CN103408653B - 一种仿生防龋多肽及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种仿生防龋多肽、制备方法和应用。该防龋多肽包含如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示的氨基酸序列及其盐或酯。本发明的仿生防龋多肽多肽主要包含具有HA结合特性的“HA6-1(SVSVGMKPSPRP)”氨基酸序列及可以诱导早期龋再矿化的“QPX”的氨基酸序列，还可以包含能够与钙离子作用并引发HA成核的氨基酸序列“TKREEVD”。该多肽分子量较小，可提高在牙釉质表面的吸附，进而更好地发挥其作用，促进早期脱矿牙釉质（早期龋）的再矿化，合成方便，经济实惠，效果较好且安全可靠。

Description

一种仿生防龋多肽及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种防龋技术，特别涉及一种仿生防龋多肽及其制备方法和用途。

背景技术

龋病是人类最常见的口腔疾病。由于龋病发病率高，流行区广，严重影响口腔及全身健康，世界卫生组织已将其列为人类重点防治的三大非传染性疾病之一，仅次于心血管疾病和肿瘤。

氟化物作为一种经典的防龋制剂，在过去的四十多年里，以各种不同的形式被利用，如饮水加氟、含氟牛奶或含氟食盐、局部涂氟(含氟牙膏、含氟凝胶、含氟漱口水 )等，从而能不同程度地降低人群中的患龋率，被公认为当前世界上最有效的防龋措施。然而随着多种氟化物制剂使用的推广，使用浓度及频率的增加，耐氟菌株、氟斑牙、氟骨症的出现使氟化物防龋局限性日益突显。

抗微生物制剂如洗必泰、四环素等，可直接作用于细菌而预防龋病，但长期使用易引起口腔菌群失调，使细菌产生耐药性，具有明显的毒副作用。

免疫防龋具有一定效果，但存在增强免疫原性及人体应用安全性问题，此外影响口腔菌群生态的问题也函待解决。

中药如儿茶、大黄、黄芩、蜂房、槟榔、三七、茶多酚等已被证实具有干扰细菌代谢、抑制牙菌斑生物膜形成等作用，但存在药液牙体染色、耐药性等问题。

不定形磷酸钙、糖的替代品木糖醇及山梨醇、中药五倍子及隔消山、纳米羟磷灰石、酪蛋白磷酸肽、微量元素、橄榄油、树脂等的再矿化作用被先后报道，但由于效果不明显或实验结果不一，目前结论尚未统一。

针对上述问题，本领域积极探寻其他的防龋药物和方法。

釉基质蛋白（EMP）是一组来自上皮根鞘的蛋白质，是在牙齿发育期Hertwig上皮根鞘内层的成釉细胞分泌的一种调控牙矿化的基质蛋白，在牙本质刚刚开始矿化之前表达，在牙本质早期成熟阶段停止表达。釉基质蛋白含有釉原蛋白、成釉蛋白、釉蛋白等蛋白质成分，其中釉原蛋白占发育期牙釉质蛋白质提取物的90%以上。釉原蛋白在釉基质生物矿化过程中起着决定性作用。成釉细胞分泌釉原蛋白后，在牙本质的诱导下，釉质很快进行生物矿化。釉原蛋白对釉质矿化的起始、晶核的形成及排列等诸多因素起着重要作用。釉原蛋白可为釉质生物矿化提供必要的支架，并且还可控制晶体生长的速度，维持晶体生长，是釉质生物矿化的关键。

近年，基于釉基质蛋白的生物矿化功能，体外利用釉基质蛋白合成人工羟磷灰石已获得成功。Chen 等模拟牙釉质矿化过程, 利用釉基质蛋白控制合成了在化学组成上和晶体尺寸上都和自然牙釉质非常相似的纳米棒状羟磷灰石。Yamagish等在牙釉质表面形成了具有釉质结构的氟磷灰石，这些氟磷灰石排列致密，平行排列，垂直于釉质表面。国内学者王志伟等将牙釉质放置在含SD大鼠牙釉基质蛋白的磷酸盐琼脂-醋酸钙溶液体系中7天，结果发现添加釉基质蛋白的牙釉质表面出现晶体带状结构。这些实验结果均提示釉基质蛋白具有诱导牙釉质再矿化的强大潜力，利用釉基质蛋白的这种潜力从而促进早期龋再矿化，极可能为龋病防治提供一条崭新的思路。

但是，目前釉基质蛋白尚未直接用于防龋。目前釉基质蛋白主要通过以下途径获得：①从牙胚中提取釉基质蛋白。②根据釉原蛋白、非成釉蛋白的基因序列，利用生物工程技术实现了釉原蛋白的人工基因重组，如重组大鼠的釉原蛋白Mr179、Mrl66。③商品化的釉基质衍生物。1999年瑞典Biora开发了Emdogain?? (釉原蛋白的商品名)产品，经美国FDA批准用作牙周骨内缺损与根面平整区域的治疗，随后在牙周病治疗和牙周缺损修复中得到极为广泛应用。上述釉基质蛋白来源中，提取法需要组织材料较多，得到的是不同分子量的混合成分，很难得到高纯度产物；基因重组蛋白程序复杂，且翻译后加工修饰体系不完善，复性和修饰很困难，蛋白功能常不完善；瑞典Emdogain??为猪牙胚提取的釉基质蛋白纯化，取典型釉原蛋白的3个相对分子量峰值冻干保存获得，虽然具有明显促牙周组织再生作用，但可能丢失有效的防龋功能片段。综上述，目前釉基质蛋白的获得方法复杂且可能丢失有效的防龋片段，如何利用釉基质蛋白进行有效防龋成为本领域一直想解决但未能解决的难题。

发明内容

本发明的发明目的之一在于：针对上述存在的问题，创新性提出利用仿生矿化防龋的思想，构建一种可有效防龋的多肽。

本发明采用的技术方案是这样的：一种防龋多肽，包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，以及包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的盐或酯；

SEQ ID NO.1：SVSVGMKPSPRPQPHQPMQPQ

釉原蛋白是由很多个不同的氨基酸组成的，发明人通过分析总结发现：釉原蛋白含有很多的重复单元，如“QPX”重复序列，然后发明人通过大量实验得出：“QPX”序列能诱导釉质的再矿化作用，“HA6-1(SVSVGMKPSPRP)”氨基酸序列能与HA特性结合，因此，本发明“SVSVGMKPSPRP”氨基酸序列的基础上结合釉原蛋白中的“QPX”序列，从而构建了本发明的防龋多肽，这种多肽分子量较小，可提高在牙釉质表面的吸附，进而更好地发挥其作用，促进脱矿牙釉质的再矿化，从而达到防龋目的。

一种防龋多肽，包含如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO.2：SVSVGMKPSPRPQPHQPMQPQTKREEVD

在原“SVSVGMKPSPRPQPHQPMQPQ”序列的基础上，再加上亲水端“TKREEVD”，该亲水端可以与钙离子作用并引发HA成核，从而产生更好的防龋效果。

本发明的目的之二，本发明的目的之二，在于提供一种包括上述多肽、其药学上可接受盐或酯的药物组合物/制剂；所述药物组合物/制剂除包括上述多肽、其药学上可接受盐或酯外，还可包括合适的药学上可接受的载体和/或辅料。

作为优选技术方案，所述药物组合物/制剂优选凝胶剂。

本发明的目的之三，在于提供一种上述多肽的制备方法，所采用的技术方案是：包括以下步骤：按照SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，将第一个氨基被Fmoc保护的氨基酸链接到固相载体Wang树脂上，然后脱掉氨基保护基；然后将氨基被Fmoc保护的第二个氨基酸在缩合剂的活化作用下与已连接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键；重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至最后一个氨基酸接入；切割得到目标多肽。这种合成方法简单易行，生产成本低。

本发明的目的之四，在于提供上述多肽在制备用于防龋的药物中的应用。可以将该多肽与不同的辅料制成各种不同的剂型，以用于防龋。

本发明的凝胶剂直接作用于早期龋损部位，从而达到治疗效果。现在最常用的防龋制剂为氟化钠，其主要实施方案为饮水加氟、含氟牛奶或含氟食盐、局部涂氟(含氟牙膏、含氟凝胶、含氟漱口水 )等，其他的一些防龋制剂一般均配置成液体制剂，局部作用于龋损部位。本发明的凝胶剂进一步优选水性凝胶剂，所用辅料按功能分类，可包括：增稠剂、保湿剂、防腐剂、稳定剂、pH调节剂等。具体而言，常用凝胶基质有水、甘油、丙二醇、纤维素衍生物、卡波姆、海藻酸盐或酯、西黄蓍胶、明胶、淀粉等。

与已有防龋制剂的实施方案相比，本发明将该多肽制备成凝胶状态，减少其流动性，从而增加了局部作用时间，可以使该多肽发挥最大的功效，从而很好的治疗早期釉质龋。另外，构建的该多肽片段来源于人釉原蛋白氨基酸序列，因此与目前现有的化学或中药防龋制剂比，有更好的安全性和生物相容性。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：本发明的多肽主要包含具有HA结合特性的“HA6-1(SVSVGMKPSPRP)”氨基酸序列及可以诱导早期龋再矿化的“QPX”的氨基酸序列，又包含可以与钙离子作用并引发HA成核的氨基酸序列“TKREEVD”，且经过重新合成该多肽分子量较小，可提高在牙釉质表面的吸附，进而更好地发挥其作用，促进脱矿牙釉质的再矿化；本发明能够很好地促进早期脱矿的牙釉质（早期龋）再矿化，且其合成方便，经济实惠，效果较好且安全可靠。

附图说明

图1是阳性对照经典防龋化学制剂NaF组再矿化前后的显微放射照相图；

图2是阳性对照经典防龋化学制剂NaF组再矿化前后的偏光图；

图3是阴性对照组HEPES组再矿化前后的显微放射照相图；

图4是阴性对照组HEPES组再矿化前后的偏光图；

图5是实施例1的防龋多肽组再矿化前后的显微放射照相图；

图6是实施例1的防龋多肽组再矿化前后的偏光图；

图7是实施例2的防龋多肽组再矿化前后的显微放射照相图；

图8是实施例2的防龋多肽组再矿化前后的偏光图。

具体实施方式

下面对本发明作详细的说明。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：

一种防龋多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

SEQ ID NO.1：SVSVGMKPSPRPQPHQPMQPQ

实施例2

一种防龋多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

SEQ ID NO.2：SVSVGMKPSPRPQPHQPMQPQTKREEVD

实施例3：SEQ ID NO.1多肽的制备

1.选用Fmoc-Gln(Trt)-Wang Resin作为载体（树脂）。

2.用DCM将树脂充分溶胀。用DMF清洗几遍。

3.用适当浓度的DBLK，将Fmoc-保护基团脱出。

4.用DMF清洗数遍，洗去DBLK。

5.称取适合的缩合剂和活化剂（HBTU，NMM）以及C端第二个Fmoc-保护氨基酸（Fmoc-Pro-OH）进行偶联。

6.茚三酮检测法进行检测确保连接比较完全。

7.用DMF清洗几遍，洗去残留的各种残基和活化剂缩合剂。

8.依氨基酸序列进行偶联，方法同步骤3-7.

9.将所有的氨基酸连接结束后采用步骤3，4的方法脱去最后的Fmoc-保护基团。

10.用切割液裂解，去除树脂和氨基酸保护集团，得到粗品。

11.送质谱确认产品正确（分子量2313.691符合理论值）。

12.粗品送纯化分离，提高纯度。

实施例4：SEQ ID NO.2多肽的制备：

1.选用Fmoc-Asp(OtBu)-Wang Resin作为树脂（载体）；

2.用DCM将树脂充分溶胀。用DMF清洗几遍。

3.用适当浓度的DBLK（六氢吡啶+DMF），将Fmoc-保护基团脱出。

4.用DMF清洗数遍，洗去DBLK。

5.称取适合的缩合剂和活化剂（HBTU，NMM）以及C端第二个Fmoc-保护氨基酸（Fomc-Val-OH）进行偶联。

6.茚三酮检测法进行检测确保连接比较完全。

7.用DMF清洗几遍，洗去残留的各种残基和活化剂缩合剂。

8.依SEQ ID NO.2氨基酸序列进行偶联，方法同3,4,5,6，7。

9.将所有的氨基酸连接结束后采用3，4方法脱去最后的Fmoc-保护基团。

10.用TFA切割液裂解，去除树脂和氨基酸保护基团，得到粗品。

11.送质谱确认产品正确（分子量3171.612符合理论值）。

12.粗品送纯化分离，提高纯度。

实施例5：凝胶剂的制备

将海藻酸丙二醇酯配制为6%（w/w），pH=4，粘度为400mPas的无菌水溶液。将0.25um/ml的釉基质蛋白功能多肽溶液0.1ml加入到0.9ml的海藻酸丙二醇酯6%w/w，混匀后分别形成含釉基质蛋白功能多肽浓度为0.025um/ml的高粘度(1000mPas)酸性溶胶。

实施例6：再矿化实验

本实验选择新鲜拔除的牛切牙，分离冠根，冠部超声清洗，干燥，体视显微镜(放大10倍)下观察无龋损、氟斑、裂痕的牙冠进一步用高速硬组织切割机将牙冠切成5×5×2mm大小的釉质块，唇面釉质用抛光机及800#-1200#-2400#碳化硅砂纸在流水下纸依次磨平、抛光，去除表层约150μm，自然干燥，用自凝塑胶将牙齿包埋，釉质块唇面中央保留4mm × 4mm的开窗区，其余部位涂布两层抗酸指甲油；

牛牙釉质标本由显微硬度计测量表面显微硬度值于每个釉质标本开窗区的中央垂直测5个点，每个点相距100??m，计算其平均值。选择120个硬度值范围为320-400KHN (Knoop hardness number，KHN)的釉质块进入进一步实验；

将釉质标本固定在自制的环形玻棒上，放入盛有人工脱矿液的玻璃器皿内，按每个标本8ml溶液加入脱矿液，磁力搅拌仪搅拌（100转/分），37℃下脱矿72小时，在釉质开窗区形成人工龋；

脱矿后再次测量其表面显微硬度，在基线测量点一侧平行测5个点，选择40个硬度值范围为160-220 KHN的釉质块进入下一步的再矿化实验。每个样本所开窗口的一半用抗酸指甲油覆盖作为再矿化实验前后形态学对照；

随机分为4组(每组10个标本)，按处理药物不同分别为：A. 1g/L氟化钠（NaF）组（阳性对照组）、 B. 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）组（阴性对照组）C. 25μmol/L防龋多肽组1（溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），实施例1的防龋多肽） D. 25μmol/L防龋多肽组2（溶于4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），实施例2的防龋多肽）.

每天pH循环包括2小时的脱矿，4次5分钟的药物处理时间，其余时间浸泡在再矿化溶液中，磁搅拌仪搅拌（100转/分），37℃下循环12天。

偏光显微镜观察

将每组10个样本，硬组织切割机垂直于釉质开窗区表面切片，每一切片包括脱矿釉质、再矿化釉质两部分，切片约厚300??m，然后进一步在抛光机流水下磨制成约100??m厚的薄片，采用贴附制备法，再经水浸渍后用偏光显微镜观察，数码图像由系统专用软件获取(Nikon ACT-1 for L-1, Nikon,日本)。

金标准显微放射照相定量分析

将切片固定于显微放射照相的特制载体上，20KV、20mA、曝光30s显微放射X线照射。计算机配套分析软件提供总矿物丢失量、龋损深度及矿物分布三个指标以评价pH循环后样本的再矿化状态；

结果数据如下：

pH循环前后各组的总矿物丢失量及龋损深度

组别 矿物丢失量(vol% ??m) 龋损深度(??m)

pH循环前 pH循环后 pH循环前 pH循环后

NaF 2540.0±503.9a 20250±229.4a* 117.30±30.2c 87.3±16.6c*

HEPES 2741.0±652.7a 2806±668.0b 100.4±37.9c 114.6±21.5d

多肽1 2462.0±272.1a 21180±208.4a* 118.4±21.5c 95.0±12.2c*

多肽2 2411.0±315.7a 1821.0±375.2a* 115.1±15.2c 82.2±10.9c*

注：Mean± SD, N = 10，不同的字母a、b、c、d表示组间有显著性差异（P<0.05），

相同字母表示组间差异不具有统计学意义（P>0.05）；

*表示各组内PH循环前后有显著差异（P<0.05）

统计分析

统计学分析均采用软件SPSS17.0 处理，循环前后各组矿物含量、龋损深度的比较选用配对 t 检验（Student’s paired t-test）。循环后各组平均矿物含量、龋损深度的比较选用单因素方差分析（ANOVA）及其两两比较（Student-Newman-Keuls test），α=0.05。

实验结果

偏光显微镜示：各组再矿化前制备的人工龋均表现为典型的表层下脱矿，具有负性双折射的完整表层和位于表层下呈阳性双折射的病损体部。再矿化后，氟化钠组及防龋多肽组1和防龋多肽组2标本龋损表层明显增厚，且龋损深度变浅，HEPES组标本的表层及龋损深度在再矿化前后无明显改变。

显微放射照相示，所得的显微放射结果如图1-4所示；再矿化后，防龋多肽组1和防龋多肽组2与氟化钠组较HEPES组表层阻射区增厚，表层下的透射区也较浅；pH循环后各组的矿物丢失量及龋损深度比较显示，氟化钠组和两组防龋多肽的矿物丢失量及龋损深度的差异无统计学意义（p>0.05）,但显著低于HEPES组（p<0.05）,这些结果均表明此两种防龋多肽具有促进釉质早期龋再矿化、抑制龋损进程的作用，具有显著的防龋作用，而且，增加了亲水端的序列为SEQ ID NO.2的多肽的促进釉质早期龋再矿化、抑制龋损进程的作用比序列为SEQ ID NO.1的多肽更好。

<110> 四川大学

<120> 一种仿生防龋多肽及其制备方法和用途

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<222> (1)...(21)

<400> 1

Ser Val Ser Val Gly Met Lys Pro Ser Pro Arg Pro Gln Pro His Gln

1 5 10 15

Pro Met Gln Pro Gln

20

<210> 2

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<222> (1)...(28)

<400> 2

Ser Val Ser Val Gly Met Lys Pro Ser Pro Arg Pro Gln Pro His Gln

1 5 10 15

Pro Met Gln Pro Gln Thr Lys Arg Glu Glu Val Asp。

20 25

Claims (6)

1.一种仿生防龋多肽，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种仿生防龋多肽，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种仿生防龋药物组合物，其特征在于：所述药物组合物包括如权利要求1或2所述的仿生防龋多肽以及其药学上可接受的载体和/或辅料。

4.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物为凝胶剂。

5.权利要求1或2所述仿生防龋多肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：按照SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，将氨基被Fmoc保护的第一个氨基酸链接到固相载体Wang树脂上，然后脱掉氨基保护基；然后将氨基被Fmoc保护的第二个氨基酸在缩合剂的活化作用下与已连接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键；重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至最后一个氨基酸接入；切割得到目标多肽。

6.权利要求1或2所述的仿生防龋多肽在制备用于防龋的药物中的应用。