CN107556374A - 唾液富脯蛋白仿生防龋功能多肽、其衍生物和盐及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的唾液富脯蛋白仿生防龋功能多肽、多肽衍生物或其药学上可接受的盐，所述多肽是唾液中性富脯蛋白2的一个多肽片段，具有促进羟基磷灰石成核的能力，并能够促进脱矿牙釉质再矿化，降低脱矿牙釉质的龋深及矿物丢失量；该多肽具有良好的结构稳定性，且无明显细胞毒性，而且与天然富脯蛋白相比，分子量小，能通过人工合成得到，成本低、容易纯化，更具有成药潜力。本发明还提供了所述多肽在制备防龋药物中的用途。

Description

唾液富脯蛋白仿生防龋功能多肽、其衍生物和盐及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种唾液富脯蛋白仿生防龋功能多肽、多肽衍生物或其盐及其在制药中的应用。

背景技术

龋病是一种感染性疾病，也是人类最常见的口腔疾病，发病率高，流行区广，严重影响口腔及全身健康，世界卫生组织已将其列为人类重点防治的三大非传染性疾病之一。龋病的发病机制是在口腔致龋菌产酸作用下，牙齿硬组织发生持续性脱矿，因此，促进脱矿牙体硬组织再矿化是龋病防治的重要方面。

作为经典的防龋制剂，氟化物能不同程度地降低人群中的患龋率，被公认为目前世界上最有效的防龋制剂。然而随着多种氟化物制剂使用的推广，耐氟菌株、氟斑牙、氟骨症的出现使氟化物防龋局限性日益突显。洗必泰、四环素、中药等利用抑制致龋菌防龋的制剂亦各自表现出不足。不定形磷酸钙、糖醇、中药五倍子及隔消山、纳米羟磷灰石以及树脂等的再矿化作用被先后报道，但由于效果不明显或实验结果不一，目前结论尚未统一。

针对上述问题，本领域积极探寻其他的防龋药物和方法。

借助仿生思想，对天然牙发育过程中的调控因子进行仿生，设计促矿化功能多肽，或对天然防龋成分进行仿生，已成为龋病防治的一种新的理想途径。发明人在专利CN201310354537.3和CN201310355804.9中基于釉原蛋白的氨基酸序列特征，设计并开发了一系列的小分子防龋多肽，这为发明人从天然仿生防龋因子角度出发，进一步进行仿生防龋研究提供可能、奠定基础。然而，目前的牙源性仿生防龋功能多肽的动物实验发现这些多肽的体内防龋效果欠佳，提示复杂的口腔环境和唾液中的相关成分可能影响了这些功能多肽的结构和功能。因此，构建在口腔内兼具防龋功能稳定性和结构稳定性的功能多肽，是目前仿生功能多肽防龋临床应用必需解决的问题。

在龋病的病因学研究中，除了牙齿本身作为宿主的易感因素外，唾液在龋病的发生发展过程中发挥着重要作用，被认为是龋病病因中参与调控龋病进展最重要的宿主因素之一。1912年Head首次提出了唾液可使软化牙釉质再次恢复硬度的假说，随后Pigman等人开始关注唾液对牙釉质的再矿化功能方面的研究。作为唾液中最有意义的成分，唾液蛋白参与釉质表面获得性膜的形成，对维持牙面完整性、促进已脱矿牙齿再矿化和调节口腔菌群具有重要影响。唾液是口腔内牙体硬组织紧密接触的微环境，唾液中的有机成分－唾液蛋白的防龋作用被陆续证实。其中，研究发现唾液富脯蛋白可以选择性吸附到羟基磷灰石表面，吸附钙磷，并维持钙磷离子的过饱和状态。但是天然唾液蛋白分子量大，存在着提取困难、价格昂贵、容易变性等方面的不足，因此，为实现预防或阻断龋病的目的，研发合成具有促矿化功能的仿生防龋功能多肽，具有重要的研究意义。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种分子量更小，且在口腔中稳定的唾液蛋白仿生防龋功能多肽。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种唾液富脯蛋白仿生防龋功能多肽、多肽衍生物或其药学上可接受的盐，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：PPGKPQGPPPQG。

富脯蛋白的含量占唾液蛋白总分泌量的70％，早在60和70年代，富脯蛋白就引起了科学界的注意，针对其一级结构的分析表明，富脯蛋白氨基端的前30个氨基酸对钙离子结合力最强，且大于整个富脯蛋白分子吸附钙离子的平均能力，这可能与第8和22位的色氨酸磷酸化有关。此外，研究发现中性富脯蛋白还可以吸附变异链球菌，并能原位中和链球菌代谢碳水化合物的酸性产物。并且，中性富脯蛋白2(PRB2)被发现在无龋人群较龋病患者的唾液中有更高的表达水平，因此，PRB2被认为具有潜在的防龋作用，但该蛋白的关键防龋功能片段目前尚缺乏深入研究。根据本发明人的大量实验研究发现，PRB2中的PPGKPQGPPPQG多肽片段具有促矿化功能和良好的防龋效果。该多肽的分子量较小，比含有416位氨基酸的PRB2、以及现有技术中的釉原蛋白仿生多肽具有更高的结构稳定性，釉质表面吸附能力更强，因而制备成防龋药物在口腔中能更好地发挥其防龋作用。

上述唾液富脯蛋白仿生防龋功能多肽、多肽衍生物或其药学上可接受的盐，所述多肽衍生物包括多肽的C端酰胺化物和酯等，所述药学上可接受的盐包括但不限于盐酸盐、硫酸盐、乙酸盐、甲磺酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、苹果酸盐、有机胺盐等。

本发明还提供了一种含有上述唾液富脯蛋白仿生防龋功能多肽、多肽衍生物或其药学上可接受的盐的药物组合物，所述药物组合物还可包括合适的药学上可接受的载体和/或辅料。

所述药学上可接受的载体包括但不限于无菌液体，如水、或者动物、植物或人工合成的油或其混合物，药用辅料包括但不限于淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽糖、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇、湿润剂、乳化剂或pH缓冲剂、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。

本发明上述的药物组合物可以在现有制剂工艺条件下制备成适宜临床应用的制剂，所述制剂包括液体制剂、固体制剂和半固体制剂，所述液体制剂包括但不限于溶液剂、注射剂，所述固体制剂包括但不限于片剂、胶囊剂，所述半固体制剂包括但不限于软膏剂、凝胶剂。

本发明的唾液富脯蛋白仿生防龋功能多肽、多肽衍生物或其药学上可接受的盐可以根据本领域人工合成多肽的常用方法进行制备。本发明提供的制备上述多肽方法是：根据即将制备的氨基酸序列，将第一个氨基酰胺化，用Fmoc保护其氨基，然后连接到固相载体Wang树脂上，然后脱掉氨基保护基；然后将氨基被Fmoc保护的第二个氨基酸在缩合剂的活化作用下与已连接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键；重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至最后一个氨基酸接入，切割后得到目标多肽。这种合成方法简单易行，生产成本低。

最后，本发明还提供了上述唾液富脯蛋白仿生防龋功能多肽、多肽衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于防龋的药物中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明的多肽可吸附羟基磷灰石，又能与钙磷离子作用并诱导羟基磷灰石成核，进而促进脱矿釉质的再矿化，防龋效果较好；并且分子量小，结构稳定且简单，可以通过简单易行的步骤人工合成，经济实惠，生产成本低；此外，该小分子多肽对人口腔角质细胞无毒性，安全可靠。

附图说明

图1为实施例2多肽PG12对羟基磷灰石成核能力的透射电镜和选区电子衍射检测结果；

图2为实施例2多肽PG12对羟基磷灰石成核能力的能谱分析结果；

图3为实施例3多肽PG12对脱矿牙釉质龋的再矿化作用结果，即表面显微硬度的恢复情况图；

图4为实施例3多肽PG12对脱矿牙釉质龋的再矿化作用结果，即偏光显微镜的检测图；

图5为实施例3多肽PG12对脱矿牙釉质龋的再矿化作用结果，A：龋损处理前后各组矿物丢失量比较，B：再矿化处理前后各组龋损深度比较；

图6为实施例3多肽PG12对脱矿牙釉质龋的再矿化作用结果，即再矿化处理前后不同龋损深度矿物质含量比较；

图7为实施例4多肽PG12的二级结构检测和稳定性检测结果；

图8为实施例5多肽PG12体外细胞毒性研究结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种唾液富脯蛋白仿生防龋功能多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1：PPGKPQGPPPQG(以下简称PG12)。

按照以下步骤制备：

1、选用Fmoc-His(Trt)-Wang Resin作为树脂(载体)；

2、用DCM将树脂充分溶胀；

3、用适当浓度的DBLK(六氢吡啶+DMF)，将Fmoc-保护基团脱出；

4、用DMF清洗数遍，洗去DBLK；

5、称取适合的缩合剂和活化剂(HBTU，NMM)以及C端第二个Fmoc-保护氨基酸(Fomc-Leu-OH)进行偶联；

6、茚三酮检测法进行检测确保连接比较完全；

7、用DMF清洗几遍，洗去残留的各种残基和活化剂缩合剂；

8、依SEQ ID NO.1氨基酸序列进行偶联，方法参照步骤3-7；

9、将所有的氨基酸连接结束后采用步骤3，4方法脱去最后的Fmoc-保护基团；

10、用TFA切割液裂解，去除树脂和氨基酸保护基团，得到粗品；

11、送质谱确认产品正确(分子量1156.29符合理论值)；

12、粗品送纯化分离，提高纯度。

实施例2多肽对羟基磷灰石成核能力的检测

1、制备50μM多肽PG12溶液，分别加入终浓度为1.6mM Na₂HPO₄和3.3mM CaCl₂溶液，pH调为7.4，37℃摇床孵育24h(100转/分)。

2、分别取10μl反应后溶液滴加于铜网上，阴性对照为不加多肽的Na₂HPO₄和CaCl₂溶液。透射电镜下观察铜网上的沉淀物形态。图1显示多肽PG12组形成的晶体较阴性对照组更加致密，呈束状或柱状形态，提示PG12具有良好的促进羟基磷灰石成核生长的能力。

3、选取电子衍射显示多肽PG12组形成的晶体沉淀物具有羟基磷灰石特征衍射环004、002和211，且004和002环的衍射增强，提示在多肽PG12的引导下，纳米晶体沿C轴生长，见图1。

4、能谱分析显示多肽PG12组形成晶体沉淀的钙磷比例为1.68，而天然羟基磷灰石的钙磷比例为1.67，两者非常接近，见图2。

实施例3多肽对脱矿牙釉质再矿化作用的研究

本实施例通过静态再矿化实验观察多肽对早期人工釉质龋的再矿化作用。

实验步骤如下：

1、釉质样本的制备：选择新鲜拔除的牛切牙，制备牛牙釉质样本。流动水下，使用三氧化二铝糊剂去除釉质表层染色、牙石以及不规则形态表面，去离子水超声荡洗20分钟后贮存于含有0.05％麝香草酚的PBS中，置于4℃冰箱中备用。分离冠根，将冠部牙体组织超声清洗20分钟，自然干燥，选取表面平整光滑、无氟斑、无色素、无裂痕的牙冠组织进行下一步操作。使用硬组织高速切割机将牙冠部分切成规格近约5×5×2mm大小的釉质块，使用抛光机并依次使用800#-1200#-2400#碳化硅水磨砂纸在流水下对唇面釉质进行磨平、抛光，去除约100μm表层釉质，以消除表面有机污染物以及不规则釉质型态。超声荡洗20分钟后自然干燥，使用环氧树脂将牙齿包埋，在釉质块唇面中央通过使用封口膜保留4mm×4mm的开窗区，开窗区之外的部位使用抗酸指甲油遮盖，抗酸指甲油分两次均匀涂布。通过表面显微硬度基线筛选出90个硬度值范围为340--380KHN的釉质块进入下一步实验。

2、人工早期釉质龋的制备：将牛牙釉质样本按釉质开窗区表面面积与溶液比率为2mm²/1ml在特定体积的脱矿液中脱矿(脱矿液：2.2mM Ca(NO₃)₂、2.2mM KH₂PO₄、50mM aceticacid、5.0mM NaN₃、0.5ppm NaF，pH 4.5)。磁力搅拌仪搅拌(100转/分)，37℃下脱矿72小时，在牛牙釉质样本开窗区形成脱矿早期釉质龋。

3、早期釉质龋显微硬度测定：对形成早期龋的釉质样本再次进行表面显微硬度值测定，记作SMH1，筛选出30个表面显微硬度值范围为140-220KHN的釉质块进入下一步的再矿化循环实验。将每个样本开窗区的一侧用4×2mm封口膜覆盖，并涂布抗酸指甲油封闭，以此作为再矿化循环前的早期釉质龋形态学对照。

4、静态再矿化实验：将筛选出的30个形成了早期龋的釉质样本随机分为3组，每组10个标本，按处理不同分为：实验组：PG12多肽组；阴性对照组：HEPES组；阳性对照组：1000ppm NaF组。37℃，实验组标本浸泡在50μM多肽溶液处理1小时，阴性对照组标本浸泡在HEPES溶液处理1小时，阳性对照组标本浸泡在NaF溶液处理1小时，各组标本经双蒸水冲洗3次后，浸泡在人工唾液中(1.5mM CaCl₂、0.9mM KH₂PO₄、130mM KCl、1.0mM NaN₃、20mMHEPES，pH 7.0)，人工唾液每天更换一次，在37℃密闭恒温箱内，使用磁力搅拌仪搅拌，100转/分。再矿化处理3天后和7天后，所有标本室温下干燥后进行进一步检测。

5、结果检测指标

5.1表面显微硬度

表面显微硬度仪各参数设置同前，再次测定再矿化处理后的釉质样本开窗区表面显微硬度，每个釉质样本测定五个点，其平均值即该样本经再矿化处理后的表面显微硬度值，记作SMH2。对三次不同阶段即分别为：正常牛牙釉质、经脱矿形成早期釉质龋、体外再矿化处理后的釉质样本进行比较，可计算得出每个样本最终的表面显微硬度恢复的百分比(SMHR％)：SMHR％＝(SMH2-SMH1)/(SMH1-SMH0)x 100％。

5.2偏光显微镜及横断显微放射照相

样本经再矿化处理后取出，去离子水冲洗，超声震荡20分钟，自然干燥，使用硬组织切割机垂直于开窗区对釉质样本进行表面切片处理，每个切片包含再矿化处理前后即早期人工龋部分和再矿化循环处理后两部分，切片约厚250μm，进而使用进口打磨砂纸在抛光机流水下将切片打磨成约100μm厚的薄片，最后将使用去离子水清洗后的磨片在经水浸渍后用偏光显微镜观察，数码图像由系统专用软件获取(NikonACT-1forL-1，Nikon，日本)。将切片固定于横断显微放射照相的特制载体上，经CuK X-ray，20kV，20mA的条件下曝光25s，呈像后采用Transversal Microradiography Software 2006(Inspektor ResearchSystems BV,荷兰)对图像进行分析，得到样本龋深，矿物含量的变化。

结果：再矿化后表面显微硬度检测结果如图3所示，标本分别经再矿化处理3天和7天后，NaF组和多肽组表面显微硬度值恢复百分比均显著高于阴性对照(P<0.05)。偏光显微镜显示：各组再矿化前制备的人工龋均表现为典型的表层下脱矿，具有负性双折射的完整表层和位于表层下呈阳性双折射的病损体部。再矿化后，NaF组及多肽组标本龋损表层明显增厚，且龋损深度变浅，见图4。横断显微放射照相分析结果如图5所示，①体外静态再矿化处理前后，HEPES组釉质样本的矿物丢失量无明显变化，而NaF组和多肽组釉质标本的矿物丢失量明显减少，且较体外再矿化处理前有统计学差异(P<0.05)，见图5A；②体外再矿化处理前后，HEPES组釉质样本的龋损深度无明显变化，而NaF组和多肽组釉质标本的龋损深度明显变浅，且较体外再矿化处理前有统计学差异(P<0.05)，见图5B；③对经体外再矿化处理后各组釉质样本的不同龋损深度的矿物含量分析表明，在龋损表层20μm处NaF组和多肽组与HEPES组釉质样本矿物含量无明显差异，在龋损20-150μm处，NaF组和多肽组釉质样本的矿物质含量明显高于HEPES组，且差异有统计学意义(P<0.05)，见图6。综上，再矿化实验结果证实，该防龋功能多肽具有促进脱矿牙釉质再矿化的功能。

实施例4多肽的圆二色光谱分析

目前针对研究蛋白多肽类药物的众多研究表明，蛋白多肽类药物的结构稳定性对其功能发挥以及远期的临床研究应用具有重要意义，且由于本发明所设计合成的功能多肽针对的是口腔龋病研究领域，因此对前述设计合成的唾液蛋白仿生防龋功能多肽进行结构稳定性检测尤为必要。圆二色谱检测技术(Circular dichroism简称CD)是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法。本实验用于测量多肽的结构，以验证其设计原理的有效性。

实验仪器

Jasco J-1500CD Spectrometer(日本)

实验步骤

25℃条件下，测量容器透光长度1mm,紫外光波长范围190nm至240nm。每个样品扫描10次取平均值。样品多肽浓度0.2mg/ml，溶于20mM HEPES溶液，分别测定2h和24h多肽的结构稳定性。所得数据通过公式计算出摩尔椭圆率绘制图表如图7。

实验结果：圆二色谱结构检测结果表明该多肽具有典型的β折叠/转角的二级结构，多肽在HEPES溶液中2小时和24小时检测结果表明随着多肽在溶液中时间的延长，其二级结构无明显改变，因此，多肽PG12在24小时内具有较为稳定的二级结构，为其远期的临床应用提供了有力保障。

实施例5多肽的生物安全性检测

通过观察多肽对人口腔上皮细胞(Human oral keratinocytes，HOK)活力的影响，检测多肽是否具有细胞毒性。HOK的活力通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)进行测定。

具体步骤如下：

1、HOKs接种96孔板中，每孔2×10³个细胞，培养覆盖面积大约为50％。使用20％胎牛血清(FBS)DMEM培养基培养。

2、将含有终浓度为50-500μM多肽PG12的培养液加入细胞中，经多肽处理过的和未处理(阴性对照)的细胞在CO₂培养箱中(5％CO₂，37℃恒温)培养24h。未加多肽的细胞培养基为阴性对照。

3、按照Am-blue试剂盒指导手册对于每个时间点的细胞进行操作。

4、使用酶标仪在450nm处读取数值。

实验结果如图8所示，体式显微镜下观察多肽PG12组(图8B)的细胞形态和阴性对照组(图8A)无明显差别，图8C中所得数据为每孔内液体吸光度，吸光度越高，说明细胞活性越好，在处理时间24h后，多肽处理对细胞增殖几乎没有影响。使用方差分析检验计算后，P值均大于0.05，均无统计学意义，说明多肽处理后对细胞活力几乎无影响。

综上所述，本发明借助仿生思想，对天然唾液蛋白进行仿生，设计具有促矿化功能的防龋多肽，为龋病的防治提供了一种新的理想途径。本发明的仿生防龋功能多肽具有良好的促进羟基磷灰石成核的能力，并能够促进脱矿牙釉质再矿化，降低脱矿牙釉质的龋深及矿物丢失量；同时，该多肽具有良好的结构稳定性，且无明显细胞毒性。综上，该多肽在龋病防治领域具有重要的研究价值。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学

<120> 唾液富脯蛋白仿生防龋功能多肽、其衍生物和盐及其应用

<130> 2017802

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(12)

<400> 1

Pro Pro Gly Lys Pro Gln Gly Pro Pro Pro Gln Gly

1 5 10

Claims (5)

1.一种唾液富脯蛋白仿生防龋功能多肽、多肽衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的唾液富脯蛋白仿生防龋功能多肽、多肽衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述多肽衍生物为多肽的C端酰胺化物或酯；所述药学上可接受的盐是盐酸盐、硫酸盐、乙酸盐、甲磺酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、苹果酸盐或有机胺盐。

3.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1或2所述的唾液富脯蛋白仿生防龋功能多肽、多肽衍生物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体和/或辅料。

4.一种含有权利要求3所述药物组合物的药物制剂，其特征在于，所述制剂为液体制剂、固体制剂或半固体制剂，所述液体制剂为溶液剂或注射剂，所述固体制剂为片剂或胶囊剂，所述半固体制剂为软膏剂或凝胶剂。

5.如权利要求1或2所述的唾液富脯蛋白仿生防龋功能多肽、多肽衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于防龋的药物中的应用。