CN103146588B - 一种齐整小核菌固体发酵培养基及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种齐整小核菌固体发酵培养基及其应用，该固体发酵培养基包括固体基质和水；固体基质包括麸皮和农业废弃物，麸皮占固体基质总重的20%-60%，水和固体基质的重量比为20-45:100；农业废弃物选用、稻壳、假高粱秸秆、有机肥、麦稃基质、醋糟、酒糟、园林枯枝或锯木屑。本发明制备的齐整小核菌固体发酵培养基成本低、制备工艺简单，且采用该固体发酵培养基制备得到的除草剂可在常温下保存。

Description

一种齐整小核菌固体发酵培养基及其应用

技术领域

本发明涉及一种齐整小核菌固体发酵培养基，具体涉及一种采用农业废弃物与麸皮作为原料的齐整小核菌固体发酵培养基及其应用。

背景技术

化学除草剂的不断应用暴露出不少弊端，开发利用微生物尤其是植物病原真菌用于杂草防治，是有效、安全环保且可持续发展的杂草管理方法。开展杂草病原菌的调查、分离并将其用于生物防治是世界杂草研究中的一个热点。由于核盘菌属（Sclerotinia spp.）的核盘菌（S.sclerotiorum）能引起植物快速发病，同时杀死多种阔叶杂草，已被筛选用于开发作为生物除草剂，用于草坪防治西洋蒲公英（Taraxacum officinale）、蓟（Cirsium arvense）等杂草（et al.,1995;2006;Brosten and Sands,1986;Quimby et al.,2004）。该属的小核盘菌（S.minor），由于其对禾本科植物安全，可以起多种菊科杂草病害，也已被开发作为生物除草剂（Abu-Dieyeh et al.,2005;2006;2007;Schnick et al.,2002）。齐整小核菌属（Sclerotium spp.）在生物学和生态学特性上与核盘菌属极其类似（Pandey etal.,1996），现在已被作为生物除草剂开发利用。核盘菌和齐整小核菌生物除草剂一般直接利用菌丝体作为应用的材料，为固体剂型，即以固体发酵得到的含有菌丝体的固体基质直接撒施于田间。在国外，生产齐整小核菌常用的固体基质包括大麦粒（Abu-Dieyeh et al.,2005;2006;2007;Schnick et al.,2002）、小麦粒（Brosten and Sands,1986;Shukla and Pandey,2008）、奎奴亚藜和向日葵籽（Quimby et al.,2004）、松木屑（Harvey et al.,1994）等。上述固体基质经接菌培养后，在应用前通常需要晾干。但是，这些原料价格均较高，大批量生产成本较大，对于发展中国家来说，比较难以接受。

农业废弃物（agricultural waste）通常指农业生产中植物的茎、秆、皮壳等，它们以及制糖、酒的废料如甘蔗渣、酒糟等用于微生物发酵原料生产和提取代谢产物已有广泛研究（de Vrije et al.,2001;Onuoha et al.,2009;Shabana et al.,2010;Souza et al.,2001）。中国每年产生了大量的农业废弃物，包括（×10⁴t）：稻草21129.26、玉米秸秆2020.93、小麦秸秆10718.95及制糖废料甘蔗渣2079.31，其中绝大部分被焚烧或丢弃（毕于运等,2009）。焚烧农业废弃物造成环境污染，排放温室气体CO₂和浪费大量有机质（Croan,2000）。因此，如何利用和处理农业废弃物是值得考虑和研究的课题。此前，利用麸皮作为基质虽然能获得较高的发酵效果，但麸皮相对价格较高，因此，需要寻找成本较低的、发酵效果好的替代培养基。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种生产成本低、且能有效利用农业废弃物，减少环境污染的齐整小核菌固体发酵培养基及应用其生产含有菌丝体的固体培养基作为生物除草剂的方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种齐整小核菌固体发酵培养基，包括固体基质和水；固体基质包括麸皮和农业废弃物，麸皮占固体基质总重的20%-60%，水和固体基质的重量比为20-45:100；农业废弃物选用水稻秸秆、玉米秸秆、油菜秸秆、棉花秸秆、加拿大一枝黄花秸秆、稻壳、假高粱秸秆、有机肥、麦稃基质、醋糟、酒糟、园林枯木或锯木屑。

其中，水稻秸秆、玉米秸秆、油菜秸秆、棉花秸秆、加拿大一枝黄花秸秆、假高粱秸秆、园林枯木采用干燥粉碎颗粒。

农业废弃物优选干燥粉碎后的玉米秸秆、油菜秸秆、棉花秸秆或加拿大一枝黄花秸秆；麸皮占固体基质总重的30%。

农业废弃物还可选用稻壳，麸皮占固体基质总重量的40%-60%，优选50%-60%。其中水与固体基质的重量比为25-40:100，优选30:100。

本发明还提供了上述齐整小核菌固体发酵培养基在生产生物除草剂方面的应用，该生物除草剂采用齐整小核菌菌株SC64以液体-固体联合发酵方式进行大批量生产，其中固体发酵采用上述齐整小核菌固体发酵培养基。

制备得到的生物除草剂为含有菌丝体的固体培养基，用于田间除草时，菌体基质在土壤含水量25%、pH值为5、25℃条件下具有最大的萌发生长半径，最适宜土内最大菌丝生长半径为土壤含水量20%、pH值为7、30℃条件下。对杂草的处理剂量为60-120g/m²。存储时常温保存，最佳保存的初始湿度为40%。

本发明相比现有技术具有以下优点：利用农业废弃物和麸皮复配作为固体基质制备固体发酵培养基，既能有效培养含有齐整小核菌菌丝体生物除草剂，又能废物利用，减少污染，降低成本。采用复配方式得到的农作物下脚料和麸皮的混合物，在进一步降低成本的同时，达到了最佳发酵效果。本发明制备的齐整小核菌固体发酵培养基能产生较大密度的菌丝、草酸含量和较高的离体叶片的致病性。利用本发明固体发酵培养基制备的含菌丝体的生物除草剂能不仅有效用于双子叶杂草的清除，还对单子叶杂草马唐幼苗具有致病性。本发明制备的齐整小核菌固体发酵培养基成本低、制备工艺简单，且采用该固体发酵培养基制备得到的除草剂可在常温下保存。

附图说明

图1为生物除草剂的生产流程图；

图2为不同土壤环境对生物除草剂菌丝体萌发影响；

图3为储藏温度对生物除草剂的活力和致病力的影响；

图4为储藏初始湿度对生物除草剂的活力和致病力的影响；

图2至图4中的误差线为标准误。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

固体基质准备：取农田或荒地收货的玉米秸秆、水稻秸秆、油菜秸秆、棉花秸秆、大豆秸秆、加拿大一枝黄花秸秆、假高粱秸秆，于田埂经自然晒干后，经秸秆粉碎机进行粉碎后备用。园林枯枝粉碎后备用。麸皮、棉籽壳、稻壳、有机肥、麦稃基质、醋糟、酒糟、锯木屑晾晒后直接使用。

对比实施例1（单体基质实施例）

固体发酵培养基制备：

分别取上述各固体基质，用纱布包好浸渍于去离子水中24h，试验时取出滤去多余水分，每300g培养基装入塑料袋系好，常规高压灭菌60min后冷却即得所需固体发酵培养基。

生物除草剂制备：

如图1所示，采用液体-固体联合发酵的大批量生产方式，即先以液体发酵培养菌丝体，后在固体基质或培养基上固定发酵培养，生产含菌丝体固体基质，基质在晾干过程中可能会产生菌核。其中，液体培养基为马铃薯液体培养基（200g新鲜去皮土豆丁煮汁，蔗糖20g，加蒸馏水至1L），配置好后将其pH值调至5.0，每1L三角瓶装600ml培养基，常规高压蒸汽灭菌25min，接种活化的齐整小核菌菌株SC64菌饼10枚，30℃下，110rpm培养5d，接种前充分混匀。固体培养基分别采用上述制备的固体发酵培养基，每袋培养基接入新鲜培养的液体菌种30mL，充分混匀，置于培养架上25～30℃培养待菌丝体长满基质，即得到含菌丝体的生物除草剂。

对比发酵效果实施例1（单体基质实施例）

将对比实施例1中制备得到的含菌丝体的不同固体培养基进行检测。其中草酸含量检测参照（Починок，1981）的方法进行，致病力检测以30℃条件下，直径为5mm的除草剂颗粒在熟龄紫茎泽兰叶片（从顶部往下5～6片真叶）中央培养72小时后所引起的坏死病斑面积为指标。即将新鲜培养的含菌丝体固体基质置于预先铺有湿润双层滤纸的9cm培养皿中的紫茎泽兰叶片中央，每平皿2片叶子，Parafilm(American National Can,Greenwich,CT,USA)进行密封，将培养皿置于30℃，12h L/D的光照培养箱。每试验处理均4次重复，设置灭菌的固体基质为空白对照。结果如表1所示。

表1含有菌丝体的不同固体基质对齐整小核菌菌株SC64发酵草酸产量及致病力的影响

注：上表中数据为菌丝体布满培养基时测得；

菌丝体密度采用目测分级（+++基质中菌丝体密度较高，++菌丝密度中等，+菌丝体稀疏）；

草酸含量一列中相同小写字母者表示未达5%显著水平（以下表格同）。

从上表可以看出，齐整小核菌菌株SC64在麸皮培养基中培养，菌株长势旺盛，菌丝体洁白致密，草酸积累量达到6.06，显著高于其他培养基，其在离体紫茎泽兰叶片上所引起的坏死面积（2.78cm²）也显著高于其他培养基。菌株SC64虽然在稻壳培养基上有较高的单位基质草酸积累量，但菌丝体密度和致病力远低于麸皮培养基，可能是由于稻壳密度较小所致。在增加每袋培养基质量的发酵试验中，我们发现菌株SC64在麸皮培养基中的渗透能力较低，主要是由于麸皮质地太黏，透气性不够好。其他固体培养基虽然发酵效果略差于麸皮培养基，但成本较低。

实施例2（麸皮和农业废弃物复配实施例）

固体发酵培养基制备：

分别取不同的农业废弃物和麸皮以重量比70:30复配作为固体基质，充分混匀后，按照对比实施例1中的方法进行制备。

生物除草剂制备：

取制备的各农业废弃物-麸皮混合培养基按照对比实施例1中的方法进行接种培养，即得含菌丝体的各农业废弃物-麸皮培养基除草剂。

发酵效果实施2（麸皮和农业废弃物复配实施例）

按照对比发酵效果实施例1中的方法，对实施例2中制备的各含菌丝体麸皮-农业废弃物培养基除草剂进行检测。检测结果如下表2所示。

表2含有菌丝体的不同农业废弃物-麸皮培养基除草剂对齐整小核菌菌株SC64发酵草酸产量及致病力的影响

从上表可以看出，将30%N丰富的麸皮加入后，发酵效果（菌丝体密度、草酸含量、离体叶片致病力）均高于单独使用上述农业废弃物单独作为固体培养基的效果，且高于两者发酵效果的单纯相加，能起到复配增效的作用。其中以麸皮-玉米秸秆、麸皮-棉花秸秆培养基的发酵效果最佳，不仅高于农业废弃物作为培养基的发酵效果，还高于麸皮单独作为培养基的发酵效果，复配增效效果。基质复配对发酵效率的提升可能的原因，一方面是混合基质营养更加均衡，另一方面是混合基质改善了麸皮的透气性，更有利于菌丝的扩展。

实施例3（麸皮-稻壳复配实施例）

固体发酵培养基制备：

分别取不同比例的麸皮和稻壳复配作为固体基质，充分混匀后，按照对比实施例1中的方法进行制备。

生物除草剂制备：

取制备的各麸皮-稻壳混合培养基按照对比实施例1中的方法进行接种培养，即得含菌丝体的各麸皮-稻壳除草剂。

发酵效果实施3（麸皮-稻壳复配实施例）

按照对比发酵效果实施例1中的方法，对实施例3中制备的各含菌丝体麸皮-稻壳培养基进行检测。检测结果如下表3所示。

表3麸皮与稻壳混合基质对齐整小核菌菌株SC64发酵草酸产量及致病力的影响

从上表可以看出，麸皮的加入量在50%-60%之间，采用麸皮与稻壳复配得到的固体培养基发酵效果（菌丝体密度、草酸含量、离体叶片致病力）均高于单独使用麸皮作为固体培养基的效果。麸皮加入量低于50%时，虽然发酵效果低于麸皮作为固体培养基的效果，但显著高于单独使用稻壳作为固体培养基的效果，且由于稻壳价格低，故能相对降低生物除草剂的制备成本。且当麸皮按照60%质量百分比加入稻壳基质时草酸含量和离体叶片致病力可分别达7.03mg/g和3.07cm²，显著高于麸皮或稻壳单独使用的结果。

实施例4（麸皮-稻壳复配含水量实施例）

固体发酵培养基制备：

麸皮按照固体基质重量的50%添加到稻壳中，调整基质湿度，共设20%、25%、30%、35%、40%五个处理；制备不同含水量的固体发酵培养基。

生物除草剂制备：

取制备的各不同含水量培养基按照对比实施例1中的方法进行接种培养，即得含菌丝体的除草剂。

发酵效果实施例4（麸皮-稻壳复配含水量实施例）

按照对比发酵效果实施例1中的方法，对实施例4中制备的各不同含水量培养基进行检测。检测结果如下表4所示。

表4麸皮-稻壳培养基初始含水量对齐整小核菌菌株SC64发酵草酸产量及致病力的影响

从上表可以看出麸皮-稻壳复合培养基初始含水量在30%时发酵效果最好，草酸积累（7.03mg/g）和对离体紫茎泽兰叶片致病力（3.07cm²）均显著高于其他含水量。初始含水量过低和过高均对发酵不利，菌丝通常难以长满基质，含水量过高还容易发生厌氧反应，影响发酵进程和质量。

除草剂效果实施例1（生物除草剂在田间菌丝萌发效果）

取实施例2中制备的以麸皮-棉花秸秆为培养基的含菌丝体除草剂，采用平皿和试管土壤法，分别检测菌核和5mm的基质在土表的菌丝最大萌发生长距离。土壤采自菜园土（pH值约为7），经去杂质后105℃烘约12h至恒重后过2mm筛。试验时将土壤分别装在9cm培养皿，土层厚度5mm，和试管（180×18mm），土层高度12cm，按照Yang et.Al.（2004）的方法，设置不同土壤环境。经常规高压蒸汽灭菌（121℃,23min）后，接种新鲜培养的含菌丝体麸皮-棉花秸秆基质和菌核，72h后检测最大土表和土内菌丝生长距离。结果如下表5所示。

表5土壤含水量、pH值和温度环境对新鲜制备的齐整小核菌菌株SC64菌体基质萌发菌丝生长的影响

从上表可以看出，以麸皮-棉花秸秆为原料新鲜培养的除草剂颗粒在不同土壤环境中的萌发生长情况存在明显差异。菌体基质在土壤含水量25%、pH值为5、25℃条件下具有最大的萌发生长半径。最适宜土内最大菌丝生长半径为土壤含水量20%、pH值为7、30℃条件下，但土壤含水量和pH值对土内最大菌丝生长半径影响差异不显著。萌发菌丝在土表和土内的生长情况较为类似。

如图2所示不同土壤环境对生物除草剂菌丝体萌发影响，酸性土壤环境对菌核萌发有刺激作用。自然采集的土壤为中性土壤，在此条件下，菌核的萌发率不高，土壤含水量15%和25℃菌核萌发率最高，但在60%以下。这也与自然环境下一般齐整小核菌以零星菌核萌发致病的现象一致。

除草剂效果实施例2（生物除草剂除草试验）

取实施例3中制备的以稻壳-麸皮为培养基的含菌丝体除草剂进行除草试验，试验于6月～9月在南京农业大学牌楼温室进行（32°2’N118°50’E）。试验时用内径14cm的塑料花盆盛土（去杂质的菜园土与营养土混匀，4:1，v/v），直接播种实验室保存的杂草种子，处理时对每盆钵间苗，最终得到每盆含30株长势均匀的苗进行实验。实验期间通过将盆钵置于大型盛水的浅盆内以保持土壤的湿润。共测试鳢肠、陌上菜（5～7叶期）、豚草（5～7叶期）、异型莎草（4～6叶期）、马唐（2～3叶期）、加拿大一枝黄花（10～14叶期）的苗期防除试验，以及马唐和反枝苋的土壤处理（将含菌丝体固体基质及杂草种子混合后播种于花盆，表面覆薄层土）试验。接种原料为实施例3中制备的稻壳与麸皮（1:1，w/w）混合基质培养的含菌丝体固体基质，设计60、80、100、120g·m^-2四个剂量，反枝苋增加140g·m^-2共五个剂量，7d后统计杂草的株防效和鲜重防效。结果如下表6、7、8所示。

表6齐整小核菌菌株SC64含菌丝体除草剂对不同杂草的温室防除效果

a MR表示植株死亡率（%），FW表示鲜重抑制率（%），表中数据为平均值±标准误。同行相同小写字母

者表示未达5%显著水平，（下同）。

表7齐整小核菌菌株SC64含菌丝体除草剂对反枝苋的苗前及苗后温室防除效果

表8齐整小核菌菌株SC64含菌丝体除草剂对马唐的温室防除效果

从上表6和7可以看出，在温室环境下，与对照相比4个处理剂量均对杂草有明显的防除和抑制(P＜0.05)。菌体基质施药24h即可在土壤表面观察到萌发的白色菌丝体，菌丝体在接触到杂草茎基部时便形成附着和聚集，随后可在杂草基部观察到表皮变为深黄色至褐色，呈水渍状，一些敏感和弱小杂草2d开始倒伏和萎蔫。菌株SC64对试验杂草的致病性随处理剂量的增大而增加，剂量60g·m^-2时5种双子叶杂草7DAI的株防效为30.0～51.3%，鲜重防效42.4-70.8%，当剂量加倍后，鲜重防效和株防效增加到70.5-87.7%和78.7-91.6%。对反枝苋苗前和苗后处理的最大株防效和鲜重防效分别为84.4%、76.3%和47.0%、58.5%。

土壤处理和2叶期处理结果显示，菌株SC64还对单子叶杂草马唐表现出一定的致病性（表8）。土壤处理时可以观察到菌体基质在土壤中萌出白色菌丝体，并可蔓延至土表，萌出的马唐幼苗茎胚轴周围布满菌丝；苗期处理也可观察到菌丝体在胚轴表面的附着。受害的马唐幼苗主要表现为基部胚轴变黄化至褐色，呈半透明状，和正常植物相比明显软化，继而胚轴基部和叶片萎蔫，植株猝倒。对马唐幼苗土壤期处理结果显示齐整小核菌具有一定抑制马唐萌发的能力。在使用剂量120g/m²时对马唐株防效和鲜重防效分别达到最大41.6%和45.2%。对马唐幼苗1～2期处理结果显示齐整小核菌具有一定侵染致病能力。在使用剂量100g/m²时对马唐幼苗株防效和鲜重防效分别达到21.4%和29.4%最大。菌株SC64对2叶期后的马唐基本无致病力，推测可能的原因是马唐幼苗受到了齐整小核菌所分泌的草酸的毒害，而并非像双子叶杂草那样是由于菌丝体的侵入而导致发病。

除草剂储存实施例

以实施例2中新鲜培养的含菌丝体麸皮-棉花秸秆基质（含水量约45%）为原料，分别研究在不同温度及培养基初始含水量随储藏时间对菌株SC64的活力和致病力的影响。活力检测以5mm菌体基质在PDA培养基上48h的菌落直径为准，致病力以50mg菌体基质对20枚经Hogland营养液培养的鳢肠苗48h的致死率为准。试验均设置4次重复。

（1）温度试验。将新鲜培养的以麸皮-棉花秸秆为基质含菌丝体的除草剂通风橱晾干表面水分后，取3份（各500g）双层密封于塑料袋分别保存于-20，4和25℃环境。结果如图3所示。

（2）基质含水量试验。新鲜培养的以麸皮-棉花秸秆为基质含菌丝体的除草剂于通风橱风干不同时间，调节其含水量至40%、30%、20%和10%，分别密封保藏于常温环境。每间隔15d检测其活力及致病力。结果如图4所示。

在90d的储藏检测中，以麸皮-棉花秸秆为基质的含菌丝体的除草剂活力和致病力都出现了明显的下降。如图3所示，-20℃条件下储存的菌体基质几乎失去了活性剂致病力，但常温25℃条件下储藏的菌体基质依然可以在PDA培养基上形成59.06mm的菌落及引起68.3%的鳢肠萌发种子死亡，说明齐整小核菌菌株SC64不耐低温储藏，简单的常温放置即可。

如图4所示，将含菌丝体麸皮-棉花秸秆基质调节成不同湿度进行储藏，最佳初始湿度为40%，在此条件下常温储藏90d后依然可以在PDA培养基上形成57.81mm的菌落和引起75.0%的鳢肠萌发种子死亡。但随时间的延长各处理的活力和致病力呈下降趋势。较低初始含水量（20%和10%）的含菌丝体麸皮-棉花秸秆基质下降最为迅速，75d左右即丧失了活力和致病力。

综上，本发明制备的齐整小核菌固体发酵培养基中，效果较理想的为麸皮和各类农作物秸秆复配的培养基，能产生较大密度的菌丝、草酸积累和离体叶片的致病性，达到接近麸皮培养基的效果，从而降低成本。且通过温室的杂草防除试验也证实了混合基质培养的齐整小核菌菌株SC64可以有效的控制杂草，获得明显的株防效和鲜重防效。且本发明制备的齐整小核菌固体发酵培养基易于保藏，菌体只需要在室温下，初始含水量40%即可保持活力和致病力90d以上。

Claims (3)

1.齐整小核菌固体发酵培养基在生产生物除草剂方面的应用，其特征在于：所述生物除草剂采用齐整小核菌菌株SC64以液体固体联合发酵方式进行大批量生产；固体发酵采用所述齐整小核菌固体发酵培养基，所述齐整小核菌固体发酵培养基由固体基质和水组成；所述固体基质由麸皮和农业废弃物组成，所述麸皮的重量占固体基质总重的30%，所述农业废弃物选用水稻秸秆、玉米秸秆、油菜秸秆、棉花秸秆或加拿大一枝黄花秸秆。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述齐整小核菌固体发酵培养基的制备是分别取各固体基质，用纱布包好浸渍于去离子水中24h，试验时取出滤去多余水分，每300g培养基装入塑料袋系好，常规高压灭菌60min后冷却即得所需齐整小核菌固体发酵培养基。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：水稻秸秆、玉米秸秆、油菜秸秆、棉花秸秆或加拿大一枝黄花秸秆采用干燥粉碎颗粒。