CN103146676B - 一种生产饲用固定化葡萄糖氧化酶的方法 - Google Patents

Abstract

一种生产饲用固定化葡萄糖氧化酶的方法，包括如下步骤：（1）稻壳吸附剂的制备；（2）葡萄糖氧化酶的吸附；（3）葡萄糖氧化酶的包埋。本发明采用稻壳为原料，制成富含活性炭和白炭黑的稻壳吸附剂，以稻壳吸附剂为载体固定化葡萄糖氧化酶，制备具有吸附真菌毒素、抑制有害细菌生长、提高饲料转化率等多种功能的饲料添加剂。葡萄糖氧化酶经稻壳吸附剂固定化后，酶活力回收率可达75%以上，保存30天后酶活力回收率仍在70%以上，其稳定性较游离葡萄糖氧化酶显著提高。本发明工艺简单、易操作，降低了固定化葡萄糖氧化酶的原料成本和生产成本，同时还能实现稻谷加工副产物的高值利用。

Description

一种生产饲用固定化葡萄糖氧化酶的方法

技术领域

本发明涉及一种生产饲用固定化葡萄糖氧化酶的方法，尤其是涉及一种以稻壳加工产物为吸附剂生产饲用固定化葡萄糖氧化酶的方法。

背景技术

葡萄糖氧化酶在氧分子存在下能将葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢，将其加入饲料中，能消耗氧而有利于厌氧乳酸菌的增殖，迅速产生大量乳酸，使饲料中的pH值下降，抑制有害细菌繁殖，避免异常发酵，从而保证饲料的质量，利于禽畜育肥。因此，作为一种新型的抗生素替代物，葡萄糖氧化酶在饲料工业中具有广阔的应用前景。目前饲用葡萄糖氧化酶由青酶、黑曲酶、酵母液态发酵生产。游离的葡萄糖氧化酶由于稳定性差，保存和使用受到一定限制，经固定化后，其稳定性可以显著增强。葡萄糖氧化酶的固定化方法有吸附法、共价法、交联法、包埋法等，固定化载体有氨基化硅胶、壳聚糖微球、琼脂糖凝胶、尼龙膜、HEC/SiO₂ 凝胶等，但这些载体材料价格昂贵，且大多数不符合食品级或饲用级要求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种原料来源广，成本低廉，工艺简单的生产饲用固定化葡萄糖氧化酶的方法，所得固定化葡萄糖氧化酶活力高，稳定性好，安全性好。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是，一种生产饲用固定化葡萄糖氧化酶的方法，包括如下步骤：

（1）稻壳吸附剂的制备：将稻壳粉碎，过20目筛，经102℃～108℃烘箱干燥后，取30g～35g置于瓷坩埚内，将瓷坩埚于马弗炉内进行炭化，炭化温度350℃～450℃，保温时间30～60min，以控制炭化稻壳水分含量0.5wt%～1.0wt%，碳含量40wt%～60wt%，二氧化硅含量40wt%～60wt%，其它金属氧化物Al₂O₃、Fe₂O₃、CaO、MgO、Na₂O、K₂O总含量2.0wt%～3.0wt%（保证炭化不过度），冷却后得到炭化稻壳；   

取炭化稻壳15g～20g，加入50mL～100mL 4mol/L的NaOH溶液，95～105℃反应2～4小时，抽滤去除溶液，并用蒸馏水将滤渣洗涤至中性，然后将滤渣置于102～108℃烘箱中烘干备用；取8g～10g干燥滤渣，加入16g～20g固体磷酸，于马弗炉内进行活化，温度350℃～450℃, 活化时间在60min～90min，冷却后用蒸馏水洗涤至中性，在102～108℃烘箱中烘干，然后粉碎，过40目筛，得多孔稻壳吸附剂；所得多孔稻壳吸附剂水分含量0.5wt%～1.0wt%，碳含量70wt%～85wt%，二氧化硅含量15wt%～30wt%；

（2）葡萄糖氧化酶的吸附：取5mg～6mg葡萄糖氧化酶溶解于50mL～60mL磷酸缓冲液（pH5.6）中，加入0.5g～0.6g稻壳吸附剂，室温下搅拌2h～3h，然后放入4℃～6℃冰箱中静置过夜，离心弃去上清液，沉淀用蒸馏水洗涤3次，抽滤，滤渣即为吸附了葡萄糖氧化酶的稻壳吸附剂；

（3）葡萄糖氧化酶的包埋:将步骤（2）吸附了葡萄糖氧化酶的稻壳吸附剂加入到100mL～120mL 2wt%的海藻酸钠溶液中，搅拌均匀后，将海藻酸钠悬浮液滴入1wt%的氯化钙溶液中，制成直径为3mm～4mm的固定化凝胶珠，将固定化凝胶珠在4℃～6℃冰箱中静置过夜，用蒸馏水洗涤3次，过滤，滤渣即为固定化葡萄糖氧化酶。

固定化葡萄糖氧化酶活力的测定：

采用酸碱滴定法测定固定化葡萄氧化酶的活力：称取固定化葡萄糖氧化酶20mg～40mg于250mL锥形瓶中，加入25mL含有 2wt%葡萄糖的0.1mol/L磷酸缓冲液（pH5.6）中，于30℃恒温振荡反应1h，立即加入20mL0.1mol/L 的氢氧化钠溶液终止反应，用0.1mol/L盐酸标准溶液进行滴定；并做空白试验，不加固定化葡萄糖氧化酶；酶活力单位（U）定义为每分钟催化葡萄糖氧化生成1μmol葡萄糖酸所需的酶量。5mg游离葡萄糖氧化酶活力为150U，经测定，用稻壳吸附剂固定化后，固定化葡萄糖氧化酶活力为114～126U，酶活力回收率可达75%以上。

固定化葡萄糖氧化酶稳定性的测定：

将0.5g～0.6g的固定化葡萄糖氧化酶和游离葡萄糖氧化酶分别于4～6℃冰箱中保存，用酸碱滴定法测定酶活力。结果表明，保存30天时，游离葡萄糖氧化酶的酶活力回收率下降到40%以下，而固定化葡萄糖氧化酶的酶活力回收率仍保持在70%以上，其稳定性较游离葡萄糖氧化酶显著提高。

稻壳是一种来源丰富、价格低廉、可再生的稻谷加工副产物，其主要成分为纤维素、半纤维素、木质素和二氧化硅，是生产大宗饲料的原材料，也是制备活性炭、白炭黑、碳硅复合物等稻壳吸附剂的最佳材料。研究表明，稻壳吸附剂可吸附真菌毒素，作为饲料添加剂，还可作为β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、漆酶等多种酶制剂的固定化载体，增强酶分子的热稳定性、酸碱稳定性和保存稳定性。

本发明采用稻壳为原料，通过炭化、活化等工艺制成富含活性炭和白炭黑的稻壳吸附剂，以稻壳吸附剂为载体固定化葡萄糖氧化酶，制备具有吸附真菌毒素、抑制有害细菌生长、提高饲料转化率等多种功能的饲料添加剂。葡萄糖氧化酶经稻壳吸附剂固定化后，酶活力回收率可达75%以上，保存30天后酶活力回收率仍在70%以上，其稳定性较游离葡萄糖氧化酶显著提高。本发明工艺简单、易操作，降低了固定化葡萄糖氧化酶的原料成本和生产成本，同时还能实现稻谷加工副产物的高值利用。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

本实施例包括以下步骤：

（1）稻壳吸附剂的制备

将稻壳粉碎,过20目筛，经105℃烘箱干燥后，取30g置于瓷坩埚内，将瓷坩埚于马弗炉内进行炭化，炭化温度350℃，保温时间30min，冷却后得到炭化稻壳；

炭化稻壳水分含量0.9wt%，碳含量54wt%，二氧化硅含量41wt%，其它金属氧化物Al₂O₃、Fe₂O₃、CaO、MgO、Na₂O、K₂O含量2.3wt%；

取炭化稻壳20g，加入75mL 4mol/L NaOH溶液，100℃反应3小时，抽滤去除溶液，并用蒸馏水将滤渣洗涤至中性，然后将滤渣置于105℃烘箱中烘干备用；取10g干燥滤渣，加入20g固体磷酸，于马弗炉内进行活化，温度400℃, 活化时间60min，冷却后用蒸馏水洗涤至中性，在105℃烘箱中烘干，粉碎。过40目筛，得多孔稻壳吸附剂；稻壳吸附剂水分含量0.8wt%，碳含量79wt%，二氧化硅含量17wt%；

（2）葡萄糖氧化酶的吸附

取5mg葡萄糖氧化酶（酶活力30000U/g）溶解于50mL磷酸缓冲液（pH5.6）中，加入0.5g稻壳吸附剂，室温下搅拌2h，然后放入4℃冰箱中静置过夜，离心弃去上清液，沉淀用蒸馏水洗涤3次，抽滤，滤渣即为吸附了葡萄糖氧化酶的稻壳吸附剂；

（3）葡萄糖氧化酶的包埋

将步骤（2）吸附了葡萄糖氧化酶的稻壳吸附剂加入到100mL 2wt%的海藻酸钠溶液中，搅拌均匀后，用注射器将海藻酸钠悬浮液滴入1wt%的氯化钙溶液中，制成直径为3mm～4mm的固定化凝胶珠，将固定化凝胶珠在4℃冰箱中静置过夜，用蒸馏水洗涤3次，过滤，滤渣即为固定化葡萄糖氧化酶。

本实施例之固定化葡萄糖氧化酶活力的测定：

采用酸碱滴定法测定固定化葡萄氧化酶活力：称取固定化葡萄糖氧化酶20mg于250mL锥形瓶中，加入25mL含有 2wt%葡萄糖的0.1mol/L磷酸缓冲液（pH5.6）中，于30℃恒温振荡反应1h，立即加入20mL 0.1mol/L 氢氧化钠溶液终止反应，用0.1mol/L盐酸标准溶液进行滴定，并做空白试验，不加固定化葡萄糖氧化酶；酶活力单位（U）定义为每分钟催化葡萄糖氧化生成1μmol葡萄糖酸所需的酶量；经测定，5mg游离葡萄糖氧化酶活力为150U，用稻壳吸附剂固定化后，葡萄糖氧化酶活力为114U，酶活力回收率为76.0%。

本实施例之固定化葡萄糖氧化酶稳定性的测定:

将0.5g的固定化葡萄糖氧化酶和游离葡萄糖氧化酶分别于4℃冰箱中保存10、20、30天，用酸碱滴定法测定酶活力。结果表明，保存20天时，游离葡萄糖氧化酶的酶活力回收率下降到54.3%，固定化葡萄糖氧化酶的酶活力回收率为75.2%；保存30天时，游离葡萄糖氧化酶的酶活力回收率下降到32.2%，固定化葡萄糖氧化酶的酶活力回收率仍为73.3%，其稳定性较游离葡萄糖氧化酶显著提高。

实施例2

本实施例包括以下步骤：

（1）稻壳吸附剂的制备

将稻壳粉碎，过20目筛，经105℃烘箱干燥后，取30g置于瓷坩埚内，将瓷坩埚于马弗炉内进行炭化，炭化温度450℃，保温时间60min，冷却后得到炭化稻壳；

炭化稻壳水分含量0.6wt%，碳含量41wt%，二氧化硅含量55wt%，其它金属氧化物2.7wt%；

取炭化稻壳20g，加入75mL 4mol/L NaOH溶液，100℃反应3小时，抽滤去除溶液，并用蒸馏水将滤渣洗涤至中性，然后将滤渣置于105℃烘箱中烘干备用；取10g干燥滤渣，加入20g磷酸，于马弗炉内进行活化，温度450℃, 活化时间在90min，冷却后用蒸馏水洗涤至中性，在105℃烘箱中烘干，然后粉碎，过40目筛，得多孔稻壳吸附剂；稻壳吸附剂水分含量0.7%，碳含量69%，二氧化硅含量26%；

（2）葡萄糖氧化酶的吸附

取5mg葡萄糖氧化酶（酶活力30000U/g）溶解于50mL磷酸缓冲液（pH5.6）中，加入0.5g稻壳吸附剂，室温下搅拌2h，然后放入4℃冰箱中静置过夜，离心弃去上清液，沉淀用蒸馏水洗涤3次，抽滤，滤渣即为吸附了葡萄糖氧化酶的稻壳吸附剂；

（3）葡萄糖氧化酶的包埋

将步骤（2）吸附了葡萄糖氧化酶的稻壳吸附剂加入到100mL 2wt%的海藻酸钠溶液中，搅拌均匀后用注射器将海藻酸钠悬浮液滴入1wt%的氯化钙溶液中，制成直径为3mm～4mm的固定化凝胶珠，将固定化凝胶珠在4℃冰箱中静置过夜，用蒸馏水反复洗涤，滤干即得固定化葡萄糖氧化酶。

本实施例固定化葡萄糖氧化酶活力的测定：

采用酸碱滴定法测定固定化葡萄氧化酶活力：称取固定化葡萄糖氧化酶20mg于250mL锥形瓶中，加入25mL含有 2wt%葡萄糖的0.1mol/L磷酸缓冲液（pH5.6）中，于30℃恒温振荡反应1h，立即加入20mL 0.1mol/L 氢氧化钠溶液终止反应，用0.1mol/L盐酸标准溶液进行滴定，并做空白试验，不加固定化葡萄糖氧化酶；酶活力单位（U）定义为每分钟催化葡萄糖氧化生成1μmol葡萄糖酸所需的酶量。经测定，5mg游离葡萄糖氧化酶活力为150U，用0.5g稻壳吸附剂固定化后，葡萄糖氧化酶活力为119U，酶活力回收率为79%。

本实施例之固定化葡萄糖氧化酶稳定性的测定

将0.5g的固定化葡萄糖氧化酶和游离葡萄糖氧化酶分别于4℃冰箱中保存10、20、30天，用酸碱滴定法测定酶活力。结果表明，保存20天时，游离葡萄糖氧化酶的酶活力回收率下降到56.2%，固定化葡萄糖氧化酶的酶活力回收率为77.6%；保存30天时，游离葡萄糖氧化酶的酶活力回收率下降到37.3%，固定化葡萄糖氧化酶的酶活力回收率仍为71.7%，其稳定性较游离葡萄糖氧化酶显著提高。 

Claims (1)

1. 一种生产饲用固定化葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）稻壳吸附剂的制备：将稻壳粉碎，过20目筛，经102℃～108℃烘箱干燥后，取30g～35g置于瓷坩埚内，将瓷坩埚于马弗炉内进行炭化，炭化温度350℃～450℃，保温时间30～60min，冷却后得到炭化稻壳；   

取炭化稻壳15g～20g，加入50mL～100mL 4mol/L的NaOH溶液，95～105℃反应2～4小时，抽滤去除溶液，并用蒸馏水将滤渣洗涤至中性，然后将滤渣置于102～108℃烘箱中烘干备用；取8g～10g干燥滤渣，加入16g～20g固体磷酸，于马弗炉内进行活化，温度350℃～450℃, 活化时间在60min～90min，冷却后用蒸馏水洗涤至中性，在102～108℃烘箱中烘干，然后粉碎，过40目筛，得多孔稻壳吸附剂； 

（2）葡萄糖氧化酶的吸附：取5mg～6mg葡萄糖氧化酶溶解于50mL～60mL磷酸缓冲液中，加入0.5g～0.6g稻壳吸附剂，室温下搅拌2h～3h，然后放入4℃～6℃冰箱中静置过夜，离心弃去上清液，沉淀用蒸馏水洗涤3次，抽滤，滤渣即为吸附了葡萄糖氧化酶的稻壳吸附剂；

（3）葡萄糖氧化酶的包埋:将步骤（2）吸附了葡萄糖氧化酶的稻壳吸附剂加入到100mL～120mL 2wt%的海藻酸钠溶液中，搅拌均匀后，将海藻酸钠悬浮液滴入1wt%的氯化钙溶液中，制成直径为3mm～4mm的固定化凝胶珠，将固定化凝胶珠在4℃～6℃冰箱中静置过夜，用蒸馏水洗涤3次，过滤，滤渣即为固定化葡萄糖氧化酶。