CN103175925A - 依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法 - Google Patents

依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103175925A
CN103175925A CN201310088284XA CN201310088284A CN103175925A CN 103175925 A CN103175925 A CN 103175925A CN 201310088284X A CN201310088284X A CN 201310088284XA CN 201310088284 A CN201310088284 A CN 201310088284A CN 103175925 A CN103175925 A CN 103175925A
Authority
CN
China
Prior art keywords
benzyl ester
heparin benzyl
enoxaparin sodium
heparin
esterification yield
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201310088284XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN103175925B (zh
Inventor
周霞
林勇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Chenlong Pharmaceutical Co. Ltd.
Original Assignee
Shandong Chenzhong Biological Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Chenzhong Biological Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Shandong Chenzhong Biological Pharmaceutical Co Ltd
Priority to CN201310088284.XA priority Critical patent/CN103175925B/zh
Publication of CN103175925A publication Critical patent/CN103175925A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103175925B publication Critical patent/CN103175925B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了一种依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法，属于生物医药领域。该方法采用反相液相色谱法，利用带紫外检测器的高效液相色谱仪对肝素苄基酯在碱性环境下脱落生成的苯甲醇进行定量检测，并以此反映肝素苄基酯的酯化率，从而达到控制依诺肝素钠成品质量的目的。与现有技术相比，本发明的检测方法可以简单、快速、准确地监测肝素苄基酯的酯化率，从而降低依诺肝素钠成品的不合格风险和企业生产成本，具有很好的推广应用价值。

Description

依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地说是一种依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法。
背景技术
肝素类药物是抗凝血药的首选药物，使用历史已有70多年，除具有抗凝血、抗血栓作用外，还有降血脂等作用，但具有生物利用度低、副作用大等缺陷，限制了肝素在临床上的应用。近年来具有高抗栓活性和低出血副作用的新一代抗凝药物——低分子量肝素(LMWH)被开发上市。新一代抗凝药的抗血栓作用优于肝素，而抗凝血作用却低于肝素，并具有生物利用度高、体内半衰期长、出血倾向小、口服易吸收等特点。除用于治疗血栓病外，还可抑制动脉粥样硬化，抗肿瘤、抗炎等，且临床应用无需监护，用药便捷。
低分子量肝素(LMWH)(Robert J.Linhardt，PH.D.And Nur SibelGuany，M.S，Seminar in Thrombosis and Hemostasis，1999，25(3)：5-16)是在分离普通肝素时得到的一些低分子量组分，或肝素裂解后产生的小分子片段，长度约普通肝素的1/3。LMWH分子量在3000-8000Da之间，平均分子量为5000Da左右。与普通肝素相比，通过体内、外实验发现，在同等剂量下，LMWH的抗凝作用小于肝素，但其体内和体外抗血栓作用明显强于普通肝素。
依诺肝素钠(Enoxaparin Sodium)作为其中的一种低分子肝素，占有低分子肝素60％以上的市场份额，是最为主要的低分子肝素。它通过对猪肠粘膜肝素的苄基酯衍生物进行碱解聚而获得。其中肝素苄基酯的制备中酯化程度的控制是生产工艺的关键。
肝素苄基酯的酯化程度直接影响依诺肝素成品中1，6-脱水结构、分子量及其分布、活性等关键指标的情况，其酯化率决定了后期降解的工艺参数，从而影响和制约依诺肝素钠的生产收率和产品成本，但目前还没有任何一种对肝素苄基酯的酯化率进行检测的方法面世，造成了酯化率控制的实施困难。
发明内容
本发明的技术任务是针对上述现有技术的不足，提供一种依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法。利用该方法可以简单、快速、准确地监测肝素苄基酯的酯化率，对下一步的降工艺解提供数据支持，从而实现控制依诺肝素钠成品的1，6脱水结构、分子量及其分布、活性等关键指标的目的。
本发明的技术任务是按以下方式实现的：依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)测试液配制
检测液：称取一定量的肝素苄基酯样品，将样品置于碱性环境下使其发生beta-消除反应以生成苯甲醇，反应一定时间后加入冰乙酸终止反应，并用超纯水稀释定容，备用；
对照液：称取一定量的苯甲醇标准品，加入超纯水溶解，备用；
(2)样品检测
利用辛基硅胶柱，采用带紫外检测器的高效液相色谱仪对步骤(1)所述检测液和对照液做进样检测，并通过如下公式计算得到酯化率X：
X = As / C S A R / C R × ( 1 - E % ) × 100 %
AS：检测溶液色谱图中苯甲醇峰峰面积；
AR：对照溶液色谱图中苯甲醇峰峰面积；
CS：检测溶液肝素苄基酯的浓度(mg/ml)；
CR：对照溶液苯甲醇的浓度(mg/ml)；
E％：肝素苄基酯的干燥失重。
步骤(1)中检测液的配制过程优选为：称取0.5～1.0g肝素苄基酯样品于反应容器中，加入10ml的5mol/L的氢氧化钠溶液溶解，水浴控温60～70℃，反应120分钟，加入10ml冰乙酸终止反应，用超纯化水稀释定容至100ml，摇匀，备用。
步骤(2)中高效液相色谱仪所用流动相优选为甲醇、乙腈的混合水溶液，甲醇、乙腈、超纯水的体积比为10∶20∶70。
步骤(2)中高效液相色谱仪的紫外检测波长为256nm，流速为1.0±01ml/min。
步骤(2)中辛基硅胶柱的内径为4.6mm，长为150mm，每米检测柱的理论塔板数不低于20000。
所述肝素苄基酯的干燥失重(E％)可利用卤素快速水分测定仪测定。
肝素苄基酯的苄基在碱性条件下脱落生成苯甲醇，本发明的检测方法用紫外检测器对苯甲醇进行定量检测，并以此反映肝素苄基酯的酯化率，与现有技术相比具有以下突出的有益效果：
(1)提出了一种明确的肝素苄基酯酯化率的检测方法，克服了依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯酯化率难以控制的难题，能够有效的监测肝素苄基酯的酯化率，控制依诺肝素钠成品的关键性指标的药典符合性，大大降低依诺肝素钠成品的不合格风险和企业生产成本；
(2)整个检测方法简单、快速、准确率高，便于工业化推广应用。
附图说明
附图1是实施例一中对照液色谱图；
附图2是实施例一中检测液色谱图；
附图3是实施例二中对照液色谱图；
附图4是实施例二中检测液色谱图。
具体实施方式
以具体实施例对本发明的依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法作以下详细地说明。
实施例一：
1、仪器与器具：
液相色谱仪(VWD检测器)、电子天平(十万分之一)、容量瓶(10mL，25mL，100mL)、微量移液器(1000μl)
2、试剂与试药：
甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、超纯水、苯甲醇标准品、冰乙酸(分析纯)、氢氧化钠(分析纯)
3、溶液制备：
3.1对照溶液：精密称取0.5g苯甲醇标准品于1000ml容量瓶中，用超纯水溶解并稀释至刻度，即得。
3.2检测液的配制：精密称取0.5g肝素苄基酯样品(ZKE120709)于100ml容量瓶中，加入10ml的5mol/L的氢氧化钠溶液溶解，水浴控温60～70℃，反应120分钟，加入10ml冰乙酸终止反应，用超纯化水稀释定容，摇匀，作为检测溶液。
4、检测条件：
4.1仪器：液相色谱仪；检测器：VWD(Variable Wavelength Detector)。
4.2色谱柱：Water-SymmtryShieldTMRP8分析柱和保护柱。长150mm，内径为4.6mm的不锈钢柱，以色谱专用的辛基硅凝胶为固定相。以长20mm，内径为3.9mm的柱子为保护柱，用相同的固定相填装。
4.3流动相：甲醇∶乙腈∶水＝10∶20∶70；
4.4检测波长：256nm；
4.5柱温：35℃；
4.6流速：1.0mL/min；
4.7运行时间：30min；
4.8进样体积：25μl。
5、数据处理：
称取待测样品(ZKE120709)约3.0g，按卤素快速水分测定仪操作规定测定待测样品的干燥失重，E％＝1.2％。
由谱图可知：
AS＝10.7
CS＝5.1mg/ml
AR＝22.2
CR＝0.5mg/ml
酯化率(m/m) X = As × C R A R × C S × ( 1 - E % ) × 100 % = 10.7 × 0.5 22.2 × 5.1 × ( 1 - 1.2 % ) × 100 % = 4.8 %
对照液谱图如附图1所示，检测液谱图如附图2所示。
实施例二：
以实施例一所述方法对肝素苄基酯样品ZKE120715进行检测。
E％＝1.8％。
由谱图可知：
AS＝10.6
CS＝4.8mg/ml
AR＝22.2
CR＝0.5mg/ml
酯化率(m/m) X = As × C R A R × C S × ( 1 - E % ) × 100 % = 10.6 × 0.5 22.2 × 4.8 × ( 1 - 1.8 % ) × 100 % = 5.1 %
对照液谱图如附图3所示，检测液谱图如附图4所示。

Claims (5)

1.依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)测试液配制
检测液：称取一定量的肝素苄基酯样品，将样品置于碱性环境下使其发生beta-消除反应以生成苯甲醇，反应一定时间后加入冰乙酸终止反应，并用超纯水稀释定容，备用；
对照液：称取一定量的苯甲醇标准品，加入超纯水溶解，定容，备用；
(2)样品检测
利用辛基硅胶柱，采用带紫外检测器的高效液相色谱仪对步骤(1)所述检测液和对照液做进样检测，并通过如下公式计算得到酯化率X：
X = As × C R A R × C S × ( 1 - E % ) × 100 %
AS：检测溶液色谱图中苯甲醇峰峰面积；
AR：对照溶液色谱图中苯甲醇峰峰面积；
CS：检测溶液肝素苄基酯的浓度(mg/ml)；
CR：对照溶液苯甲醇的浓度(mg/ml)；
E％：肝素苄基酯的干燥失重。
2.根据权利要求1所述的依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法，其特征在于，步骤(1)中检测液的配制过程为：称取0.5～1.0g肝素苄基酯样品于反应容器中，加入10ml的5mol/L的氢氧化钠溶液溶解，水浴控温60～70℃，反应120分钟，加入10ml冰乙酸终止反应，用超纯化水稀释定容至100ml，摇匀，备用。
3.根据权利要求1所述的依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法，其特征在于，步骤(2)中高效液相色谱仪所用流动相为甲醇、乙腈的混合水溶液，甲醇、乙腈、超纯水的体积比为10∶20∶70。
4.根据权利要求1所述的依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法，其特征在于，步骤(2)中高效液相色谱仪的紫外检测波长为256nm，流速为1.0±0.1ml/min。
5.根据权利要求1所述的依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法，其特征在于，步骤(2)中辛基硅胶柱的内径为4.6mm，长为150mm，每米检测柱的理论塔板数不低于20000。
CN201310088284.XA 2013-03-20 2013-03-20 依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法 Active CN103175925B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310088284.XA CN103175925B (zh) 2013-03-20 2013-03-20 依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310088284.XA CN103175925B (zh) 2013-03-20 2013-03-20 依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103175925A true CN103175925A (zh) 2013-06-26
CN103175925B CN103175925B (zh) 2014-12-03

Family

ID=48635924

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310088284.XA Active CN103175925B (zh) 2013-03-20 2013-03-20 依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103175925B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103439434A (zh) * 2013-09-12 2013-12-11 苏州英诺凯生物医药科技有限公司 一种依诺肝素钠中间体酯化率的检测方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5389618A (en) * 1990-06-26 1995-02-14 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Mixtures of particular LMW heparinic polysaccharides for the prophylaxis/treatment of acute thrombotic events
CN1447820A (zh) * 2000-07-21 2003-10-08 阿文蒂斯药物股份有限公司 由肝素衍生的多糖混合物、其制备方法及其药物组合物
US20050049222A1 (en) * 2003-08-29 2005-03-03 Opocrin S.P.A. Process for preparing high purity low molecular weight heparins
CN1850865A (zh) * 2006-05-24 2006-10-25 杭州九源基因工程有限公司 一种依诺肝素钠的纯化生产方法
CN101711771A (zh) * 2008-10-07 2010-05-26 上海喜恩医药科技发展有限公司 一种肝素衍生的多糖混合物及其制法和药物组合物

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5389618A (en) * 1990-06-26 1995-02-14 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Mixtures of particular LMW heparinic polysaccharides for the prophylaxis/treatment of acute thrombotic events
CN1447820A (zh) * 2000-07-21 2003-10-08 阿文蒂斯药物股份有限公司 由肝素衍生的多糖混合物、其制备方法及其药物组合物
US20050049222A1 (en) * 2003-08-29 2005-03-03 Opocrin S.P.A. Process for preparing high purity low molecular weight heparins
CN1850865A (zh) * 2006-05-24 2006-10-25 杭州九源基因工程有限公司 一种依诺肝素钠的纯化生产方法
CN101711771A (zh) * 2008-10-07 2010-05-26 上海喜恩医药科技发展有限公司 一种肝素衍生的多糖混合物及其制法和药物组合物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
倪寿亮 等: ""工业多糖中苯甲醇的高效液相色谱分析"", 《分析仪器》 *
齐文静: "《医药卫生科技辑》", 15 December 2010 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103439434A (zh) * 2013-09-12 2013-12-11 苏州英诺凯生物医药科技有限公司 一种依诺肝素钠中间体酯化率的检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN103175925B (zh) 2014-12-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Keire et al. Assay of possible economically motivated additives or native impurities levels in heparin by 1H NMR, SAX-HPLC, and anticoagulation time approaches
CN102323344A (zh) 一种定量检测透明质酸片段结构变化的方法
Qiao et al. Recent advances in biotechnology for heparin and heparan sulfate analysis
Wang et al. Liquid chromatography–diode array detection–mass spectrometry for compositional analysis of low molecular weight heparins
Wu et al. Determination of M/G ratio of propylene glycol alginate sodium sulfate by HPLC with pre-column derivatization
CN110146604A (zh) 一种测定缓释药物制剂中低含量焦亚硫酸钠的分析方法
CN103454369A (zh) 一种高效液相色谱检测血液中丙戊酸钠含量的方法
Lester et al. Reversible electrochemical sensor for detection of high-charge density polyanion contaminants in heparin
CN103175925B (zh) 依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法
CN109932455A (zh) 检测24h尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法
CN104950047A (zh) 用于检测制剂中盐酸美金刚或其类似物的含量、溶出度或释放度的方法
CN105606724A (zh) 一种用高效液相色谱法测定醋酸赖氨酸中有关物质的方法
CN103852542B (zh) 一种基于柱后衍生的低分子量肝素完全降解产物检测方法
CN103575835B (zh) 右旋糖酐40氯化钠注射液中2-糠醛的测定方法
JP6633828B2 (ja) 多糖類の測定方法及び測定装置
CN106053374A (zh) 硫酸新霉素紫外分光光度计检测方法
CN108845044A (zh) 一种磺丁基醚倍他环糊精钠中钠含量的检测方法
Li et al. One-hour screening of adulterated heparin by simplified peroxide digestion and fast RPIP-LC-MS2
CN101576539B (zh) 一种盐酸赛洛唑啉中杂质a的测定方法
CN109459503B (zh) 一种测定肝素类药物重均分子量和含量的方法
CN102901783A (zh) 一种普拉洛芬滴眼液的含量测定方法
Song et al. Absolute pharmacokinetics of heparin in primates
CN105628820A (zh) 一种低分子肝素生产过程中游离硫酸根离子快速检测方法
CN110887930A (zh) 一种测定工作场所中草酸含量的方法
CN111307990A (zh) 一种同时测定人工虎骨粉中胱氨酸和甲硫氨酸含量的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C53 Correction of patent of invention or patent application
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Zhou Xia

Inventor after: Lin Yong

Inventor after: Guo Wei

Inventor after: Guo Enzhong

Inventor after: Qiao Deqiang

Inventor before: Zhou Xia

Inventor before: Lin Yong

COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: ZHOU XIA LIN YONG TO: ZHOU XIA LIN YONG GUO WEI GUO ENZHONG QIAO DEQIANG

TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20190507

Address after: 272350 Zhanghuang Industrial Park, Yutai County, Jining City, Shandong Province

Patentee after: Shandong Chenlong Pharmaceutical Co. Ltd.

Address before: 272350 Zhanghuang Town Industrial Park, Yutai County, Jining City, Shandong Province

Patentee before: Shandong Chenzhong Biological Pharmaceutical Co., Ltd.

TR01 Transfer of patent right