有序列SEQ IDNO:66、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、107、108、109、110、111、112、113、或114。在一些实施方案中,肽组合物或第一结合元件包含多个肽,其中至少一个肽具有序列SEQ ID NO:66、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、107、108、109、110、111、112、113、或114。
实施例9:
肽介导的钴-NTA聚苯乙烯小珠对牛釉质的粘附
设计肽组合物使其掺入通过噬菌体展示淘选发现的牛釉质上的口腔表面(釉质)-结合肽(参见实施例3和4)和六个组氨酸的序列(下文也称为“His6”;SEQ ID NO:119),其具有对金属螯合氨三乙酸(NTA)的亲和力。釉质结合域的一般设计包括短N-末端序列,其后是两个或更多个由肽接头分开的口腔表面结合域。聚组氨酸序列位于C-末端。用于装配肽基试剂的序列在表9中列出。通过发酵制备肽样品(如实施例15所述)。肽“Soti13”具有序列LNSMSDKHHGHQNTATRNQH(SEQ IDNO:124)并通过生物淘选对包被二氧化硅的TiO2进行鉴定(参见授予Fahnestock等人的美国专利公开申请12/632,829)。
表9:
肽组合物
牛釉质门牙获取自SE Dental(Baton Rouge,LA)。使用DREMEL圆盘锯(Robert Bosch LLC,Farmington Hills,MI),用金刚石刀片将牙齿剖开并切成每侧大约5mm的釉质块。清洁釉质块并将其插入包含模塑材料的具孔板中以便仅暴露孔中的釉质表面。
具有钴-NTA涂层(DYNABEADSTALON)的聚苯乙烯小珠以40mg/mL的浆液形式获取自Invitrogen(item#101.02D)。将所述浆液(50μL;2mg小珠)重悬并用700μL结合缓冲液(50mM磷酸钠,pH 8.0,300mM NaCl,0.01%TWEEN20)洗涤以制备His6结合。
将肽溶解在浓度为20μM的磷酸盐缓冲液(Pierce,pH 7.2)中。将肽溶液(500μL)置于包含釉质块的每个孔中。使用在这一步骤中仅暴露于PBS的釉质块作为对照物。样品在缓慢搅拌条件下与肽溶液一起孵育30分钟。从具孔板中移出肽溶液和PBS并重复加入PBS将每个孔冲洗3次。将TALON小珠(50μL)加入到每个孔中并在缓慢搅拌条件下孵育30分钟。去除TALON溶液并用相同结合缓冲液洗涤样品三次。
从具孔板中移出每个釉质样品并用缓冲液再次冲洗。在小珠结合后的观察显示除无肽对照物和DE045之外的每个釉质表面均显棕色。通过电子显微镜法(Hitachi TM-1000 Tabletop SEM Microscope)在1000X、2500X和5000X放大倍数下进一步检查釉质块。暴露于基质的每个肽显示1μm微粒跨视域的显著覆盖百分比。暴露于DE045的基质也显示比其它样品更低的小珠结合程度。在无肽对照物上发现极少量的小珠,甚至无小珠。除了结合具有钴-NTA涂层的聚苯乙烯小珠之外,也设计用于结合二氧化硅的DE008具有与设计仅具有釉质结合序列的那些肽类似的结果。表10描述了每个肽和无肽对照物的微粒覆盖百分比。小珠的跨釉质表面的优异覆盖百分比展示肽组合物对釉质表面和钴-NTA小珠的亲和力。
表10:
肽介导的钴-NTA小珠在牛釉质表面上的沉积
肽ID | 在5000X下每um2的微粒 |
无 | <0.01 |
DE045(SEQ ID NO:120) | 0.17 |
DE046(SEQ ID NO:121) | 0.39 |
DE047(SEQ ID NO:122) | 0.44 |
DE008(SEQ ID NO:123) | 0.31 |
还展示了包含第一结合元件和第二结合元件的肽组合物,其中第二结合元件是聚组氨酸。还展示了第二结合元件与具有配体部分的微粒的缔合(钴-NTA包被的聚苯乙烯小珠)。在一个实施方案中,肽组合物包含SEQ ID NO:120、121、122或123。在另一个实施方案中,肽组合物包含SEQ ID NO:121、122、或123。
实施例10:
表征表膜表面上的候选牙齿表膜结合物
这个实施例的目的是使用合成制备的肽确认表膜表面上的肽组合物的结合。
使用从表6中获得的序列制备总计20个合成肽。肽获取自SynBioSci Corp.(Livermore,CA)并包括N末端的附加序列(SSRP;SEQ ID NO:118)和C末端的生物素标记赖氨酸。
将釉质基质切成大约7mm平方的大小并安装在蜡底座上用于在口中孵育30分钟以形成包被表膜的表面。从蜡背衬中移出表膜包被的釉质基质并置于具孔板中,表膜表面如实施例5所述暴露。将每个表膜包被的基质在室温(~22℃)下与1mL封闭液一起孵育1小时,所述封闭液由在PBST(Pierce BUPHTM#28372,含有0.1%的TWEEN20)中的1mg/mL BSA组成。通过将液体抽吸出每个孔来移除封闭液。用包含PBST的洗涤缓冲液冲洗管2次。孔中填充有500μL的20μM肽溶液,其通过在封闭液中稀释来制备。样品在37℃、缓慢振荡条件下孵育30分钟。用PBST洗涤6次以除去未结合肽。然后加入在PBST中以1∶2000稀释的500μL辣根过氧化物酶/链霉亲和素缀合物(Pierce#22127)并在室温(~22℃)下孵育1小时。除去缀合物溶液并用PBST洗涤4次。
从孔中移出每个釉质基质并在15mL测试管中用10mL PBST再次洗涤。然后将每个釉质基质安装在洁净具孔板中,仅有釉质表面暴露。将TMB底物和H2O2(200μL)的1∶1溶液加入到每个孔中并在室温(~22℃)下显色10至20分钟,通常15分钟。然后将来自每个孔的100μL溶液转移到96孔读数板中,所述板在每个孔中包含终止溶液(100μL 2MH2SO4)。使用微板分光光度计(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)测量A450。表11给出了所得的吸光度值。在两天时间里分析20个表膜结合候选肽并将结果对第1天中最好的结合候选肽(DenP03)进行归一化。每个序列与三个平行测定的釉质包被表膜基质一起检测。
表11:
获取自生物淘选的表膜结合候选肽的合成肽ELISA结果。
提供了包含表膜结合肽和生物素的肽组合物。在一个实施方案中,肽组合物的第一结合元件包含表膜结合肽或包含序列SEQ ID NO:125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、或144的肽。在一个实施方案中,第二结合元件包含生物素。
实施例11:
测定表膜表面上的肽结合亲和力
本实施例的目的是测定表膜结合肽和包含实施例10中鉴定的表膜结合肽的肽组合物的亲和力和特异性,其使用ELISA测定法通过MB50值进行测量。
使用标准固相噬菌体合成方法合成表11中描述的表膜结合肽DenP3和DenP32,它们在结合序列C末端的赖氨酸残基上被生物素化以用于检测目的。
将釉质基质切成大约4mm平方的大小并安装在蜡底座上用于在口中孵育30分钟以形成包被表膜的表面。从蜡背衬中移出表膜包被的釉质基质并置于具孔板中,表膜表面如实施例5所述暴露。将每个表膜包被的基质在室温下与1mL封闭液一起孵育1小时,所述封闭液由在PBST(Pierce BUPHTM#28372,含有0.1%的TWEEN20)中的1mg/mL BSA组成。通过将液体抽吸出每个孔来移除封闭液。用包含PBST的洗涤缓冲液冲洗管两次。孔中填充有500μL的肽溶液,其通过在封闭液中稀释至一系列浓度范围来制备。样品在37℃、缓慢振荡条件下孵育30分钟。用PBST洗涤6次以除去未结合肽。然后加入在PBST中以1∶2500稀释的500μL碱性磷酸酶/链霉亲和素缀合物(Pierce)并在室温下孵育1小时。除去缀合物溶液并用PBST洗涤4次。
从孔中移出每个釉质基质并在15mL测试管中用10mL PBST再次洗涤。然后将每个釉质基质安装在洁净具孔板中,仅有釉质表面暴露。将4-甲基伞形酮磷酸酯(4-MUP)(150μL)底物(Sigma)加入到每个孔中并避光孵育30分钟。然后将来自每个孔的100μL溶液转移到96孔读数板中。使用微板分光光度计(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)测量荧光。使用GraphPad Prism 4.0(GraphPad Software,Inc.,San Diego,CA)把结果与相对荧光单位对肽浓度作图。从Scatchard图中计算MB50值并显示在表12中。
表12:
表膜结合肽对表膜表面的MB 50 值综述。
在一个实施方案中,肽组合物包含SEQ ID NO:127或144。在另一个实施方案中,肽组合物包含表膜结合肽和生物素。在一个实施方案中,肽组合物结合到表膜表面,MB50为约10-5M。
实施例12(预测的):
测定有益剂表面上的肽结合亲和力
这个实施例的目的是确认表膜表面上的结合元件对包含配体部分的有益剂表面的结合优先权。针对设计用于结合聚组氨酸部分(例如,6个组氨酸残基)的小珠测试对表膜表面具有已知亲和力的生物素化的肽。
具有钴-NTA涂层(DYNABEADSTALON)的聚苯乙烯小珠以40mg/mL的浆液形式获取自Invitrogen(item#101.02D)。重悬大约50μL的浆液(2mg小珠)并用700μL PBST洗涤。在室温(~22℃)下,在封闭液(包含1mg/mL BSA的PBST)中孵育小珠1小时。使用磁体以在移除封闭液时将小珠保留在测试管底部。用PBST将小珠洗涤两次并通过在移除磁体后搅拌将其重悬在溶液中。通过在封闭液中稀释至一系列浓度范围制备肽溶液(500μL)。样品在37℃、缓慢振荡条件下孵育30分钟。用PBST洗涤6次以除去未结合肽。然后加入在PBST中以1∶2500稀释的500μL碱性磷酸酶/链霉亲和素缀合物(Pierce)并在室温下孵育1小时。移除缀合物溶液并用PBST洗涤小珠4次。将小珠转移到洁净测试管中。将4-甲基伞形酮磷酸酯(4-MUP)底物(Sigma)加入到每个测试管中并避光孵育30分钟。将小珠用磁体再次保留在管底,并将来自每个管的100uL溶液转移到96孔读数板中。使用微板分光光度计(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)测量荧光。使用GraphPad Prism4.0(GraphPad Software,Inc.,San Diego,CA)把结果与相对荧光单位对肽浓度作图。从Scatchard图中计算MB50值。在一些实施方案中,MB50值显示钴-NTA包被的小珠的亲和力比对表膜表面测得的亲和力高至少约一个数量级,因此,结合元件对表膜表面比对颗粒具有更高的亲和力。
实施例13:
肽介导的链霉亲和素包被的金颗粒对牛釉质的粘附
设计肽使其掺入通过在牙齿表面上的噬菌体展示淘选发现的结合域(参见实施例3)和缀合到C末端上的第二结合元件生物素,其具有对链霉亲和素和亲和素蛋白已知的亲和力。通过标准合成固相噬菌体方法制备肽样品。作为对照物,也测试包括用于牙齿表面的相同结合域的非生物素化的肽。
表13:
设计用于肽介导的链霉亲和素包被微粒粘附的肽。
将每个釉质块在包含0.1%TWEEN20(PBST)和1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液中、在室温(22℃)下孵育45分钟。用PBST将所有块冲洗两次,同时在微量离心管中涡旋振荡。肽首先在水中稀释至10mM,然后在包含1mg/mL BSA的PBST中制备20μM的工作浓度。在室温下将每个样品暴露于肽溶液或无肽缓冲液对照物30分钟。在孵育期间将样品缓慢旋转振荡。从肽溶液中移出釉质块并用PBST涡旋洗涤四次。
用链霉亲和素官能化的50nm金纳米颗粒得自Nanocs Inc(NewYork,NY)并用包含1mg/mL BSA的PBST稀释至0.006重量%。然后所有釉质样品在缓慢转动条件下、在室温下暴露于金纳米颗粒溶液中1小时。用水冲洗样品3次,使其在分析前干燥。
用电子显微镜法检查每个釉质样品。为了减少电荷,在分析前用碳涂覆每个样品。在1000X、10000X和30000X放大倍数下用Hitachi S4700FESEM采集图像。计算每个显微照片的微粒数并比较微粒覆盖百分比密度(表14)。
表14:
肽介导的链霉亲和素包被的微粒对釉质的粘附
首先涂覆有包含生物素的序列的釉质表面上的链霉亲和素微粒具有较高的覆盖百分比,这说明设计的肽对釉质表面和链霉亲和素包被的微粒具有亲和力。
在一些实施方案中,肽组合物包含选自SEQ ID NO:161和162的氨基酸序列。
实施例14:
用连续施用的肽和颜料进行牙齿增白
设计肽组合物以包括在生物淘选中发现的表膜结合域和设计用于结合带负电荷的颜料如包被二氧化硅的二氧化钛的第二结合元件。表膜结合域包括两个表膜结合元件DenP03(SEQ ID NO:66)和一个接头,“Lb2”,SEQ ID NO.54。一个柔性的、无电荷的接头(GSSGPGSS,SEQ ID NO:160)连接两个结合元件。作为对照物,设计第二个肽掺入相同的表膜结合域,但是不包括用于结合带负电荷的颜料的附加域。通过如实施例16所述的发酵方法制备肽。
表15:
具有和不具有静电结合元件的表膜结合缀合物
二氧化硅包被的金红石二氧化钛(Luce II WW)得自US CosmeticsCorp.(Dayville,CT)。用Millipore的水制备12wt%的颜料溶液。使用10W的Branson Sonifier 150,通过超声波降解分散溶液。在冰浴中超声波处理溶液总计6分钟,其间有2分钟的超声波降解间歇。制备在pH 7.2的10mM磷酸钠缓冲液中的1wt%的工作溶液以施用于包被肽的釉质。在Malvern Zetasizer Nano动态光散射仪上测量在相同缓冲液中稀释的这种分散体0.01%的溶液。该分散体具有445nm的平均粒径(Z-avg)和-57mV的zeta电位。
牛釉质门牙获取自SE Dental(Baton Rouge,LA)。使用DREMEL锯,用金刚石刀片将牙齿剖开并切成每侧大约7mm的釉质块。清洁釉质块并略微打磨以除去表面碎屑。用咖啡和茶的混合物预处理釉质以使其颜色类似于人的有污渍的牙齿。然后将每个釉质块安装到蜡底座上并用环氧乙烷灭菌。安装的釉质块在口腔中孵育30分钟以形成表膜包被的表面。用牙刷和1∶2稀释的COLGATEMAXFRESH牙膏(Colgate-Palmolive Co.,New York,NY)刷洗安装的釉质块,然后再置于口腔中1分钟。从蜡背衬中移出表膜包被的釉质基质,用水冲洗并置于具孔板中。使用Konica-Minolta 2600d积分球分光光度计测量每个表膜包被的釉质块的颜色。
将表15中列出的肽溶解在pH 7.2的PBS缓冲液中,其浓度为20μM。三个平行测定的牙齿用于每种实验条件。用肽溶液孵育每个牙齿30分钟,或者单独用缓冲液作为对照物。从肽溶液中移出釉质块并用PBS缓冲液冲洗。然后将釉质块在二氧化硅包被的TiO2的1%溶液中孵育30分钟。移出釉质块、用10mM磷酸盐缓冲液冲洗并吸水干燥。测量每个基质的颜色(L、a*、b*、C*、h)值。使用下文方程式(1)和(2)计算增白过程的总颜色差异ΔE* ab和公制色调差异(Metric HueDifference)ΔH* ab:
ΔE* ab=((L* 1-L* 2)2+(a* 1-a* 2)2+(b* 1-b* 2)2)1/2 (1)
ΔH* ab=(2(C* 1C* 2-a* 1a* 2-b* 1b* 2))1/2 (2)
其中L*=明度变量,a*和b*是色度坐标,C*是由International Commissionof Illumination(CIE)定义并描述于ASTM D2244-09b中的CIELAB颜色空间的色度,下标1表示初始颜色值而下标2表示最终颜色值。在表16中提供了颜色测量结果。
表16:
肽介导的带负电的TiO
2
在表膜上的沉积的增白性能
表16的颜色测量结果说明包含表膜结合元件和第二结合元件的肽序列导致改善的微粒沉积,这一点由在与无肽对照物和不包含第二结合元件的肽进行比较时的较大色差测量结果证明,所述第二结合元件设计用于与带负电的二氧化硅包被的二氧化钛产生静电相互作用。
在一些实施方案中,肽组合物包含具有选自SEQ ID NO:164和167的氨基酸序列的第一结合元件。
在一些实施方案中,肽组合物包含具有选自SEQ ID NO:165和168的氨基酸序列的第二结合元件。
在一些实施方案中,肽组合物包含选自SEQ ID NO:163和166的氨基酸序列。
实施例15(预测的):
通过按序施用肽和颜料进行牙齿增白
设计肽组合物以包括在生物淘选中发现的表膜结合域和设计用于结合带负电荷的颜料如包被二氧化硅的二氧化钛的附加结构域(表17)。一个柔性的、无电荷的接头(GSSGPGSP,SEQ ID NO:158)连接两个结合元件。通过如实施例16所述的发酵方法制备肽。
二氧化硅包被的二氧化钛用金红石二氧化钛(DuPont,Wilmington,DE)制备,它首先通过美国专利公开2,885,366所述的方法涂覆有二氧化硅,二氧化硅载量为3%。稳定分散体由大约10g二氧化硅包被的二氧化钛与25g 0.5mm氧化锆-二氧化硅小珠以及40g水在SPEEDMIXERTMDAC150FVZ-K(FlackTek Inc.,Landrum,SC)中一起制成。处理混合物总计20分钟。在混合后,过滤溶液以除去氧化锆-二氧化硅小珠。所得颜料分散体是不透明的白色溶液,并且稳定分散体具有负的zeta电位。在pH 7.2的10mM磷酸盐缓冲液中制备0.5%(固体重量)二氧化硅包被的二氧化钛溶液。
将得自SE Dental(Baton Rouge,LA)的牛门牙的釉质基质切成大约7mm平方。首先用茶和咖啡的组合处理每个釉质块2天以将所述块的颜色染成类似于天然的人牙齿颜色。将所述基质打磨、灭菌并安装在蜡底座上,在口腔中孵育30分钟以形成包被表膜的表面。从蜡背衬中移出包被表膜的釉质基质并使用积分球分光光度计(Minolta CM2600d)测量每个基质的颜色(L、a*、b*)。
肽溶解在pH 7.2的PBS缓冲液中,浓度为10μM。用肽溶液孵育每个牙齿30分钟,或者单独用缓冲液作为对照物。从肽溶液中移出釉质块并用PBS缓冲液冲洗。然后将釉质块在二氧化硅包被的TiO2的0.5%溶液中孵育30分钟。移出釉质块,用10mM磷酸盐缓冲液冲洗并吸水干燥。测量每个基质的颜色(L、a*、b*、C*、h)值并如实施例14所述计算颜色的变化。在优选的实施方案中,由计算的ΔE注意到肽介导的颜色沉积显著大于无肽对照物。
在一些实施方案中,肽组合物包含具有选自SEQ ID NO:152、153、154、155、156和157的氨基酸序列的第二结合元件。
在一些实施方案中,肽组合物包含选自SEQ ID NO:145、146、147、148、149、150和151的氨基酸序列。
实施例16:
通过发酵生物性生产肽生产菌株的构建
使用大肠杆菌适用密码子设计编码给定肽序列的DNA序列并避免序列重复和mRNA二级结构。通过DNA 2.0,Inc.(Menlo Park,CA),使用如Gustafsson等人(Trends in Biotechnol.,(2004)22(7):346-355)所述的专有软件设计基因序列。表面氨基酸序列的DNA序列后接两个终止密码子和一个内切核酸酶AscI识别位点。
通过DNA 2.0,Inc从合成寡核苷酸中组装基因并将其克隆到标准质粒克隆载体中。然后通过DNA 2.0,Inc的DNA测序证实序列。
用限制性内切核酸酶BamHI和AscI从克隆载体中切出合成基因并使用标准重组DNA方法将其连接到表达载体中。载体pKSI(C4)E-HC77643(SEQ ID NO:159)(美国专利申请公布2009-0029420-A1;该文献以引用方式并入)用于表达编码所述肽的基因。载体pKSI(C4)E-HC77643是表达载体pKSIC4-HC77623的衍生物。具体地讲,KSI(C4)包含体标记中的5个酸不稳定的天冬氨酸残基被谷氨酸取代以制备更耐酸的标记。
质粒pKSIC4-HC77623来源于可商购获得的载体pDEST17(Invitrogen,Carlsbad,CA)。这个载体的构建以前已经在授予O’Brien等人的美国专利公开7,285,264中进行了描述,该专利以引用方式并入。它包括来源于可商购获得的载体pET31b(Novagen,Madison,WI)的序列,该序列编码酮类固醇异构酶的片段(KSI)。以融合伴侣的形式包括KSI片段以促进分开的肽进入大肠杆菌中的不溶解包含体中。使用标准诱变方法修改来自pET31b的KSI编码序列(QuickChange II,Stratagene,La Jolla,CA)以包括除存在于野生型KSI序列中的一个半胱氨酸密码子之外的三个附加的半胱氨酸密码子。
通过取代载体中介于BamHI和AscI位点之间的序列将编码期望肽的DNA序列插入到pKSI(C4)E-HC77643中。质粒DNA包含肽编码序列和载体DNA,它用限制性内切核酸酶BamHI和AscI消化,然后混合肽编码序列和载体DNA并使用标准DNA克隆方法,通过噬菌体T4DNA连接酶连接。通过限制性分析进行鉴定并通过DNA测序证实其中将编码所述肽的序列插入pKSI(C4)E-HC77643中的正确构建体。
在这个构建体中,表面肽缀合物的序列被那些编码HC77643的序列取代。将该序列可操作地连接至噬菌体T7基因10启动子并表达成融合蛋白,其与变体KSI伴侣融合。
为了测试肽的表达,将表达质粒转化到BL21-AI大肠杆菌菌株(Invitrogen,目录号C6070-03)中。为了制备重组融合肽,用转化细菌的单菌落接种50mL LB-氨苄青霉素肉汤(10g/L胰化蛋白胨,5g/L酵母提取物,10g/L氯化钠,100mg/L氨苄青霉素;pH 7.0),并在37℃下振荡培养物直至OD600值为0.6。通过将0.5mL 20wt%L-阿拉伯糖加入到培养物中并再继续振荡4小时来诱导表达。
生长条件
大肠杆菌BL21-AI细胞包含编码所述肽的表达质粒,所述细胞在37℃下在包含1-L改良ZYP-5052自诱导培养基的2.8-L Fernbach烧瓶中搅拌(200rpm)生长20小时(Studier,F.W,(2005)Protein Expressionand Purification 41:207-234)。每升培养基组合物如下:10g/L胰蛋白胨,5g/L酵母提取物,5g/L氯化钠,50mM Na2HPO4,50mM KH2PO4,25mM(NH4)2SO4,3mM MgSO4,0.75%甘油,0.075%葡萄糖和0.05%L-阿拉伯糖(诱导大肠杆菌BL21AI T7体系)。在这些条件下每升获得约20g/L净重的细胞。
包含体分离
在一个500mL瓶中进行以下过程。通过离心从培养基中分离细胞并用pH 8.0的200mL(10g细胞糊料/100mL缓冲液)20mM Tris缓冲液和10mM EDTA洗涤。将细胞糊料重悬在pH 8.0的200mL 20mM Tris缓冲液和10mM EDTA中,其中加入溶菌酶(5mg/200mL),并且经过至少一个冻-融循环以利于裂解。通过超声波降解完成裂解并通过离心回收包含体糊料(4℃下以9000RCF离心20分钟)。每个附加的洗涤步骤包括重悬包含体糊料,随后进行超声波降解和离心(4℃下以9000RCF离心20分钟)。洗涤步骤包括高pH洗涤(50mM Tris HCL,pH 9.0),随后是用pH 8.0的20mM Tris-HCl进行的附加洗涤。通常回收5g/L的包含体糊料。
酸裂解
将回收的包含体糊料重悬在100mL纯水中并用HCl将混合物的pH调节到2.2。将酸化的悬浮液加热到70℃并在搅拌条件下保持14小时以完成天冬氨酰-脯氨酰(DP)位点的裂解,从产物肽中分离融合肽。
氧化交联以从目的肽中分离IBT
将产物冷却至约5℃,然后用氢氧化钠将pH中和到5.3并在约5℃下冷却另外1小时以利于沉淀半胱氨酸交联的KSI(C4)E标记。然后在4℃下以10000RCF离心混合物30分钟。沉淀物包含包含体融合伴侣KSI(C4)E。
氧化交联后的结果:
对沉淀物和剩余的可溶性片段的SDS-PAGE凝胶分析显示在不溶性沉淀中和可溶性片段中剩余的期望肽中存在KSI(C4)E。
包含所述肽的上清液通过HPLC进行分析以确认肽的存在。通过LCMS进一步分析分离肽证实未污染KSI(C4)版发现的KSI片段,它包含5个潜在的内部可酸裂解的“D”序列和1个优选的酸裂解位点(Asp-Pro)。
Claims (34)
1.口腔护理体系,所述口腔护理体系包括:
(a)肽组合物,其包含
(i)第一结合元件,其与口腔表面的亲和力具有10-5摩尔或更低的MB50值;和
(ii)第二结合元件;和
(b)包含微粒的组合物,所述微粒包含:
(i)有益剂;和
(ii)配体部分;其中所述微粒具有在0.01微米至10微米范围内的平均粒度;并且
其中所述第二结合元件和所述配体部分非共价地或通过螯合而彼此缔合。
2.权利要求1的口腔护理体系,其中所述包含微粒的组合物是所述微粒的稳定分散体。
3.权利要求1或2的口腔护理体系,其中所述平均粒度通过光散射方法如激光衍射或动态光散射方法进行测量。
4.权利要求1的口腔护理体系,其中所述第一结合元件包含多个口腔表面结合肽。
5.权利要求1的口腔护理体系,其中所述口腔表面是牙齿表面。
6.权利要求5的口腔护理体系,其中所述牙齿表面是釉质。
7.权利要求5的口腔护理体系,其中所述牙齿表面是表膜。
8.权利要求1的口腔护理体系,其中所述第一结合元件对所述口腔表面的结合亲和力相对于其对所述微粒的亲和力更大。
9.权利要求1的口腔护理体系,其中第二结合元件和所述配体部分之间的缔合是基于离子键的、基于氢键的、基于螯合的、基于生物亲和力的、基于静电的或它们的组合。
10.权利要求9的口腔护理体系,其中所述第二结合元件和所述配体部分之间的缔合是基于螯合的。
11.权利要求10的口腔护理体系,其中所述第二结合元件是聚组氨酸标记。
12.权利要求9的口腔护理体系,其中所述第二结合元件和所述配体部分之间的缔合是基于静电的。
13.权利要求9的口腔护理体系,其中所述第二结合元件和所述配体部分选自生物素和亲和素、生物素和链霉亲和素、链霉亲和素标记和链霉亲和素、麦芽糖结合蛋白和麦芽糖、麦芽糖结合蛋白和淀粉酶、聚组氨酸标记和包含金属离子的亲和介质、谷胱甘肽S-转移酶和谷胱甘肽、表位标记和抗体、以及它们的组合。
14.权利要求13的口腔护理体系,其中所述亲和介质包括钴、铜、镍、锌、或它们的组合的金属离子。
15.权利要求1的口腔护理体系,其中所述有益剂包含着色剂、增白剂、酶、抗斑剂、防污剂、抗微生物剂、防龋剂、调味剂、凉爽剂、流涎剂或它们的组合。
16.权利要求15的口腔护理体系,其中所述着色剂是颜料。
17.权利要求16的口腔护理体系,其中所述颜料包含TiO2。
18.权利要求2的口腔护理体系,其中所述稳定分散体是电荷稳定的。
19.权利要求2的口腔护理体系,其中所述稳定分散体包含具有至少25mV的绝对值的ζ电位。
20.权利要求2的口腔护理体系,其中所述稳定分散体是空间稳定的。
21.权利要求2的口腔护理体系,其中所述稳定分散体包含分散剂。
22.权利要求21的口腔护理体系,其中所述分散剂是离子分散剂或非离子分散剂。
23.权利要求1的口腔护理体系,其中所述肽组合物包含肽,所述肽具有的氨基酸序列选自SEQ ID NO:64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、120、121、122、123、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143和144。
24.权利要求1的口腔护理体系,其中所述肽组合物包含肽,所述肽具有的氨基酸序列选自SEQ ID NO:145、146、147、148、149、150和151。
25.权利要求1的口腔护理体系,其中所述肽组合物包含肽,所述肽具有的氨基酸序列选自SEQ ID NO:161、162、163和166。
26.权利要求1的口腔护理体系,其中所述肽组合物包含第二结合元件,所述第二结合元件具有的氨基酸序列选自SEQ ID NO:116、117、119、152、153、154、155、156、157、165和168。
27.将口腔护理有益剂施用到口腔表面的方法,所述方法包括:
(a)提供口腔护理体系,所述口腔护理体系包括:
(i)肽组合物,其包含
(1)第一结合元件,其与口腔表面的亲和力具有10-5摩尔或更低的MB50值;和
(2)第二结合元件;和
(ii)包含微粒的组合物,所述微粒包含:
(1)有益剂;和
(2)配体部分;其中所述微粒具有在0.01微米至10微米范围内的平均粒度;并且
其中所述第二结合元件和所述配体部分非共价地或通过螯合而彼此缔合;以及
(b)使口腔表面与(a)的所述口腔护理体系接触,从而将所述有益剂施用到所述口腔表面。
28.权利要求27的方法,其中使所述口腔护理体系的肽组合物在接触包含微粒的组合物之前与所述口腔表面接触。
29.权利要求27的方法,其中将所述口腔护理体系的肽组合物和包含微粒的所述组合物一起施用到所述口腔表面。
30.权利要求27的方法,其中所述肽组合物包含选自SEQ ID NO:64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114和115的氨基酸序列。
31.包含氨基酸序列的多肽,所述氨基酸序列选自SEQ ID NO:64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、120、121、122、123、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143和144。
32.包含氨基酸序列的多肽,所述氨基酸序列选自161、162、163和166。
33.包含权利要求31或权利要求32的多肽的口腔护理组合物。
34.权利要求33的口腔护理组合物,其中所述组合物是粉末、糊料、凝胶、液体、油膏剂、或片剂的形式。
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