CN103159852A

CN103159852A - 一种特异性克伦特罗人工抗原的合成方法

Info

Publication number: CN103159852A
Application number: CN2013101035925A
Authority: CN
Inventors: 胥传来; 刘丽强; 王利兵; 匡华; 徐利广; 马伟; 胡拥明
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2013-03-28
Filing date: 2013-03-28
Publication date: 2013-06-19
Anticipated expiration: 2033-03-28
Also published as: CN103159852B

Abstract

一种特异性克伦特罗人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明包括如下步骤：选择4-氨基-3,5-二氯苯甲酸作为克伦特罗的半抗原，该分子与克伦特罗分子的同源性大于50%，将该半抗原与载体蛋白进行偶联，得到克伦特罗人工抗原。实验结果表明，用本发明的抗原免疫动物得到的抗血清效价可达32000，检测限为1ng/mL，半抑制浓度IC₅₀为10ng/mL。产生的抗体特异性高、灵敏度高。本发明的抗原或抗体可用于建立酶联免疫吸附分析方法和胶体金试纸快速检测法，从而用于快速检测食品中的克伦特罗残留，具有广阔的应用前景。

Description

一种特异性克伦特罗人工抗原的合成方法

技术领域

一种高特异性克伦特罗人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

盐酸克伦特罗（Clenbuterol），又称“瘦肉精”，是一种平喘药。是肾上腺类神经兴奋剂，20世纪80年代初，美国Cyanamid公司意外发现其有明显的促进生长、提高瘦肉率及减少脂肪的效果，于是其被畜牧业作为瘦肉精使用。但由于其副作用，欧共体于1988年1月1日起禁止盐酸克伦特罗物质当饲料添加剂使用。1991年被FDA禁止。1997年，中华人民共和国农业部下文严禁β-腎上腺素类激素在饲料和畜牧生产中使用，盐酸克伦特罗列为第一位，2002年9月10起在中国境内禁止在饲料和动物饮用水中使用盐酸克伦特罗。

目前我国对克伦特罗的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、液质联用法(LC/MS)、酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、胶体金试纸条法等。仪器分析方法存在样品须经多步稀释、过滤、提取，制备复杂、繁琐的缺点。尽管仪器方法是克伦特罗检测的确证方法，但是由于其操作繁琐，以及长时间的样本前处理过程，导致检测成本高，周期长，无法满足大批量样本快速筛查，以及现场快速检测的要求。ELISA和胶体金试纸条法属于免疫分析技术，具有较高的灵敏度和特异性，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。

影响免疫分析方法的关键因素在于特异性的抗原和抗体。传统的克伦特罗人工抗原一般通过重氮化反应将苯环上的氨基与载体蛋白进行偶联。由于克伦特罗的部分结构与沙丁胺醇的部分结构类似，而且通过重氮化反应后，暴露出的最外端的叔丁基部分正好与沙丁胺醇的结构相同，因此用该抗原免疫产生的抗体不可避免的会对沙丁胺醇产生较高的交叉反应。本发明从克伦特罗分子的另一侧着手，以克伦特罗的类似物4-氨基-3,5-二氯苯甲酸上的羧基为位点与载体蛋白偶联形成了完全抗原。

发明内容

本发明的目的：针对现有克伦特罗抗原合成技术以及相应抗体的不足和缺陷，提供一种新型的克伦特罗人工抗原的合成方法，使得制备高特异性的克伦特罗单克隆抗体成为可能。

本发明提供的克伦特罗人工抗原化合物，具有式I所示分子结构。

（式I）

本发明的技术方案：一种特异性克伦特罗人工抗原的合成方法，以4-氨基-3,5-二氯苯甲酸为半抗原，将4-氨基-3,5-二氯苯甲酸（4-Amino-3,5-dichlorobenzoic acid，ADBA）上的羧基通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化、或者通过三正丁胺与氯甲酸异丁酯活化，再与载体蛋白上的氨基进行偶联，得到克伦特罗人工抗原，将人工抗原透析，然后进行紫外鉴定（图1）。

合成路线为：

工艺为：

（A）将4-氨基-3,5-二氯苯甲酸用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，4-氨基-3,5-二氯苯甲酸与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)的摩尔比为1:1.5:2，在4℃避光搅拌反应1h，再在室温反应12h，得活化的半抗原溶液；

取牛血清白蛋白，半抗原与牛血清白蛋白的摩尔比为80:1，牛血清白蛋白用0.1M pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，其中溶解后的牛血清白蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的体积比例为5:1；将活化的半抗原溶液慢速滴加到牛血清白蛋白溶液中，室温反应24h，用PBS缓冲液透析2天，期间更换PBS缓冲液4次，得到克伦特罗人工抗原；

或（B）将4-氨基-3,5-二氯苯甲酸用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，4-氨基-3,5-二氯苯甲酸与三正丁胺，氯甲酸异丁酯的摩尔比为1:1.2:1.2，0℃反应1h，得活化的半抗原溶液；

取牛血清白蛋白，半抗原与牛血清白蛋白的摩尔比为80:1，牛血清白蛋白用0.1M pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，0℃预冷30min，其中溶解后的牛血清白蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的体积比例为5:1；在0℃条件下，将活化的半抗原溶液慢速滴加到牛血清白蛋白溶液中，0℃条件下反应1h，然后室温反应24h；用PBS缓冲液透析2天，期间更换PBS缓冲液4次，得到克伦特罗人工抗原。

所述的4-氨基-3,5-二氯苯甲酸、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以及氯甲酸异丁酯纯度均大于95%。

所述的载体蛋白为：牛血清白蛋白BSA、阳离子化的牛血清白蛋白cBSA、匙孔血蓝蛋白KLH、血蓝蛋白LPH、鸡卵清白蛋白OVA、人血清白蛋白HSA之一种。

上述克伦特罗人工抗原化合物在制备克伦特罗抗体中的应用也属于本发明的保护范围。

上述克伦特罗人工抗原化合物免疫动物得到的抗体也属于本发明的保护范围，所述抗体为多克隆抗体和/或单克隆抗体。

上述克伦特罗人工抗原化合物或抗体在检测克伦特罗中的应用，检测食品中的克伦特罗残留也属于本发明保护的范围。

克伦特罗、沙丁胺醇以及4-氨基-3,5-二氯苯甲酸结构对比为：

本发明的有益效果：本发明是新型的克伦特罗人工抗原的合成方法，该人工抗原呈现出的特异性的克伦特罗抗原决定簇，使得筛选出高特异性的克伦特罗单克隆抗体成为可能。

实验结果表明，用本发明的抗原免疫动物得到的抗血清效价可达32000，检测限为1ng/mL，半抑制浓度IC₅₀为10ng/mL。产生的抗体特异性高、灵敏度高。本发明的抗原或抗体可用于建立酶联免疫吸附分析方法和胶体金试纸快速检测法，从而用于快速检测食品中的克伦特罗残留。

附图说明

图1、克伦特罗人工抗原紫外光谱图。

具体实施方式

下述实例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、克伦特罗人工抗原的制备

取25mg（0.122mmol）4-氨基-3,5-二氯苯甲酸，加入2mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，再分别加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)（半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)的摩尔比为1:1.5:2），4℃下，避光混匀，搅拌反应60min，再在室温下反应12h。取104mg（0.0015mmol）牛血清白蛋白（半抗原与牛血清白蛋白的摩尔比为80:1），加入10mL0.1M pH9.6碳酸盐缓冲液。将活化的克伦特罗半抗原溶液慢速滴加到牛血清白蛋白溶液中，室温下反应24h。用PBS缓冲液透析2天，期间更换PBS缓冲液4次，即得到克伦特罗人工抗原。

实施例2、克伦特罗人工抗原的制备

取25mg（0.122mmol）4-氨基-3,5-二氯苯甲酸，加入2mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，0℃预冷30min。0℃下，分别加入三正丁胺,氯甲酸异丁酯（半抗原、三正丁胺、氯甲酸异丁酯的摩尔比为1:1.2:1.2）,0℃反应1h。取104mg（0.0015mmol）牛血清白蛋白（半抗原与牛血清白蛋白的摩尔比为80:1），加入10mL0.1M pH9.6碳酸盐缓冲液，0℃预冷30min。在0℃条件下，将活化的半抗原溶液慢速滴加到牛血清白蛋白溶液中，0℃条件下反应1h，然后室温下反应24h。用PBS缓冲液透析2天，期间更换PBS缓冲液4次，即得到克伦特罗人工抗原。

实施例3、克伦特罗抗血清的制备

以实施例1制得的克伦特罗人工抗原为免疫原，选用6-8周龄，雌性BALB/C小鼠为免疫动物，采用弗氏佐剂进行免疫，免疫小鼠5只。弗氏佐剂免疫方法为：首免取适量免疫原与等体积弗氏完全佐剂混合，乳化好后经颈背部皮下多点注射免疫，每间隔3周加强免疫一次。

实施例4、克伦特罗抗血清的测定

一、采用间接ELISA方法检测血清效价，具体操作步骤如下：

1、包被：将实施例1中的克伦特罗人工抗原用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液从10μg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h。

2、洗涤：将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液洗涤3次，每次3min。

3、封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用。

4、加样：将实施例3所得克伦特罗抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应1h；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应1h。

5、显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min。

6、终止和测定：每孔加入100μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD₄₅₀值。

7、结果判读：以OD₄₅₀值大于或等于阴性对照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。

二、最低检测限、半数抑制以及特异性的检测

具体操作步骤如下：

1、用上述的间接ELISA方阵滴定法确定包被原和抗体的工作浓度，以OD₄₅₀值在1.5左右时所对应的抗原和抗体浓度为最适工作浓度。

2、包被：将包被原用包被缓冲液稀释至最适工作浓度，100μL/孔，37℃反应2h。

3、洗涤和封闭：方法操作同上述间接ELISA法。

4、配制克伦特罗标准溶液：将克伦特罗标准品用0.01mol/L，pH7.4的PBS溶液配制成1mg/mL的母液，然后，在加样前，再用0.01mol/L，pH7.4的PBS溶液倍比稀释成需要浓度。

5、加样：每孔加入50μL倍比稀释的克伦特罗各浓度标准品，然后再加入50μL/孔最适稀释倍数的抗血清，37℃反应1h。充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应1h。

6、显色反应：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min。

7、终止和测定：每孔加入100μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD₄₅₀值。

8、数据处理：以克伦特罗各浓度的对数为横坐标，以克伦特罗各浓度对应的OD值为纵坐标，绘制标准曲线，计算半数抑制浓度（IC₅₀，即OD₄₅₀值从零标准溶液对应的A0下降到50%时所对应的标准品浓度），从而判定抗血清对克伦特罗是否具有特异性。

9、将克伦特罗的标准品换成莱克多巴胺、马步特罗、沙丁胺醇按上述方法测定IC₅₀值，并计算交叉反应率。

交叉反应率（%）=IC₅₀（克伦特罗）/IC₅₀（类似物）

实验设3次重复，结果取平均值。

结果显示，四免后，小鼠抗血清效价可达32000，检测限为1ng/mL，克伦特罗IC₅₀为10ng/mL，各类似物的交叉反应率均小于0.1。

Claims

1.一种特异性克伦特罗人工抗原的合成方法，其特征在于以4-氨基-3,5-二氯苯甲酸为半抗原，将4-氨基-3,5-二氯苯甲酸上的羧基通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC与N-羟基琥珀酰亚胺NHS活化、或者通过三正丁胺与氯甲酸异丁酯活化，再与载体蛋白进行偶联得到克伦特罗人工抗原，将人工抗原透析，工艺为：

（A）将4-氨基-3,5-二氯苯甲酸用N,N-二甲基甲酰胺DMF溶解，4-氨基-3,5-二氯苯甲酸与N-羟基琥珀酰亚胺NHS，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC的摩尔比为1:1.5:2，在4℃避光搅拌反应1h，再在室温反应12h，得活化的半抗原溶液；

取牛血清白蛋白，半抗原与牛血清白蛋白的摩尔比为80:1，牛血清白蛋白用0.1M pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，其中溶解后的牛血清白蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与N,N-二甲基甲酰胺DMF的体积比例为5:1；将活化的半抗原溶液慢速滴加到牛血清白蛋白溶液中，室温反应24h，用PBS缓冲液透析2天，期间更换PBS缓冲液4次，得到克伦特罗人工抗原；

或（B）将4-氨基-3,5-二氯苯甲酸用N,N-二甲基甲酰胺DMF溶解，4-氨基-3,5-二氯苯甲酸与三正丁胺，氯甲酸异丁酯的摩尔比为1:1.2:1.2，0℃反应1h，得活化的半抗原溶液；

2.根据权利要求1所述的特异性克伦特罗人工抗原的合成方法，其特征在于，所述载体蛋白为：牛血清白蛋白BSA、阳离子化的牛血清白蛋白cBSA、匙孔血蓝蛋白KLH、血蓝蛋白LPH、鸡卵清白蛋白OVA、人血清白蛋白HSA之一种。

3.根据权利要求1所述的特异性克伦特罗人工抗原的合成方法，其特征在于克伦特罗人工抗原的分子结构式如式I所示：

式I。

4.用权利要求1所述方法合成的特异性克伦特罗人工抗原的应用，其特征在于制备克伦特罗抗体，所述抗体为多克隆抗体和/或单克隆抗体。

5.用权利要求1所述方法合成的特异性克伦特罗人工抗原的应用，其特征在于在检测克伦特罗中的应用，检测食品中的克伦特罗残留。