CN103163242A - 一种检测琥珀酰化改性明胶及其注射液中结合琥珀酸的方法 - Google Patents
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Abstract
一种检测琥珀酰化改性明胶及其注射液中结合琥珀酸的方法，（1）用微波水解方法水解琥珀酰化改性明胶及其注射液中的结合琥珀酸；（2）用色谱法对步骤（1）得到的溶液中的琥珀酸进行测定。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测琥珀酰化改性明胶及其注射液中结合琥珀酸的方法。
背景技术
将明胶改性后制备的改性明胶注射液是一种血浆代用品，临床上已经广泛使用。以琥珀酰化工艺改性的明胶注射液种类有“琥珀酰明胶注射液”和“聚明胶肽注射液”两种。酰化反应的程度是该类产品的重要质量指标。现行琥珀酰明胶注射液药品质量标准中的酰化度测定方法中，结合琥珀酸采用了以盐酸110℃水解72小时样品后、经C18-HPLC-UV分离测定的方法。其缺点是：①水解操作时间、分离检测时间偏长，不适合中间品的质量控制的需要；②水解溶液直接进样，偏酸的溶液影响C18色谱柱的使用寿命；③琥珀酸的检测灵敏度偏低。曾采用二根C18串联-HPLC-UV法检测了市售聚明胶肽注射液（以琥珀酰化工艺生产）中的游离琥珀酸，结果为未检出，但该样品在采用离子色谱法时检出了游离琥珀酸。
此外，以琥珀酰化工艺生产的聚明胶肽注射液现行药品质量标准中，未规定酰化度控制指标，其质量标准存在缺陷，有待完善。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测灵敏度高、操作时间短的检测琥珀酰化改性明胶及其注射液中结合琥珀酸的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种检测琥珀酰化改性明胶及其注射液中结合琥珀酸的方法，（1）用微波水解方法水解琥珀酰化改性明胶及其注射液中的结合琥珀酸；（2）用色谱法对步骤（1）得到的溶液中的琥珀酸进行含量测定。
上述技术方案的改进，取琥珀酰化改性明胶或其注射液，置微波消解管内，加入无机酸，加盖后于130℃～170℃微波水解，微波水解时间约30分钟～120分钟，放冷并转移至容量瓶中，用水洗涤并定容后，精密量取2ml，在室温～70℃下气体吹干法去除无机酸，再用水洗涤并定容至10ml，依次用0.45μm微孔过滤器、ODS萃取柱、SP萃取柱处理后，注入色谱仪，分离并测定琥珀酸含量。
上述技术方案的进一步改进，所述无机酸为盐酸或三氟乙酸，所述的气体吹干去除无机酸中的气体为氮气或空气，所述的色谱仪为高效液相色谱仪或离子色谱仪。
上述技术方案的更进一步改进，所述无机酸为盐酸，所述的气体为空气，所述的色谱仪为离子色谱仪。
本发明的有益效果是：本发明采用微波水解法水解琥珀酰化改性明胶或其注射液，水解液经气体吹干去除无机酸，再用离子色谱法测定其结合琥珀酸含量。其水解时间仅需约1小时，一定温度下气体吹干去除无机酸不影响琥珀酸的回收率，分离检测时间缩短，检测灵敏度提高，能够满足中间品、成品的质量控制需要。与现行方法相比，本发明大大缩短了操作时间，提高了检测灵敏度，为琥珀酰化类改性明胶及注射液的中间品、成品的质量控制提供了适宜的方法，解决了生产过程中的质量控制难题，具有良好的应用前景和显著的经济效益。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。
具体实施方式
实施例1：水解液中无机酸去除方法的选择试验
以琥珀酸对照品的回收率，作为水解液中无机酸去除方法选择试验的考察指标。取琥珀酸对照品适量，加入浓盐酸和水适量后，模拟制成对照品水解溶液，精密量取2ml，分别采用水浴蒸干法、气体吹干法去除无机酸，再用水洗涤并稀释至10ml，依次用0.45μm微孔过滤器、ODS萃取柱、SP萃取柱处理后，分别注入离子色谱仪，分离测定琥珀酸含量，考察琥珀酸的回收率。适宜的分离测定条件为：离子色谱仪（如：日本东曹IC-2012）和阴离子交换柱（如：日本东曹TSKgel superIC-AZ，4.6mm×10cm），以碳酸盐缓冲液（1.9mmol/L碳酸氢钠+3.2mmol/L碳酸钠）为淋洗液，流速0.8ml/min；进样量30μl；抑制胶TSKsuppress IC-A；柱温40℃；电导检测器。结果（见表1）：70℃及以下气体吹干除酸效果较好，琥珀酸回收率高。因此，本发明中的水解液中无机酸的去除酸方法采用70℃及以下气体吹干法。
表1、水解液中无机酸去酸方法选择试验的结果表
| 干燥方法 | 回收率 |
| 水浴蒸干（玻璃蒸发皿） | 78.5% |
| 水浴蒸干（陶瓷蒸发皿） | 85.1% |
| 60℃空气吹干 | 99.4% |
| 70℃空气吹干 | 99.3% |
| 80℃空气吹干 | 89.0% |
| 70℃氮气吹干 | 99.5% |
实施例2： 微波水解温度的选择试验
以琥珀酸对照品的回收率，作为微波水解温度选择试验的考察指标。精密量取琥珀酸对照品水溶液1ml，置微波消解管内，加入浓盐酸5ml，在不同的温度、时间下进行微波水解，70℃空气吹干去除无机酸并处理后，注入离子色谱仪分离测定，考察琥珀酸的回收率。结果（见表2）：琥珀酸在170℃及以下微波水解时稳定，大于180℃时回收率下降。因此，本专利选择170℃温度下微波水解琥珀酰化改性明胶及其注射液。
表2、微波水解温度选择试验的结果表
实施例3：微波水解时间的选择试验
精密量取琥珀酰明胶注射液1ml，置微波消解管内，加入浓盐酸5ml，170℃下分别水解15、30、45、60、90、120分钟，将各水解液转移并用定容至25ml。精密量取2ml，70℃空气吹干去除无机酸，用水洗涤并稀释至10ml，依次用0.45μm微孔过滤器、ODS萃取柱、SP萃取柱处理，用离子色谱法测定琥珀酸含量。实验结果（见表3）表明：170℃水解60分钟即可将琥珀酰化改性明胶注射液中的结合的琥珀酸完全水解。
表3、微波水解时间选择试验的结果表
| 微波水解条件 | 琥珀酸含量（mg/L） |
| 170℃15分钟 | 830.3 |
| 170℃30分钟 | 832.2 |
| 170℃45分钟 | 964.3 |
| 170℃60分钟 | 1173.1 |
| 170℃90分钟 | 1179.7 |
| 170℃120分钟 | 1129.9 |
实施例4： 方法学验证—加标回收试验
精密量取琥珀酰明胶注射液（含琥珀酸1175.8mg/L）与琥珀酸对照品溶液（1455mg/L）等比例混合的溶液1ml，置微波消解管内，加入浓盐酸5ml，170℃微波水解70分钟，水解完毕后将水解液转移并定容至25ml。精密量取2ml，70℃空气吹干，用水洗涤定容至10ml，依次通过0.45μm微孔过滤器、ODS萃取柱、SP萃取柱处理，用离子色谱法测定琥珀酸含量，并计算琥珀酸的回收率。平行试验6份。结果（见表4）：平均加标回收率为99.4%，相对标准偏差为0.61%。
表4、琥珀酸加标回收试验的结果表
实施例5：琥珀酸色谱检测方法的比较试验
精密称取琥珀酸对照品适量制成适当的对照品溶液，分别采用两根RP-18柱串联的高效液相色谱法、本发明中的离子色谱法测定琥珀酸检测限（s/n=10），结果分别为600ng和14ng。
对1批市售琥珀酸明胶注射液，分别采用上述二种检测方法测定样品中的游离琥珀酸。结果：采用HPLC法未检出游离琥珀酸，而采用本发明中的离子色谱法检出的游离琥珀酸含量为38μg/ml，且分离时间缩短了1倍。
实施例6：本发明方法与现行方法测定的琥珀酸结果比较
精密量取6家生产企业生产的琥珀酰明胶或注射液、以及使用琥珀酰化工艺生产的聚明胶肽或注射液1ml，置波消解管内，加入浓盐酸5ml，170℃水解70分钟，将水解液转移并用水定容至25ml。精密量取2ml，70℃吹干，用水洗涤并稀释至10ml，依次用0.45μm微孔过滤器、ODS萃取柱、SP萃取柱处理，用离子色谱法测定琥珀酸含量。并与现行药品标准中的检测方法所得结果进行比较：两种方法测得的琥珀酸结果一致（见表5）。
表5：本发明方法与现行方法测定的琥珀酸结果比较表
Claims (4)
1.一种检测琥珀酰化改性明胶及其注射液中结合琥珀酸的方法，其特征在于：（1）用微波水解方法水解琥珀酰化改性明胶及其注射液中的结合琥珀酸；（2）用色谱法对步骤（1）得到的溶液中的琥珀酸进行测定。
2.根据权利要求1所述的检测琥珀酰化改性明胶及其注射液中结合琥珀酸的方法，其特征在于：取琥珀酰化改性明胶或其注射液，置微波消解管内，加入无机酸，加盖后于130℃～170℃微波水解，水解时间30分钟～120分钟，放冷，移至容量瓶中，用水洗涤并定容后，精密量取2ml，在室温～70℃下用气体吹干法去除无机酸，再用水洗涤并定容至10ml，依次用0.45μm微孔过滤器、ODS萃取柱、SP萃取柱处理后，注入色谱仪，分离并测定琥珀酸含量。
3.根据权利要求2所述的检测琥珀酰化改性明胶及其注射液中结合琥珀酸的方法，其特征在于：所述无机酸为盐酸或三氟乙酸；所述的水解法为微波水解；所述的气体吹干去除无机酸中的气体为氮气或空气；所述的色谱仪为高效液相色谱仪或离子色谱仪。
4.根据权利要求3所述的检测琥珀酰化类改性明胶注射液中结合琥珀酸的方法，其特征在于：所述无机酸为盐酸；所述的气体吹干去除无机酸中的气体为空气；所述的色谱仪为离子色谱仪。
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