CN103153092B - 天然增味剂和用于制备它的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从葱属植物中获得的某些增味化合物的用途。在一个实施例中，来自细香葱，韭菜，阔叶葱和其它洋葱的种子用于为食品产品传递浓浓的淳厚味的增味效果，而不会带来洋葱或大蒜类的异味。这些增味化合物还用于阿马道里产物的制备，这些产物还作为淳厚味的增味化合物。

Description

天然增味剂和用于制备它的方法
发明背景
技术领域
本发明涉及增味剂的提取，该增味剂为食品提供了淳厚味的感觉。具体地，本发明涉及从一种或多种可食用的植物中提取的特定的肽以及它们作为增味剂的用途。
背景技术
食品工业通常认可五种基本的味道：甜味，咸味，酸味，苦味和鲜味（最近，早在20世纪90年代），鲜味提供“肉汤”，“肉”或“可口的”味道，并且通常与谷氨酸钠（MSG）以及MSG类的味道有关。另一方面，用于食品工业中的术语“淳厚味（kokumi）”是指增强风味的感觉，例如持久味道的开发（口感，连续性，持续时间和厚度）；碰撞感（涉及最初的味道和效果）；和完整度（roundness）以及平衡感（浓烈，浓度，蔓延和一致）。淳厚味的感觉是明显的增味的感觉，它不能由五种基本味道中的任何一种单独地表达。例如，在此使用的术语“味道”和“风味”描述不同的特点，虽然它们可能是称赞的。味道包括五种基本的味道之一的察觉。另一方面，风味是一种或多种味道和/或同时经历的感觉的结合。具体地，风味包括味道和气味，并且还能够包括例如视觉和期望等的感觉。因此，当增强并扩大（或增加）基本的味道以及与该基本的味道有关的味道和感觉时，获得淳厚味的增味的感觉或效果，与该基本的味道有关的味道和感觉包括但不限于香味，食品质地，持久味道的开发，平衡感和碰撞感。
已经进行了一些尝试以产生淳厚味的感觉。这些不同的尝试已经显示出各种含硫氨基酸，肽和γ-谷氨酰肽通常它们本身是没有味道的，但是当它们被添加到不同味道（例如MSG，核苷酸溶液（包括核苷5’-肌苷酸（IMP）和5’-鸟苷酸（GMP））或牛肉提取物）中时提供了淳厚味的感觉或效果。具体地，一些从洋葱（Allium cepa）和大蒜（AlliumsativumL.）中分离的有机硫化合物当与可口的组合物或食品产品组合时已经显示出增味的感觉。但是，目前已知的增味剂不能充分地满足中性的味道并且不是非常有效的。现在技术的方法通常专注于从这些植物的叶子中分离的化合物，从这些植物的叶子中分离的化合物往往添加了它们本身的风味。
因此，需要能够增加风味而不会添加它们本身风味的淳厚味的化合物。还需要使用天然提取物的，更加有力的且有效的淳厚味的化合物。具体地，需要淳厚味的化合物，该化合物利用其它的，通常被忽视的，可食用的植物的一部分的潜在的风味内容物，还需要用于从其它的可食用的植物中提取并纯化增味化合物的方法，以制备具有增加的淳厚味感觉的食品。
发明内容
本发明提供了增味化合物，当它被添加到一种或多种诱导组合物或含有谷氨酸盐和/或核酸的食品产品时，它能够提供淳厚味的感觉或效果，下面将进一步描述。因此，在此使用的“增味化合物”是指在此描述的任何一种γ-L-谷氨酰化合物和阿马道里产物或生物学可接受的它们的盐，它们能够产生淳厚味的增味的感觉或效果，并且该术语能够与术语“增味剂”，“风味化合物”，“淳厚味的化合物”，“淳厚味的肽”或“肽”交替使用。
第一方面，本发明的增味剂通过从葱科（Alliaceae）家族中提取的一些化合物制备，葱科家族包括但不限于细香葱（Allium schoenoprasum），阔叶葱（Allium ursinum），韭菜（Allium ampeloprasum var.porrum(L.)）和其它的洋葱以及这些可食用的植物的种子。由通式（a）和（b）表示的化合物从未用于提供淳厚味的增味的感觉。
其中，R1和R2各自独立地选自由-CH3，-CH2CH3，-CH=CH2，-C≡CH，-CH2CH2CH3，-CH=CHCH3，-CH2CH=CH2组成的组中；
R3是γ-谷氨酰基团或它的盐；并且
R4选自H或O，假设当R4选择O时，R4和O之间的键是双键。
其中，R1和R2各自独立地选自由—CH3，—CH2CH3，—CH=CH2，—C≡CH，—CH2CH2CH3，—CH=CHCH3，—CH2CH=CH2组成的组中；并且
R3是γ-谷氨酰基团或它的盐。
感官试验显示根据通式（a）和（b）表示的化合物是增味化合物，当它们被添加到下面定义的不同的诱导组合物时，它们能够提供浓浓的淳厚味的感觉。具体地，在从种子中提取的γ-L-谷氨酰肽中，由下面的通式（I）表示的三肽，γ-L-glu-(E)-S-(丙烯-1-基)-L-cys-(E)-S-(丙烯-1-基)-L-cys-(+/-)-SO[γ-L-Glu-L-Cys-L-Cys-(+/-)-SO]被鉴定，分离并纯化，并且它令人惊讶地显示出浓浓的淳厚味的感觉。
此外，由下面的通式（II）表示的四肽，γ-L-谷氨酰基-(E)-S-1-丙烯基-L-半胱氨酰基-γ-L-谷氨酰基-(E)-S-1-丙烯基-L-半胱氨酸[γ-L-Glu-L-Cys-γ-L-Glu-L-Cys]被鉴定，分离并纯化。使用标准缩写描述本发明的氨基酸残基。
第二方面，本发明涉及通过将从葱属植物中提取的风味化合物与还原糖进行梅拉德反应获得的增味化合物。随后，该反应产物用于提供淳厚味的增味的感觉。可以本领域已知的任何方法进行提取和纯化步骤。例如，在试验中，用水，乙醇或乙醇/水的混合物进行提取。随后，提取物通过冷冻干燥被浓缩并通过反相色谱被进一步浓缩。
对该增味化合物进行的感官评价的感官试验显示该分离的风味化合物在水溶液的形式中基本是没有味道的，但是即使当它被少量添加到下面还要被描述的某些诱导组合物或含有谷氨酸盐和/或核酸的食品产品时，对于提供增强的效果都是有用的。虽然有效量将在个体中变化，但是当使用鸡汤作为基质时，通常高于阙值的2-100倍是足够的。在此提供的阙值反映出鸡汤作为基质使用的最低数量；但是，本领域的技术人员根据这一公开内容将意识到这一数量能够根据使用的基质和需要的淳厚味效果的强度被稍高或稍低地调节。通常，一定数量的盐也是必须的以实现淳厚味的效果；通常，在几乎全部食品产品中发现大约12mmol/L的盐。该化合物能够被应用于不同种类的食品中，包括但不限于零食，汤，谷类，酱汁，鱼和鱼酱。
当考虑与附图的结合时，本发明的其它方面，实施例和特征将从下面的本发明的详细说明中变得清楚。出于清楚的目的，不是每个元件都被标记在每张附图中。为了使本领域的技术人员理解本发明，在附图中显示本发明的每个实施例的每个元件不是必须的。
附图说明
作为本发明特征的新颖性特征列在所附的权利要求中。然而，本发明本身以及优选的使用方式，其它的目的和其优点将通过参考下面的说明性实施例的详细说明并结合附图被更好的理解，其中：
图1描述了根据通式（I）的三肽的g-COSY-NMR-光谱。
图2显示了使用羧肽酶A的根据通式（I）的三肽的酶促降解。
图3描述了根据通式（II）的四肽和它的1H-NMR-光谱。
图4显示了使用γ-谷氨酰转肽酶的根据通式（II）的四肽的酶促降解。
图5描述了根据通式（II）的四肽的15N-HMBC光谱。
图6描述了N-(1-脱氧-D-果糖-1-基)-γ-L-谷氨酰基-(E)-S-1-丙烯基-L-半胱氨酸的1H NMR光谱。
图7描述了N-(1-脱氧-D-果糖-1-基)-S-烯丙基-L-半胱氨酸(MeOD，400MHz)的(A)DEPT-135光谱和(B)13C NMR光谱。
图8显示了γ-L-谷氨酰基-S-反式-(丙烯-1-基)-L-半胱氨酸的阿马道里产物的结构。
图9显示了S-烯丙基-L-半胱氨酸的阿马道里产物的结构。
图10显示了分离的三肽的阿马道里产物的结构。
具体实施例
为了产生风味化合物并实现本发明的方法，首先选择并制备葱属植物。能够使用的适合的植物例如，包括但不限于细香葱（Allium schoenoprasum），大蒜（Alliumsativum），西伯利亚葱（Allium sibiricum），阔叶葱（Allium ursinum），韭菜（Alliumampeloprasum），韭葱（Allium porrum）和洋葱（Allium cepa）。通过现有技术已知的方法破坏或粉碎原料。在一个实施例中，葱科的种子作为起始原料；具体地，起始原料是细香葱，阔叶葱或韭菜的种子。已经发现从葱科家族的种子中获得的提取物提供了有效的风味的增加，而不会带来葱科家族的浓浓的“洋葱臭味的”味道特性。在制备葱属植物泥之后，一种或多种化合物被分离并被纯化。将一种或多种纯化的化合物与至少一种诱导组合物混合以产生需要的淳厚味的效果。为了本发明的目的，适合的“诱导组合物”是指含有谷氨酸盐和/或核酸的至少一种物质，食品或溶液，包括但不限于MSG，核糖核苷酸（包括但不限于肌苷酸盐，鸟苷酸和例如5’-肌苷酸（IMP）和5’-鸟苷酸（GMP）的核苷酸），肉类，家禽，海鲜，蔬菜，牛肉提取物，酵母提取物，大豆提取物，海藻，牛肉，猪肉，鸡肉，西红柿，蘑菇，黄豆，土豆，玉米，红薯，胡萝卜，干酪，绿茶和与MSG或盐有关的任何其它的味道。
本发明的第一方面通常涉及从葱属植物的种子提取的增味的γ-谷氨酰肽以及它们作为增味化合物的用途。本发明的增味化合物能够为一种或多种基本的味道（甜味，咸味，酸味，苦味和鲜味）提供淳厚味的增味的感觉，只要至少一种诱导组合物存在。在一个实施例中，本方法涉及半胱氨酸衍生物和它们的硫氧化物。在另一个实施例中，本方法涉及二肽，其中氨基酸包括谷氨酸和半胱氨酸或它的衍生物。在另一个实施例中，本方法涉及三肽和它们的衍生物，其中第一个氨基酸是谷氨酸，第二个氨基酸是半胱氨酸并且第三个氨基酸选自由甘氨酸，半胱氨酸和谷氨酸组成的组中。在另一个实施例中，本方法涉及包括两个谷氨酸基团和两个半胱氨酰基团的四肽。下面将进一步描述具体的肽。本发明的第二方面通常涉及根据上述第一方面的增味化合物的梅拉德反应产物以及它们作为增味化合物的用途。
更具体地，第一方面，由通式（a）和（b）表示的化合物从未用于提供淳厚味的增味的感觉。
其中，R1和R2各自独立地选自由-CH3，-CH2CH3，-CH=CH2，-C≡CH，-CH2CH2CH3，-CH=CHCH3，-CH2CH=CH2组成的组中；
R3是L-γ-谷氨酰基团或它的盐；并且
R4选自H或O，假设当R4选择O时，R4和O之间的键是双键。
其中，R1和R2各自独立地选自由—CH3，—CH2CH3，—CH=CH2，—C≡CH，—CH2CH2CH3，—CH=CHCH3，—CH2CH=CH2组成的组中；并且
R3是γ-谷氨酰基团或它的盐。
通式（a）或（b）的化合物能够以所示的形式或具有反离子或不具有反离子的它的离子形式存在，例如它的钠盐，钾盐，钙盐，铵盐，氯化物，硫酸盐，磷酸盐，碳酸盐等。此外，通式（a）或（b）的化合物能够以所示的还原形式或它的氧化形式存在。氨基酸残基是L-氨基酸。硫氧化物的结构是S或R。在本发明的一个方面，能够使用通式（a）或（b）的一种或多种化合物，或它们的混合物以提供增加的风味。
具体地，在本发明的从种子中提取的增味化合物中，由下面的通式（I）表示的三肽，γ-L-glu-(E)-S-(丙烯-1-基)-L-cys-(E)-S-(丙烯-1-基)-L-cys-(+/-)-SO[γ-L-Glu-L-Cys-L-Cys-(+/-)-SO]被分离并纯化。通常，显示硫氧化物以证实与它们对应的非硫氧化物稍低的淳厚味的效果。但是，根据通式（I）的三肽显示了令人惊讶地高度有效的淳厚味的效果，当以大约18mg/L或40μmol/L很小的数量添加时能够提供淳厚味的感觉。
此外，由下面的通式（II）表示的四肽，γ-L-谷氨酰基-(E)-S-1-丙烯基-L-半胱氨酰基-γ-L-谷氨酰基-(E)-S-1-丙烯基-L-半胱氨酸[γ-L-Glu-L-Cys-γ-L-Glu-L-Cys]被分离并纯化，并且当以大约56mg/L或100μmol/L很小的数量添加时显示出它作为增味化合物是有用的。
通式（I）和（II）的充分纯化的化合物在感官试验中进行说明，感官试验的结果下面进一步被讨论，当它们被添加到在此定义的各种诱导组合物或食品中时，提供了浓浓的增味的感觉。此外，由于在本发明的化合物（I）和（II）的结构中存在不对称的碳原子，它们还能够出现一些构型异构体的形式，这些异构体中的任何一种或它们的混合物也能够满意地用于为食品提供淳厚味的效果。通常，适于本发明的异构体包括氨基酸序列的变化，氨基酸的手性中心结构的变化，顺式/反式键合的变化以及从1-丙烯基到2-丙烯基（烯丙基）键合的变化。此外，不饱和脂肪烃基团是[E]，[Z]或烯丙基结构。在一些实施例中，顺式键合能够提供更浓的淳厚味的感觉。
本发明的增味化合物通过现有技术中已知的任何方法被分离，这些方法包括但不限于各种已知的色谱技术，例如，标准的高效液相色谱法（HPLC），反相高效液相色谱法（RP-HPLC），离子交换色谱法，凝胶过滤色谱法，亲和色谱法，固相萃取法（SPE），凝胶渗透色谱法（GPC），超滤法（UF）和快速离心分配色谱法（FCPC）。浓缩步骤包括但不限于冷冻干燥，膜浓缩和真空浓缩。能够获得含有本发明的γ-L-谷氨酰肽的粉状的调味品，该调味品具有优良的储存稳定性而不需要通过喷雾干燥或真空冷冻干燥添加的食盐。能够使用的溶剂是本领域的技术人员已知的，并且包括但不限于任何食品级溶剂，例如水，乙醇，甲醇和/或它们的任何混合物。
通过举例的方式，在试验中，100g的细香葱种子悬浮于500ml的纯净水（例如，来自公司），乙醇，或1：1的水/乙醇溶液中。种子被粉碎并分散于高剪切混合机（ULTRA(IKA)）中大约10分钟。随后，粉碎的种子用上述的每种溶剂提取大约2小时。通过虹吸液体获得提取液（滤出液）并且再次用上述的该溶剂和数量提取获得的残渣（滤饼）。提取和过滤步骤重复四次，并且合并获得的滤出液。在使用乙醇或水/乙醇混合物的情况，40℃真空蒸发有机溶剂并且剩余的水部分被冷冻干燥，产生大约20g（重量比20%）。当用乙醇提取时，提取物是稍微呈棕色的粉末。甲醇提取物也产生了稍微呈棕色的粉末。通过HPLC分析，两种提取物还产生了几乎一样的结构和峰型。
为了去除例如氨基酸，有机酸，糖和碳水化合物，多羟基化合物（糖醇）的极性化合物，并浓缩和富集需要的目标化合物，使用一些纯化技术；包括但不限于RP-HPLC，MPLC，SPE，液相色谱法，亲和色谱法，离子交换色谱法和超滤法。例如，使用下面将描述的方法纯化本发明的产品：（i）具有RP-柱体的固相萃取法（SPE）（例如来自的Giga管）；（ii）具有填充（RP-材料）的玻璃柱的制备型RP柱色谱法；和（iii）制备型RP中压柱色谱法。
（i）固相萃取法
使用固相萃取法(SPE)去除极性化合物并提高纯度。一份（每份1g）提取物被溶解于10mL的纯净水中并且随后被施加于用乙醇，随后用水预处理过的柱Strata C-18-E(10g/60mL，Giga管，55μm，70A，的C18树脂中。通过用水（30mL，S1部分），随后用乙醇/水（1/1，v/v；30mL；S2部分），再随后用乙醇（30mL；S3部分）冲洗该柱进行分离。收集的S2-S3部分在真空中浓缩，并冷冻干燥两次。水部分可被丢弃。
（ii）填充（RP-材料）的玻璃柱
一份（1g-5g）提取物被溶解于大约5mL到10mL的纯净水中并且随后在相同的溶剂混合物中被施加于用(25-40μm粒径)的RP-18材料填充的水冷式玻璃柱（40x140mm）中。通过使用蚁酸水溶液（水中0.1%；pH值2.5，200mL）或纯净水，随后通过使用相同的蚁酸溶液或含有高达100%的增加数量的乙醇的纯净水进行色谱法。流出物被收集于细分馏份中，随后在真空中浓缩，并冷冻干燥两次。水部分可被丢弃。细分馏份能够被单独使用或被合并成一种去除了极性化合物的提取物。以2-3mL/分的流速进行色谱法并在220nm的波长进行记录。
（iii）制备型RP中压柱色谱法
一份（1g-4g）提取物被溶解于大约5mL到大约50mL的纯净水中。一份大约5mL到大约20mL被注入到制备型色谱系统中。在相同的溶剂混合物中，PP柱体（柱）（40x150mm）用(25-40μm粒径)的RP-18材料的浆液填充。通过使用pH值2.5的大约200mL的蚁酸水溶液（水中0.1%）或纯净水，随后通过使用相同的蚁酸溶液或含有高达100%的增加数量的乙醇的纯净水进行色谱法。流出物被收集于细分馏份中。收集的细分馏份在真空中被浓缩，并冷冻干燥两次。水部分可被丢弃。细分馏份能够被单独使用或被合并成一种去除了极性化合物的提取物。以50mL/分的流速进行色谱法并在220nm的波长进行记录。
纯化之后，在此描述的风味化合物使用多反应监测（MRM）-触发MS/MS扫描进行鉴定。还使用结合的HPLC和电喷雾质谱（LC-ESI-MS）分析用于鉴定本发明的肽。下面进一步详细说明根据通式（I）和（II）的化合物的结构。除非另有说明或指明，下面关于鉴定提供的详细内容不会限定本发明的范围。
从细香葱的种子获得的三肽γ-L-谷氨酰基-(E)-S-1-丙烯基-L-半胱氨酰基-S-1-丙烯基-L-半胱氨酸-(+/-)-SO[γ-L-Glu-L-Cys-L-Cys-(+/-)-SO]的鉴定。
图1描述了由下面的通式（I）表示的本发明的被鉴定并被纯化的三肽的梯度选定相关光谱（COSY）g-COSY-NMR-光谱，通式（I）具有γ-L-glu-反式-S-(丙烯-1-基)-L-cys-反式-S-(丙烯-1-基)-L-cys-(+/-)-SO[γ-Glu-PeC-PeC-SO]的名称。
如图1中所描述的，根据通式（I）的化合物显示出的典型的UV/V对于S-烯基半胱氨酸（S-alkenylcysteines）是预期的吸收峰，并且显示准分子离子[M-H]-离子具有m/z448，以及在MS-ESI-光谱中碎片离子是m/z 128，314和240。高分辨率的LC-MS（ESI-）分析证实了该化合物具有C17H27N3O7S2的分子式。从1H NMR看，能够辨别出五个离散的自旋系统（discrete spin system）。每个自旋系统中的质子序列通过图1的g-COSY光谱中的信号互串的级数被说明。
这个化合物的全部质子共振与来自1H-13C异核单量子相干（gHSQC）光谱（heteronuclear single quantum coherence(gHSQC)spectrum）的有关碳原子明确地关联，同时，使用来自异核多键相关光谱（g-HMBC）试验（heteronuclear multiplebond correlation spectroscopy(g-HMBC)）的数据互相连接部分结构。因此，dd相应于1.76ppm，耦合到质子H-C(9)和H-C(10)的质子H-C(11)，质子H-C(9)和H-C(10)互相耦合。双键异构体是基于J=14.8Hz的耦合常数的E。第二个自旋系统与已经描述的自旋系统非常相似，不同之处在于全部信号清楚地前冲转移（downfield shifted）（质子6’，4’和5’）。此外，双键异构体是基于J=15.2Hz的耦合常数的E。2.97H-C(8α)(dd，8.4，14.4Hz)和3.17H-C(8β)(dd，5.2，13.2Hz)的质子共振位于一部分ABX自旋系统中，它们用4.58ppm的质子H-C(6)(dd，5.2，8.4Hz)完善并被转移到半胱氨酸的亚甲基团。这一ABX自旋系统能够被观察两次，显示了第四个离散的自旋系统，其中与3.37ppm的H-C(3’α)和3.49ppm的（H-C(3’β)）的亚甲基团的dd相比再次清楚地显示出前冲转移。这些数值是全部S取代型半胱氨酸硫氧化物衍生物的典型特征。第五个自旋系统显示出具有2.19ppm的化学位移的亚甲基团和2.55ppm的亚甲基团之间的耦合以及3.84ppm的质子，这对于N-末端谷氨酸单体是预期的。对于全部的质子的在g-COSY试验中的化学位移，强度，耦合常数和观察到的信号互串在下面的表1中被总结。
表1：γ-L-谷氨酰基-S-反式-(丙烯-1-基)-L-半胱氨酰基-(+/-)-S-反式-(丙烯-1-基)-L-半胱氨酸硫氧化物(400MHz，D2O)的1H-NMR信号的解析（Assignment）
a涉及图1结构的碳原子的任意编号。
b与TMSP有关的1H化学位移。
c从ID-光谱确定的。
d通过g-COSY试验观察到的共核1H，1H的连接性（connectivitie）。
显示17个信号的13C NMR光谱与显示13个信号的极化转移（DEPT-135）试验获得的失真增强（Distortionless Enhancement）以及g-HSQC试验的结果对照，显示出对应于季碳原子的四个信号。这些季碳原子和氢取代的碳原子的明确解析分别能够成功地通过对2JC，H和3JC，H耦合常数优化的HMBC和对1JC，H耦合常数优化的HSQC实现。此外，HMBC试验显示出质子H-C(2’，6，8)和邻近的碳原子C（7）之间以及质子H-C（3，4，6）和邻近的碳原子C（5）之间的相关性，因此明确地显示出两个半胱氨酰和γ-谷氨酰单体的分子内键合（intramolecular linkage）。通过1J(C，H)和2，3J(C，H)的化学位移和异核核糖核酸1H，13C的连接性在下面的表2中对全部的碳原子进行了总结。
表2：γ-L-谷氨酰基-S-反式-(丙烯-1-基)-L-半胱氨酰基-(+/-)-S-反式-(丙烯-1-基)-L-半胱氨酸硫氧化物(400MHz，D2O)的13C-NMR信号的解析
a涉及图1结构的碳原子的任意编号。
b与TMSP有关的13C化学位移。
cDEPT-135光谱和g-HSQC。
d基于HSQC(1J)和HMBC(2，3J)试验的解析。
为了证实根据通式（I）的化合物的结构，更加明确该三肽的分子内键合，以及氨基酸的结构，用羧肽酶A和γ-谷氨酰转肽酶进行酶促降解。如果氨基酸是L-形的，羧肽酶A仅仅水解α-肽键。如图2描述的，该三肽的C-末端能够被证实为S-反式-（丙烯-1-基）-L-半胱氨酸硫氧化物，因为在用这种酶处理25小时之后，能够清楚地通过HPLC并用参考化合物使用共同色谱分析法确定两种预期的降解产物，即二肽γ-L-谷氨酰基-S-反式-(丙烯-1-基)-L-半胱氨酸和S-反式-(丙烯-1-基)-L-半胱氨酸硫氧化物。此外，用γ-谷氨酰转肽酶进行的酶促降解显示了L-谷氨酸预期的释放，并且当反应时间被延长到两个相应的氨基酸时，该二肽S-反式-(丙烯-1-基)-L-半胱氨酰基-(+/-)-S-反式-(丙烯-1-基)-L-半胱氨酸硫氧化物发生分解，这能够通过HPLC并用参考化合物使用共同色谱分析法清楚地确定。
分离的γ-谷氨酰三肽在结构上是唯一的，因为它含有还原型和氧化型的S-（丙烯-1-基）-L-半胱氨酸。该还原型通过γ-肽键与L-谷氨酸连接，并且该氧化型通过α-肽键与还原的丙烯基半胱氨酸连接。
从细香葱的种子中获得的四肽γ-L-谷氨酰基-(E)-S-（丙烯-1-基）-L-半胱氨酰基-α-L-谷氨酰基-γ-(E)-S-（丙烯-1-基）-L-半胱氨酸的鉴定。
图3描述了由下面的通式（II）表示的本发明的被鉴定并被纯化的四肽的1H NMR光谱，通式（II）具有γ-L-谷氨酰基-(E)-S-1-烯丙基-L-半胱氨酰基-γ-L-谷氨酰基-(E)-S-1-烯丙基-L-半胱氨酸[γ-Glu-PeC-γ-Glu-PeC]的名称。
图3显示了根据通式（II）的化合物显示出的典型的UV/V对于S-烯基半胱氨酸是预期的吸收峰，并且显示准分子离子[M-H]-离子具有m/z561，以及在MS-ESI-谱中碎片离子是m/z128。高分辨率的LC-MS（ESI-）分析证实了该化合物具有C22H34N4O9S2的分子式。从图3的1H NMR看，能够辨别出六个离散的自旋系统，其中三个自旋系统以非常相似的方式产生。每个自旋系统中的质子序列通过g-COSY光谱中的信号互串的级数被说明。
这个化合物的全部质子共振与来自g-HSQC光谱的有关碳原子明确地关联，同时，使用来自g-HMBC试验的数据互相连接部分结构。因此，dd具有六个相应于1.73ppm，耦合到质子H-C(9/9’)和H-C(10/10’)的质子H-C(11)和H-C(11’)的强度，质子H-C(9/9’)和H-C(10/10’)互相耦合。双键异构体是基于J=14.8Hz的耦合常数的E。2.97H-C(8α’)(dd，1.6，14.4Hz)，2.99H-C（8α）（dd，1.6，14.4Hz）和3.14H-C(8β’)(dd，5.2，14.4Hz)以及3.19H-C(8β)(dd，4.4，14.4Hz)的质子共振位于两个ABX自旋系统的一部分中，它们用4.56ppm的质子H-C(6/6’)(m，1.6，4.4，5.2，5.6Hz)完善并被转移到半胱氨酸的亚甲基团。第五个自旋系统显示出具有2.03和2.25ppm的化学位移的亚甲基团H-C(3’αβ)和2.42ppm的亚甲基团H-C（4’）的非对映异构的质子之间的耦合以及4.38ppm的双偶极H-C（2’），这对于谷氨酸单体是预期的，它通过氨基键被连接到其它的氨基酸。第六个自旋系统显示出具有2.17ppm的化学位移的亚甲基团H-C(3)和2.54ppm的亚甲基团H-C（4）之间的耦合以及3.84ppm的三线态H-C（2），这对于N-末端谷氨酸单体是预期的。对于全部的质子的在g-COSY试验中的化学位移，强度，耦合常数和观察到的信号互串在下面的表3中被总结。
表3.γ-L-谷氨酰基-(E)-S-（丙烯-1-基）-L-半胱氨酰基-α-L-谷氨酰基-γ-(E)-S-（丙烯-1-基）-L-半胱氨酸(400MHz，D2O)的1H-NMR信号的解析
  相应Ca原子处的H   δ[ppm]b   Ic   Mc   J  (Hz)c   COSYd
  11，11’   1.73   6   dd   1.2，6.4   H-C(9，9’)，H-C(10，10’)
  3’α   2.03   1   m   7.2，9.2，14.4   H-C(2’)，H-C(3’β)，H-C(4’)
  3α，3β   2.17   2   m   6.4，7.6   H-C(2)，H-C(4)
  3’β   2.25   1   m   4.8，7.6，14.0   H-C(2’)，H-C(3’α)，H-C(4’)
  4’   2.42   2   dd   7.2，7.6   H-C(2’)，H-C(3’α)，H-C(3’β)
  4   2.54   2   m   6.8，7.6，8.4   H-C(3α)，H-C(3β)
  8’α   2.97   1   dd   1.6，14.4   H-C(6’)，H-C(8’β)
  8α   2.99   1   dd   1.6，14.4   H-C(6)，H-C(8β)
  8’β   3.14   1   dd   5.2，5.6，14.4   H-C(6’)，H-C(8’α)
  8β   3.19   1   dd   4.4，14.4   H-C(6)，H-C(8α)
  2   3.84   1   t   6.4   H-C(3α，3β)
  2’   4.38   1   dd   4.8，9.2   H-C(3’α，3’β)
  6，6’   4.56   2   m   1.6，4.4，5.2，5.6   H-C(8α，8’α)，H-C(8β，8’β)
  10，10’   5.87   2   m   6.4，14.8   H-C(9，9’)，H-C(11，11’)
  9，9’   5.98   2   dd   1.2，14.8   H-C(10，10’)
a涉及图3结构的碳原子的任意编号。
b与TMSP有关的1H化学位移。
c从ID-光谱确定的。
d通过g-COSY试验观察到的共核1H，1H的连接性。
显示22个信号的13C NMR光谱与显示18个信号的DEPT-135试验以及gHSQC试验的结果对照，显示出对应于季碳原子的六个信号。这些季碳原子和氢取代的碳原子的明确解析分别能够成功地通过对2JC，H和3JC，H耦合常数优化的HMBC光谱和对1JC，H耦合常数优化的HSQC光谱实现。此外，HMBC试验显示出质子H-C(2’，6，8αβ)和邻近的碳原子C（7）之间，质子H-C（3，4，6）和邻近的碳原子C（5）之间，以及质子H-C（3’，4’，6’）和邻近的碳原子C（5’）之间的相关性，因此明确地显示出两个半胱氨酰和两个γ谷氨酰单体的分子内键合。通过1J(C，H)和2，3J(C，H)的化学位移和异核核糖核酸1H，13C连接性在下面的表4中对全部的碳原子进行了总结。
表4：γ-L-谷氨酰基-(E)-S-（丙烯-1-基）-L-半胱氨酰基-α-L-谷氨酰基-γ-(E)-S-（丙烯-1-基）-L-半胱氨酸(400MHz，D2O)的13C-NMR信号的解析
a涉及图3结构的碳原子的任意编号。
b与TMSP有关的13C化学位移。
cDEPT-135光谱和g-HSQC。
d基于HSQC(1J)和HMBC(2，3J)试验的解析。
为了证实该四肽的结构，更加明确该四肽的分子内键合，以及氨基酸的结构，用羧肽酶A和进行γ-谷氨酰转肽酶进行酶促降解。该四肽的C-末端能够被证实为S-反式-（丙烯-1-基）-L-半胱氨酸，因为在用羧肽酶A处理48小时之后，能够清楚地通过HPLC确定两种预期的降解产物，即三肽γ-L-谷氨酰基-S-反式-(丙烯-1-基)-L-半胱氨酰基-L-谷氨酸和S-反式-(丙烯-1-基)-L-半胱氨酸。
此外，如图4所示，用γ-谷氨酰转肽酶进行的酶促降解显示了L-谷氨酸和S-反式-（丙烯-1-基）-L-半胱氨酸，以及二肽S-反式-(丙烯-1-基)-L-半胱氨酰基-α-L-谷氨酸的预期的释放，并且当反应时间被延长到两个相应的氨基酸时，该二肽发生分解，这能够清楚地通过HPLC并用参考化合物使用共同色谱分析法确定。
此外，如图5所示，被鉴定过的四肽的15N-HMBC光谱显示出N-末端的氮（I）与H-C(3αβ)的预期耦合以及质子H-C(6，2’，3’αβ)与氮III的耦合。氮II和IV的信号是交迭的（不是分散的），但是显示出了与相应的质子的预期的耦合。
分离的二-γ-谷氨酰四肽在结构上是唯一的，因为它分别含有两个S-（丙烯-1-基）-L-半胱氨酸和两个L-谷氨酸。两个S-（丙烯-1-基）-L-半胱氨酸通过γ-肽键与L-谷氨酸连接并形成两个二肽γ-L-谷氨酰基-(E)-S-1-丙烯基-L-半胱氨酸，它们之间通过α-肽键互相连接。
阿马道里反应产物的生成
在本发明的构架中，还预期使用该增味化合物作为原料用于阿马道里产物的合成。因此，本发明还涉及将一种或多种分离的肽与还原糖进行梅拉德反应获得增味化合物。例如，显示γ-L-谷氨酰基-S-反式-（丙烯-1-基）-L-半胱氨酸，S-烯丙基-半胱氨酸，以及通式（a）和（b）的化合物在经过阿马道里反应之后提供了良好的淳厚味的感觉。
在此使用的术语“糖”是指多羟基醛或多羟基酮化合物，例如单糖，二糖，低聚糖和/或多聚糖。与所列的肽反应的适合的还原糖包括它们的羰基能够用于与伯氨基或仲氨基反应的任何糖，也就是说羰基不能被包含于任何的糖苷键中。例如，糖能够选自由甘油醛，赤藓糖，苏阿糖，核糖，树胶醛糖，木糖，来苏糖，阿洛糖，阿卓糖，葡萄糖，甘露糖，古洛糖，艾杜糖，半乳糖，塔罗糖，酮丁糖，核酮糖，木酮糖，阿卢糖，果糖，山梨糖，塔格糖，岩藻糖，纤维二糖，龙胆二糖，异麦芽糖，乳果糖，果糖，麦芽糖，麦芽酮糖，蜜二糖，新橙皮糖，黑曲霉糖，帕拉金糖，芸香糖，墨角藻糖基乳糖，麦芽三糖，甘露三糖，潘糖，麦芽四糖和水苏糖组成的组中。还可以使用它们的混合物。此外，可以使用这些糖的全部立体异构形式。
梅拉德反应涉及的步骤顺序通常是已知的，并且因此本领域的技术人员根据这些公开将意识到如何去产生本发明第二方面的阿马道里产物。简要地说，初始步骤涉及还原糖和伯氨基酸之间的缩合反应。从这一分子中失去水产生能够环化的亚胺，从而生成N-配糖（连接到NR基团的糖）。在N-配糖生成之后，生成肽链片段离子（immonium ion）并随后被异构化，这一反应被称为阿马道里重排并生成了阿马道里化合物。这一顺序如下表示：
通常，本发明的阿马道里产物能够通过在溶剂中回流或通过例如烘烤，煎炸产生。具有低含水量的反应介质对于产生醛糖与糖基胺（glycosyl amines）之间需要的缩合是有利的。稀水溶液或水和与水互溶的溶剂的混合物也能够用于进行阿马道里反应。虽然阿马道里重排在室温进行，它优选通过加热加速该重排。优选的温度根据使用的溶剂和反应物的浓度而定，但是该温度通常是大约40℃到大约180℃之间进行5分钟到大约2天。在大约100℃（回流），根据使用的基质，缓冲水溶液反应混合物的优选的反应时间是大约30分钟到大约10小时。例如，使用水和/或甲醇或0.1mmol/L到1mmol/L之间的KH2PO4/K2HPO4的磷酸盐缓冲液的反应时间是大约10分钟到大约10小时。在试验中，使用天然的种子，含有天然数量的糖的粗提取物，处理的提取物和一次纯化的，合成的或市售的化合物以产生用于本发明的阿马道里反应产物。半胱氨酸衍生物：糖的摩尔比例是大约1：1到大约1：10进行试验。但是，许多化合物的混合物加上一种或多种还原糖也能够用于产生本发明的增味化合物。与适合于纯化合物或提取物的条件进行对照，当使用种子时，由于外壳保护着反应对象，需要较高的温度和较长的烘烤条件。对于种子，通常使用大约150℃到大约250℃的温度范围进行反应大约3分钟到大约60分钟。
随后，阿马道里化合物能够通过包括上述关于其它的增味化合物所讨论的那些例子中的本领域已知的方法进行纯化，以获得无定形的，白色粉末形式的化合物。例如，该产物能够通过冷冻干燥，随后通过例如凝胶渗透色谱的色谱法进行纯化。能够使用例如RP-HPLC（C-18，C-8，C-4，苯基色谱柱）作为固定相并用水或0.1%的蚁酸作为流动相进行色谱法。220nm下使用UV-检测器监测流出物。该产物流出液能够通过本领域已知的分析法被证实，例如通过液相色谱法和质谱法（LC-MS）和核磁共振（NMR）光谱法。除非另有说明，否则下面讨论的鉴定不是为了限定本发明。
阿马道里反应产物的鉴定和定量分析
冷冻干燥的粉状的青葱，大蒜和细香葱的种子（每种大约500mg）在150℃被烘烤5，10，30和60分钟。冷却之后，添加15mL的甲醇水溶液（1/1，v/v）并且该甲醇水溶液被掺入甲醇水溶液（14.4mg/10mL，1/1，v/v）中的内标物溶液13C6-ARP-S-烯丙基-L-半胱氨酸和13C6-ARP-γ-L-谷氨酰基-(E)-S-1-丙烯基-L-半胱氨酸(每种100μL)，并且该混合物在试验室振动筛上均质大约30分钟。在用甲醇水溶液（2.5mL，1/1，v/v）过滤并冲洗之后，该溶液用甲醇水溶液稀释到1：10的比例并使用下面描述的条件以分析标尺（2×150mm，流速0.25mL/分）在RP柱（例如从市售的露娜苯基己基柱，5μm）
通过LC-MS/MS方法进行分析。
S-烯丙基-L-半胱氨酸和γ-L-谷氨酰基-（E）-S-1-丙烯基-L-半胱氨酸在D-葡萄糖（1：1或1：2；摩尔比例）中被混合，悬浮于水（1mL）中，随后在敞口瓶（open vial）中50℃下干燥30分钟，并且最后150℃下烘烤5，10，30和60分钟。该混合物用甲醇/水混合物定容（1：1，v/v；10mL）并且该混合物被掺入甲醇水溶液（14.4mg/10mL，1/1，v/v）中的内标物溶液13C6-ARP(100μL)并且该混合物在试验室振动筛上均质大约30分钟。在用甲醇水溶液（2x2.5mL，1/1，v/v）过滤并冲洗之后，该溶液用甲醇水溶液稀释到1：10的比例并使用下面描述的条件以分析标尺（2x150mm，0.25mL/分的流速）在RP柱（露娜苯基己基柱，5μm）通过LC-MS/MS方法进行分析。
13C-标记的标准物质和分析物以从0.1到10的摩尔比例被混合成5个摩尔比例。在LC-MS/MS分析之后，通过使用线性回归相对每种分析物与内标物的浓度比例绘制分析物与内标物的峰面积比例来制备校准曲线。获得的等式用于分析物浓度的计算。
对于（LC/MS）-ESI-MS/MS，ESI质量和产物离子光谱在API 4000质谱仪（德国，Darmstadt，Applied Biosystems公司）上使用直接流量输液（direct flow infusion）获得。对于ESI，在负离子模式设定-4500V的离子喷雾电压并在正离子模式设定+5500V的离子喷雾电压。氮气作为气帘气（20psi），根据化合物值（compound value）设定去簇电压加速从大气压力到高真空的气流，它们在下表中被总结。该质谱仪以监测正离子或负离子的全扫描模式工作。MS/MS参数取决于物质，在用氮气作为碰撞气体（4x10-5托）进行碰撞之后监测[M-H]–或[M+H]–分子态离子变成特定产物离子的分裂。碰撞能量如下。
对于HPLC-ESI-MS/MS分析，灵敏的1200系列HPLC被连接到质谱仪。使用1.42分析家软件（Applied Biosystems公司）进行数据采集。使用线性二元梯度进行色谱分离。进样体积是5μL，流速是250μL/分。对于HPLC-MS/MS，以多反应监测（MRM）模式运行质谱仪，根据下面描述的负离子或正离子方法监测。作为雾化气（45psi）的零点气（zero-grade air）在425℃下被加热，作为溶剂干燥（55psi）的加热气（turbo gas）。阿马道里反应产物在正电喷雾电离（positive electrospray ionization）（ESI+）中被检测。
蚁酸（0.1%，pH值2.5）水溶液和甲醇（0.1%的蚁酸）水溶液的混合物（95/5，v/v）保持5分钟，甲醇内含物在15分钟内被增加到100%，并且最后被保持于100%10分钟。流速被设定到250μL/分。通过多反应监测（MRM+）模式，在露娜苯基己基柱（5μm，Phenomenex）分别使用对于111ms的持续时间监控的下面表5中的转换反应（transitionreaction）分析阿马道里反应产物。
表5.多个单独的阿马道里反应产物的去簇电压（DP），入口电压（EP），
碰撞能量（CE）和碰撞出口电压（CXP）。
  m/z   m/z   DP(V)   EP(V)   CE(V)   CXP(V)
  13C6-ARP-γ-Glu-Pec   459.2→   374.2   61   10   25   14
  13C6-ARP-γ-Glu-Pec   459.2→   144.9   61   10   45   12
  ARP-γ-Glu-Pec   453.2→   369.2   56   10   23   14
  ARP-γ-Glu-Pec   453.2→   145.0   56   10   43   10
  13C6-ARP-S-烯丙基-cys   330.1→   145.0   46   10   29   12
  13C6-ARP-S-烯丙基-cys   330.1→   73.0   46   10   45   4
  ARP-S-烯丙基-cys   324.1→   145.0   46   10   27   14
  ARP-S-烯丙基-cys   324.1→   73.0   46   10   37   4
阿马道里反应产物的合成和分析例子：N-(1-脱氧-D-果糖-1-基)-S-烯丙基-L-半胱氨酸和N-(1-脱氧-D-果糖-1-基)-γ-L-谷氨酰基-(E)-S-1-丙烯基-L-半胱氨酸
S-烯丙基-半胱氨酸（3.1mmol）和D-葡萄糖（6.2mmol）悬浮于甲醇和异丙醇的混合物（3/1，v/v，300mL）中。随着搅拌，该悬浮液在100℃下回流大约10小时。相似地，γ-L-谷氨酰基-(E)-S-1-丙烯基-L-半胱氨酸（1.7mmol）和D-葡萄糖（16.6mmol）悬浮于甲醇和异丙醇的混合物（3/1，v/v，300mL）中，并且随着搅拌，该悬浮液在100℃下回流大约10小时。以相似的方式获得13C标记的阿马道里反应产物。将该反应混合物冷却到室温之后，真空干燥将体积减少。在通过RP-18色谱柱的纯化，并冷冻干燥之后，获得了纯度大于98%的白色粉末的目标化合物。以20mL/分的流速使用Thermo HypersilC-18柱（250x21.1mm；220nm）。流动相是0.1%的HCOOH（A）和ACN（B），用ACN 冲洗柱。对于ARP-S-烯丙基-半胱氨酸，洗脱条件是用A洗脱15分钟。对于γ-L-谷氨酰基-S-反式-（丙烯-1-基）-L-半胱氨酸（γ-Glu-反式-PeC），用A洗脱3分钟，20分钟内到18%的B。
图6和图7分别显示了N-(1-脱氧-D-果糖-1-基)-γ-L-谷氨酰基-(E)-S-1-丙烯基-L-半胱氨酸和N-(1-脱氧-D-果糖-1-基)-S-烯丙基-L-半胱氨酸化合物的1H和13C NMR光谱。通过1H和13C-NMR光谱法检测出了N-(1-脱氧-D-果糖-1-基)-γ-L-谷氨酰基-(E)-S-1-丙烯基-L-半胱氨酸的两种异构体，但是主要的异构体（通过1H NMR确定的比例是6.5/1）能够清楚地被鉴定为吡喃糖的形式。如图7所示，通过13C NMR光谱法确定出了随着这一反应生成了N-(1-脱氧-D-果糖-1-基)-S-烯丙基-L-半胱氨酸的四种异构体，但是主要的异构体能够清楚地被鉴定为吡喃糖的形式。
参看图6，反应产物显示的典型的UV/V对于S-烯基半胱氨酸是预期的吸收峰，并且显示准分子离子[M-H]-离子具有m/z451，以及在MS-ESI-光谱中碎片离子是m/z128。高分辨率的LC-MS（ESI-）分析证实了该化合物具有C17H28N2O10S的分子式。1H NMR显示的典型的信号对于二肽γ-L-谷氨酰基-（E）-S-1-丙烯基-L-半胱氨酸是预期的。此外，能够观察到五个其它的信号。3.16ppm的H-C(1’α)和3.20ppm的H-C(1’β)的质子能够被观察到具有12.8Hz的耦合常数的偶极子。每个自旋系统中的质子序列通过g-COSY光谱中的信号互串的顺序被说明。3.76ppm的dd质子H-C（4’）共振显示了下面表6所示的3.3和9.8Hz的耦合常数。9.8Hz的耦合常数形成了3.62ppm的质子H-C（3’）的轴对轴耦合（axial-axial coupling），然而3.3Hz的小耦合常数能够从3.87ppm的质子H-C（5’）的直立-平伏（axial-equatorial）耦合推导。
表6.N-（1-脱氧-D-果糖-1-基）-γ-L-谷氨酰基-S-反式-（丙烯-1-基）-L-半胱氨酸（ARP-γ-反式-Glu-PeC）（500MHz，D2O）的1H NMR信号的解析
a涉及图6结构的碳原子的任意编号。
b与D2O有关的1H化学位移。
c从ID-光谱确定的。
d通过g-COSY试验观察到的共核1H，1H的连接性。
显示17个信号的13C NMR光谱与显示13个信号的DEPT-135试验的结果对照，显示出对应于季碳原子的四个信号。如图7所示，这些季碳原子和氢取代的碳原子的明确解析分别能够成功地通过对2JC，H和3JC，H耦合常数优化的HMBC光谱和对1JC，H耦合常数优化的HSQC光谱实现。此外，HMBC试验显示出在3.62ppm共振的糖质子H-C(3’)，在3.64ppm的L-谷氨酸单体H-C(2)的α质子和在52.5ppm的邻近的碳原子C（1’）之间的相关性，因此明确地显示出糖与二肽单体的分子内键合。
表7.N-（1-脱氧-D-果糖-1-基）-γ-L-谷氨酰基-S-反式-（丙烯-1-基）-L-半胱氨酸（ARP-γ-反式-Glu-PeC）（125MHz，D2O）的13C NMR信号的解析
a涉及图7结构的碳原子的任意编号。
b与TMSP有关的13C化学位移。
cDEPT-135光谱。
d基于HSQC(1J)和HMBC(2，3J)试验的解析。
此外，能够检测3.16ppm共振的糖质子H-C（1’αβ）和L-谷氨酸单体的62.3ppm处的碳原子C（2）之间的异核核糖核酸3J耦合，因此还证实了带有二肽的碳水化合物的分子内键合。此外，52.5和95.2ppm共振的碳原子C（1’）和C（2’）的化学位移明确地证实了糖单体的连接。图8显示了N-（1-脱氧-D-果糖-1-基）-γ-L-谷氨酰基-S-反式-（丙烯-1-基）-L-半胱氨酸，γ-L-谷氨酰基-S-反式-（丙烯-1-基）-L-半胱氨酸的阿马道里产物的结构。
现在参看图7，显示的典型的UV/V的反应产物对于S-烯基半胱氨酸是预期的吸收峰，并且显示准分子离子[M+H]+离子具有m/z324，以及在MS-ESI-光谱中碎片离子是m/z162。高分辨率的LC-MS（ESI-）分析证实了该化合物具有C12H21NO7S的分子式。1H NMR显示的典型的信号对于S-烯丙基-L-半胱氨酸是预期的。此外，能够观察到五个其它的信号。如图8所示，3.26-3.47ppm的H-C(1’αβ)质子能够被观察到具有12.8Hz的耦合常数的许多偶极子。每个自旋系统中的质子序列通过g-COSY光谱中的信号互串的顺序被说明。碳水化合物单体的剩余质子H-C（3’，4’，5’，6’）在3.62-4.13ppm范围中被检测到。
表8.N-（1-脱氧-D-果糖-1-基）-S-烯丙基-L-半胱氨酸（ARP-S-烯丙基-L-半胱氨酸）（400MHz，MeOD）的1H NMR信号的解析
a涉及图7结构的碳原子的任意编号。
b与D2O有关的1H化学位移。
c从ID-光谱确定的。
d通过g-COSY试验观察到的共核1H，1H的连接性。
显示12个信号的13C NMR光谱（图7）与显示10个信号的DEPT-135试验的结果对照，显示出对应于季碳原子的两个信号。这些季碳原子和氢取代的碳原子的明确解析分别能够成功地通过对2JC，H和3JC，H耦合常数优化的异核多键相关光谱（HMBC）和对1JC，H耦合常数优化的异核单量子相关光谱（HSQC）实现（表9）。
表9.N-（1-脱氧-D-果糖-1-基）-S-烯丙基-L-半胱氨酸（ARP-S-烯丙基-半胱氨酸）（100MHz，MeOD）的13C NMR信号的解析
a涉及图7结构的碳原子的任意编号。
b与TMSP有关的13C化学位移。
cDEPT-135光谱。
d基于HSQC(1J)和HMBC(2，3J)试验的解析。
此外，HMBC试验显示了糖质子H-C（3’）和L-谷氨酸单体H-C(2)的α质子以及54.7ppm处的邻近的碳原子C（1’）之间的相关性，因此还明确地证实了糖与二肽单体的分子内键合。此外，能够检测到在3.26-3.47ppm共振的糖质子H-C（1’αβ）和L-谷氨酸单体的62.5-62.9ppm的碳原子C（2）之间的异核核糖核酸3J耦合，因此还证实了具有氨基酸的碳水化合物的分子内键合。此外，52.7-54.7和96.0-103.0ppm共振的碳原子C（1’）和C（2’）的化学位移明确地证实了糖单体的连接。图9显示了N-（1-脱氧-D-果糖-1-基）-S-烯丙基-L-半胱氨酸，S-烯丙基-L-半胱氨酸的阿马道里产物的结构。
本发明将参考下面的非限制性的例子被描述，这些例子显示了本发明的肽的观察到的感官效果。
淳厚味强度的感官试验例子
除非另有说明，样本的全部感官试验使用三点试验法（Wieser和Belitz，Z.Lebensm.Unter s.Forsch.，1975，159，65-72）在三个不同的组中被确定。组成感官小组以评价下面的溶解于具有pH值6.0的瓶装水的参考味道化合物的水溶液（每种2mL）：蔗糖（25mmol/L）是甜味；乳酸（20mmol/L）是酸味；NaCl（30mmol/L）是咸味；咖啡因（1mmol/L）是苦味；MSG（3mmol/L）是鲜味；单宁酸（0.05%）是收敛感的涩味，槲皮素-O-β-D-葡萄糖苷（0.01mmol/L）是天鹅绒感的干涩味，以及口干的口感。对于粘度的试验，使用凝胶溶液（水中0.5%）。对于口感增强的活性和复杂性增加（淳厚味活性）的试验，小组被要求将空白模型鸡汤（pH值6.5，对照组）与在鸡汤（pH值6.5）中具有还原型谷胱甘肽（5mmol/L）溶液的味觉的影响进行对照。在19-22℃的感官试验室中以三种不同的会议使用鼻夹进行感官分析。
为了确定口感增强（淳厚味）的活性的识别阙值浓度，分别使用氯化钠（30mmol/L）或L-谷氨酸（10mmol/L），氯化钠（10mmol/L）和L-谷氨酸（10mmol/L）的二元混合物的水溶液，或模型鸡汤的水溶液作为诱导组合物基质进行三种选择的强迫选择试验（three-alternative forced-choice test）。单独样本和空白组的pH值分别通过添加痕量的蚁酸（0.1mmol/L）和氢氧化钠溶液（1.0mmol/L）被调节到6.5。样本（4mL）以1：1的稀释度存在以在三种不同的会议中使用吸吐法（sip-and-spit method）增加被试验组的浓度。在每个感官试验的开始并在每个试验之前，样本用瓶装水冲洗并被吐掉。该样本在嘴里短暂地旋转并被吐掉。
在指出含有调节味道的化合物的小瓶之后，参与者尝试另两个样本，一个不含有添加剂，一个含有添加剂。为了防止过度的疲劳，品尝从下面的两步浓度水平开始，在初步感官试验中已经确定了的个体阙值浓度。计算最后浓度和倒数第二浓度的几何平均值并作为个体阙值。感官小组的阙值通过对三个单独的会议中的个体的阙值取平均值进行近似计算。个体和单独的会议之间的值相差不超过两个稀释步骤。
对于记录味道概况，如下面例子所示制备样本。在三个不同的会议的三点试验中确定样本的风味概况。参与者避免在会议之前至少1小时内的进食或饮水。在会议开始并在每个试验之前，样本用水冲洗并被吐掉。参与者接收一套两个空白组和一个味道样本。液体在嘴里短暂地旋转并被吐掉。在指出显示不同的味道和/或风味概况和区别说明的的玻璃小瓶之后，参与者尝试另两个试验组，两个空白组和一个味道样本。具有添加剂的每个样本与没有添加剂的两个对照样本进行对照。根据0到5（5是最大的强度）的数值范围评价淳厚味的强度。碰撞感是指从当食品或液体被放入嘴里的时间到在嘴里0-3秒内所经历的最初的淳厚味的感觉，而持久性是指在之后的10-60秒之后的淳厚味的感觉。
例1.鸡汤中的化合物的感官效果
通过将3g的鸡汤浓缩物（Gourmet Bouillon Huhn;Maggi，Singen，德国）用100mL的水稀释进行感官（三点）试验。添加如下表中说明的添加剂。使用蚁酸（0.1mol/L）或氢氧化钠（0.1mol/L）将全部样本的pH值调节到6.5。确定谷胱甘肽（GSH）以在全部试验中具有3.5的淳厚味强度。试验的结果被显示在下面的表10中。对于每个样本，评价淳厚味强度并且询问参与者以描述感官特征。
表10.鸡汤中的感官效果
与阴性对照相比，小组评价含有NaCl的阳性对照组更具咸味，并且含有MSG的阳性对照组具有稍高的鲜味强度，但是对照组没有观察到淳厚味的效果。如表10所示，根据通式（I）的三肽具有令人惊讶地有效的淳厚味效果。
例2.水中该化合物的感官效果
通过将所列的化合物溶解于水中进行感官（三点）试验。添加如下表中说明的添加剂。使用蚁酸（0.1mol/L）或氢氧化钠（0.1mol/L）将全部样本的pH值调节到6.5。试验的结果被显示在下面的表11中。对于每个样本，评价香味和味道强度并且询问参与者以描述感官特征。
表11.水中的感官效果
与阴性对照组相比，小组评价含有NaCl的阳性对照组更具咸味，并且含有MSG的阳性对照组具有稍高的鲜味（MSG的味道）强度，但是对照组没有观察到淳厚味效果。此外，没有诱导组合物或含有谷氨酸盐的组合物的存在，根据通式（I）或（II）的化合物没有淳厚味的感觉。
例3.鸡汤中的该化合物的淳厚味的阙值浓度
通过将10g的鸡汤（Klare Hühner-Suppe extra;Maggi，Singen，德国）用1000mL的水稀释，过滤并使用滤出液进行下面的感官（三点）试验以确定下面的表12中所示的淳厚味的阙值浓度。
表12.鸡汤中的该化合物的淳厚味的阙值浓度
在此描述的增味的γ-L-谷氨酰化合物和阿马道里产物是有用的风味成分，尽管事实上它们几乎没有它们本身任何的味道，当它们被添加与至少一种诱导组合物结合时，仍然能够为产品提供非常明显的感官特征；具体是非常明显的完整度，乳脂状和物质。出于这一点，它们能够为它们添加的产品改进口味或“口感”。在此描述的增味化合物不仅能够增加感官效果，而且它们还能够提供由食物中的脂肪和风味组合物中的存在所提供的完整的感觉。由于不对称的碳原子存在于本发明的化合物（I）和（II）的结构中，它们还能够以许多构型异构体的形式存在，这些构型异构体的单独或混合物同样能够令人满意地用于为食品提供淳厚味的效果。通常，适于本发明的异构体包括氨基酸序列的变化，氨基酸的手性中心结构的变化，顺式/反式键合的变化以及从1-丙烯基到2-丙烯基（烯丙基）键合的变化。本发明有用的一些具体的可能的异构体在表13中通过举例的方式提供。
表13.根据通式（I）和（II）的化合物的异构体。
如上面所描述的，本发明的化合物的风味特性是在广泛的浓度范围内是明显的。例如，在一个实施例中，化合物或化合物的混合物可以大约10到100ppm（mg/kg）的浓度范围存在。在另一个实施例中，本发明的至少一种风味化合物或化合物的混合物以至少20ppm的浓度存在以为食品产品提供淳厚味的感觉。根据本公开内容，本领域的技术人员将意识到能够根据食品产品，基质，其它调味品的存在和需要的淳厚味的强度调节该浓度。
虽然本发明的γ-谷氨酰肽和阿马道里产物作为天然的增味化合物，但是也可通过本领域已知的任何方法合成产生肽以提供相同的效果。因此，在一个实施例中，增味化合物从葱科家族的种子中分离并纯化为天然提取物。在另一个实施例中，本发明的增味剂是合成产生的。在一个实施例中，能够使用脱水形式或其它形式的增味化合物以提高食品产品的风味。
本发明的增味化合物能够以多种方式被添加到食品中。能够在烹制步骤之前或在烹制过程的中间阶段将该化合物添加到面团中。该化合物还能够作为浇料在例如烘焙或油炸的烹制步骤之前或之后被添加食品产品。本发明的风味化合物的状态和它们被添加到食品产品的状态同样是不被限制的。它们可以干燥粉末的状态，糊状或液态。淳厚味的感觉可以为许多食品产品提供，包括但不限于汤，奶酪，烘焙产品，零食食品，油炸产品，饮料，蔬菜，胡萝卜，西红柿，坚果，燕麦，粗粮，沙司，调味酱，饼干，面包，水果汁，蔬菜汁（例如西红柿，胡萝卜，德国泡菜，甜菜根等），酱汁（包括大豆和西红柿），蘑菇，鱼，牛肉，猪肉，鸡肉，海藻，金枪鱼，贝类，牡蛎，绿茶，红薯，大白菜，黄豆，干调料（包括调味包）和含有无论是天然存在或是有意添加的谷氨酸盐或核苷酸的任何其它的食品。此外，由于肽和阿马道里产物只要在食用的时候它们被添加到食品产品中就能够显示出淳厚味的增味功能，天然增味剂能够随时被添加到食品或调味品中以实现淳厚味的增味效果。例如，如上面所讨论的，γ-L-谷氨酰肽或阿马道里产物能够在产生之前或产生过程中被添加到原料中，或者在完成之后被添加到最终产品中，或仅仅在食用之前，食用时或在食用过程中被添加到最终产品中。
除非另有说明，用于本说明书和权利要求书中的全部数字表示成分的数量，例如分子量，反应条件等的特性等被理解为在全部例子中通过术语“大约”被修正。因此，除非有相反的说明，本说明书和所附的权利要求书中所列的数值参数是近似值，它们能够根据本发明获得的需要的特性进行变化。至少，它们不是为了限制权利要求的保护范围的等同原则的适用，每个数值参数至少应该被理解为根据报告的有效位数的号码并适用普通的四舍五入技术。
尽管本发明的大概范围提到的数值范围和参数是近似值，但是在具体的例子中提到的数值是尽可能准确的报导的。但是，任何数值，本身包含某些错误，必然导致在它们各自的试验测定中发现的标准偏差。

Claims (19)

1.一种产生淳厚味的增味效果的方法，所述的方法包括：
制备葱属植物的泥；
从所述的葱属植物的泥中分离至少一种化合物，所述的化合物选自具有以下通式的化合物；
其中，R1和R2各自独立地选自由—CH3，—CH2CH3，—CH＝CH2，—C≡CH，—CH2CH2CH3，—CH＝CHCH3和—CH2CH＝CH2组成的组中；
R3是L-γ-谷氨酰基团或它的盐；
纯化所述的化合物；和
将10-100ppm的纯化的通式的所述化合物与至少一种诱导组合物混合，所述诱导组合物包括含有谷氨酸盐和/或核酸的至少一种食品或溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的食品是选自由汤，奶酪，烘焙产品，零食食品，饮料，蔬菜汁，酱汁，蘑菇和鱼组成的组中的食品产品。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，通过粉碎所述的葱属植物的种子制备所述的葱属植物的泥。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的葱属植物是阔叶葱。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的葱属植物是细香葱。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的方法还包括在纯化的所述的化合物与所述的诱导组合物混合之前将纯化的所述的化合物中的一种和至少一种还原糖在产生阿马道里产物的条件下进行反应。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述的还原糖选自由甘油醛，赤藓糖，苏阿糖，核糖，树胶醛糖，木糖，来苏糖，阿洛糖，阿卓糖，葡萄糖，甘露糖，古洛糖，艾杜糖，半乳糖，塔罗糖，酮丁糖，核酮糖，木酮糖，阿卢糖，果糖，山梨糖，塔格糖，岩藻糖，纤维二糖，龙胆二糖，异麦芽糖，乳糖，乳果糖，麦芽糖，麦芽酮糖，蜜二糖新橙皮糖，黑曲霉糖，帕拉金糖，芸香糖，墨角藻糖基乳糖，麦芽三糖，甘露三糖，潘糖，麦芽四糖和水苏糖组成的组中。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的诱导组合物选自由谷氨酸单钠，5’-肌苷酸，5’-鸟苷酸和牛肉提取物组成的组中。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，从所述葱属植物的泥中分离的化合物是γ-L-谷氨酰基-(E)-S-1-丙烯基-L-半胱氨酰基-γ-L-谷氨酰基-(E)-S-1-丙烯基-L-半胱氨酸，并且其中将至少56mg/L的纯化的所述化合物与所述的诱导组合物混合。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，R1和R2具有反式结构。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，R1和R2具有顺式结构。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的诱导组合物是土豆。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，纯化的所述的化合物增强了咸味和鲜味中的至少一种。
14.以下通式的增味化合物和它的异构体：
其中，R1和R2各自独立地选自由—CH3，—CH2CH3，—CH＝CH2，—C≡CH，—CH2CH2CH3，—CH＝CHCH3和—CH2CH＝CH2组成的组中；
R3是L-γ-谷氨酰基团或它的盐；并且
其中所述的化合物从葱属植物中分离并被纯化。
15.根据权利要求14所述的增味化合物和它的异构体，其中，R1和R2具有反式结构。
16.根据权利要求14所述的增味化合物和它的异构体，其具有γ-L-谷氨酰基-(E)-S-1-丙烯基-L-半胱氨酰基-γ-L-谷氨酰基-(E)-S-1-丙烯基-L-半胱氨酸的名称。
17.根据权利要求14所述的增味化合物和它的异构体，其中，所述的葱属植物是阔叶葱。
18.根据权利要求14所述的增味化合物和它的异构体，其中，所述的葱属植物是细香葱。
19.根据权利要求14所述的增味化合物和它的异构体，其中，纯化的所述的化合物增强了咸味和鲜味中的至少一种。
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