CN103145932A - 一种长循环抗肿瘤靶向药物载体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗肿瘤靶向药物载体及其制备方法。该载体是由PEG、HPMA及MAGG共聚而成的高分子。采用可逆加成断裂转移(RAFT)聚合方法，得到共聚组分及分子量可控，分子量分布窄(分子量分布d＜1.4)的共聚物，其通式为：PEG-b-P(HPMA-co-MAGG)。通过对聚合物中PEG链段长度，HPMA和MAGG的组成比以及聚合物的分子量等因素的调节，得到了一种体内循环时间显著增加的靶向抗肿瘤药物载体。此类聚合物可以应用于抗肿瘤药物的靶向运输，不仅具有高的靶向性和良好的生物相容性，还具有防止蛋白非特异性吸附的功能和延长的体内循环时间，是一种性能优良的抗肿瘤靶向药物载体。

Description

一种长循环抗肿瘤靶向药物载体及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种长循环抗肿瘤靶向药物载体及其制备方法。

背景技术

肿瘤一直是威胁人类健康的重大疾病，目前对于肿瘤的治疗，主要有手术、化疗和放疗三大类治疗方法。但是各种治疗手段都存在死亡率高，治愈率低和愈后不佳等情况。化疗和放疗虽然在肿瘤的治疗中具有显著的疗效，但是也存在很多问题。对于化疗来说，由于化疗药物本身缺乏靶向性，很难有效的到达病灶部位，而且在杀死肿瘤细胞的同时，也会非选择性的杀死正常细胞，因而存在治疗效率低下，毒副作用大等问题，严重影响癌症的治疗效果。对于放疗而言，由于放射线本身的穿透力有限，往往只能用来治疗浅表性的肿瘤，而对于深层组织的肿瘤无能为力。因此，研究具有明确结构和功能的分子并将其作为化疗药物和放射性核素载体已经成为研究人员广泛关注的热点问题。

目前常用的药物载体主要有水溶性高分子、胶束、囊泡等。水溶性高分子聚N-(2’-羟基)丙基甲基丙烯酰胺(PHPMA)作为靶向药物载体具有明显的优点：它是一种水溶性聚合物；具有非常好的生物相容性，不会与人体发生免疫反应；大分子量的PHPMA具有EPR(增强的渗透和滞留)效应，有利于其在肿瘤部位的聚集。但是PHPMA载体也有明显的不足：它功能单一，不具有防止蛋白非特异性吸附的功能，导致药物在血液循环过程中会在非病灶部位吸附和富积，造成药物载体在体内的循环时间不足，影响药物的治疗效果；此外，由于目前PHPMA载体的制备普遍采用普通自由基聚合，分子量不可控，分子量分布很宽，严重影响载体的EPR效应以及药物从载体上的释放，从而进一步影响到药物的治疗效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗肿瘤药物靶向聚合物载体及其制备方法。

本发明所提供的聚合物载体，是由聚乙二醇(PEG)与下述1)或2)中的单体共聚形成的：1)甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酸(MAGG)；2)N-(2’-羟基)丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)和甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酸，该聚合物可简称为PEG-b-P(HPMA-co-MAGG)。

所述聚合物的结构式如式Ⅰ所示：

该聚合物为嵌段共聚物，而在HPMA和MAGG链段间为无规共聚物。

式Ⅰ中的R代表不易水解的基团，具体可选自下述基团中的任意一种：甲基、乙基和氨基，优选甲基，该基团由不同端基的PEG带入聚合物链中；Z代表一种一端以酯基或酰胺基与PEG部分相连，另一端与P(HPMA-co-MAGG)部分相连的链段，具体可选自下述任意一种链段：-C(CN)(CH₃)-CH₂CH₂-CO-，-CH₂CH₂-CO-和-C(CH₃)(CH₃)-CO-，优选-C(CN)(CH₃)-CH₂CH₂-CO-，Z链段为链转移试剂与PEO连接的部分，聚合之后，二硫代酯或者三硫代酯转移到聚合物链末端上，此部分仍与PEO相连；Y代表一种具有可逆加成断裂转移(RAFT)聚合活性的基团，该基团可以是含有一个或一个以上二硫代酯基(Dithioester)的基团、三硫代碳酸盐(Trithiocarbonate)、磺酸盐(Xanthate)或二硫代氨基甲酸盐(Dithiocarbamate)的各种基团，优选含有一个或一个以上二硫代酯基的基团，其由链转移试剂带入聚合物链中；R`代表羟基。

本发明的共聚物的数均分子量为2000～100000；分子量分布指数d＜1.4。其中，PEG部分的分子量为1000-10000，优选2000-5000；HPMA部分占HPMA-co-MAGG嵌段的摩尔含量为0-90％，优选65-90％；MAGG部分的摩尔含量为10-100％，优选10-35％。

上述聚合物可作为抗肿瘤药物靶向药物载体或作为放射性核素载体的应用。

由于式Ⅰ聚合物中的PMAGG含有大量羧基，因此可以同时键合几种不同的功能分子，例如环状RGD，叶酸，酪氨酸等，也可以转化为氨基，使聚合物带有不同的电荷，同时也能键和一些其他功能分子，例如异硫氰酸酯荧光素(FITC)。

本发明提供的聚合物载体的制备方法，包括下述步骤：

1)在N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)的催化作用下，使末端基团为羟基或氨基的PEG与含羧基的可逆加成断裂链转移试剂进行反应，得到PEG大分子链转移剂；

2)在氩气或氮气气氛下的水相介质中，以4，4’-偶氮二(4-腈基戊酸)(V501)为引发剂，使PEG大分子链转移剂与下述1)或2)中的单体进行活性自由基聚合反应(RAFT聚合)，得到所述聚合物；其中，1)为MAGG或2)MAGG和HPMA。

其中，步骤1)中所述末端基团为羟基或氨基的PEG优选一末端基团为羟基或氨基、另一末端基团为不易水解的基团的PEG；所述PEG的数均分子量为1000～10000；所述含羧基的可逆加成断裂链转移试剂为至少含一个羧基和一个二硫代苯甲酸酯基的化合物，优选4-二硫代苯甲酸酯基-4-腈基戊酸(CPAD)及其衍生物。

步骤1)中所述反应的反应温度为室温，反应时间为48-96小时；所述反应在溶剂中进行，所述溶剂可为甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷或四氢呋喃；所述末端基团为羟基或氨基的PEG与含羧基的可逆加成断裂链转移试剂的摩尔比为1∶(3-5)。

步骤2)中所述水相介质为纯水或水相缓冲溶液；所述水相缓冲溶液包括醋酸-醋酸盐缓冲体系或磷酸-磷酸盐缓冲体系；步骤2)中所述PEG大分子链转移剂与所述1)或2)中的单体的摩尔比可为1∶(10-400)；

步骤2)中所述聚合反应的反应温度为50-70℃，反应时间为24-72小时。

将上述方法制备的聚合物与酪氨酸反应，可得到含酪氨酸的聚合物。该反应在溶剂中进行，所述溶剂优选质量浓度为10％的碳酸钠水溶液；上述反应所用的催化剂为N-(3-二甲氨基丙基)-N`-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；反应温度为0-10℃，反应时间为48-72小时。此时，制备的含酪氨酸的聚合物为式Ⅰ中R`由羟基替换为3-(4`-羟基苯基)丙酸-2-亚氨基的聚合物。

该含酪氨酸的聚合物可作为放射性核素载体应用；所述放射性核素具体如放射性核素碘125。

以Iodogen为氧化剂，使所述含酪氨酸的聚合物与放射性核素碘125的钠盐Na¹²⁵I在磷酸-磷酸盐缓冲溶液中反应，产物通过PD MiniTrap色谱柱(GE Healthcare，Buckingmashine，UK)纯化，纯化完成后收集产物，用生理盐水稀释成动物实验所需浓度待用。通过上述步骤，即可得到放射性核素碘125标记的聚合物载体，通过动物实验可以研究载体的体内循环行为。

本发明采用可逆加成断裂转移(RAFT)聚合方法，通过对聚合物中各组分的组成比以及聚合物的分子量等因素的调节，得到了一种体内循环时间显著增加的靶向抗肿瘤药物载体。所得到的聚合物载体组成可调、分子量可控，分子量分布窄(d＜1.4)，并且具有防止蛋白非特异性吸附的功能，通过调节MAGG的含量可以调节聚合物在动物体内血液循环时间。

本发明共聚物的数均分子量可以在2,000至100,000的范围内精确调控，其中PEG组分的分子量在1,000～10,000之间，PHPMA及PMAGG的组分的分子量在1,000～100,000之间。数均分子量可以用水相凝胶渗透色谱(GPC)和¹H核磁共振光谱(¹HNMR)来测量。本发明共聚物的组分可以通过改变各组分在加料时的摩尔比来精确调控。共聚物的摩尔组成可以通过¹H核磁共振光谱(¹HNMR)来定量确定。

根据应用的要求，用上述方法制备的共聚物既可以携带化疗药物作为治疗肿瘤化疗药物载体，也可以结合核素作为放疗药物载体。所制备的共聚物载体通过结合多肽、抗体等具有靶向作用的生物活性分子，或者依赖PHPMA及其衍生物本身的EPR效应(增强渗透滞留效应)，来实现抗肿瘤药物的靶向释放。

附图说明

图1是本发明提供的聚合物载体PEG-b-P(HPMA-co-MAGG)的结构式。

图2是本发明方法制备的PEG-b-P(HPMA-co-MAGG)的GPC曲线。

图3是本发明制备的含有酪氨酸的PEG-b-P(HPMA-co-MAGG)的¹H NMR谱图。

图4是本发明制备的PEG-b-PMAGG的瞬时薄层色谱(ITLC)曲线。

图5是本发明制备的PEG-b-PMAGG的体外稳定性曲线。

图6是本发明制备的PEG-b-PMAGG及PEG-b-P(HPMA-co-MAGG)的体内血液清除结果图。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、PEG_2k-b-PMAGG_8k的制备

将数均分子量为2000的羟基和甲基封端的PEG 2.4g溶于40mL甲苯，加入4-二硫代苯甲酸酯基-4-腈基戊酸(CPAD)0.68g，DMAP 0.041g，待完全溶解后加入DCC0.74g，室温搅拌下反应90小时。抽滤，将滤液倾入过量乙醚中，抽滤，所得沉淀溶于少量甲苯，再用乙醚沉淀，如此重复三次。将沉淀物在40℃真空干燥24小时，所得产物即为PEG的大分子链转移剂。

取此链转移剂0.13g，MAGG 0.46g，4，4’-偶氮二(4-腈基戊酸)5mg，纯水5mL，于真空反应管内，在冷冻下抽真空，然后恢复至室温，充入氩气，将此冷冻-溶化-充氩气过程重复三次，最后在氩气保护下将反应管置于70℃油浴中反应。终止反应时将反应管迅速放入液氮中，然后通过透析除去其中的小分子，最后蒸干溶剂得到所要的产物。该产物的分子量和组成可以通过水相GPC和¹HNMR来共同确认。

根据不同的反应时间和MAGG与PEG的摩尔比可以得到分子量和嵌段长度不同的产物。如反应时间为24小时，得到共聚物数均分子量为10000，分子量分布为1.06，PMAGG部分的分子量为8000。结果如图2所示。

在合成PEG_2k-b-PMAGG_20k、PEG_2k-b-PMAGG_40k、PEG_2k-b-PMAGG_60k、PEG_2k-b-PMAGG_80k时，MAGG与PEG的摩尔比分别为100∶1、200∶1、300∶1和400∶1；反应时间分别为24、48、48和72小时。

实施例2、PEG_2k-b-(PHPMA_20k-co-PMAGG_15k)的制备

该嵌段共聚物的制备方法与实施例1基本相同，只是将原来所用的MAGG改为HPMA和MAGG的混合物进行投料，投料量分别为HPMA 1.16g，MAGG 0.87g。终止反应时将反应管迅速放入液氮中，然后通过透析出去其中的小分子，最后蒸干溶剂得到所要的产物。该产物的分子量和组成可以通过水相GPC和¹HNMR来共同确认。

根据不同的反应时间可以得到组成和分子量不同的产物。如反应时间为48小时，得到共聚物数均分子量为37000，分子量分布为1.09，PMAGG部分的分子量为15000，PHPMA部分的分子量为20000。结果如图2所示。

实施例3、含氨基酸的聚合物PEG_2k-b-PMAGG_20k的制备

将2.2g聚合物PEG_2k-b-PMAGG_20k与0.072g酪氨酸在10ml质量浓度为10％碳酸钠水溶液中，以0.191g EDC和0.115g(NHS)作为催化剂，4℃反应过夜，再在纯水中透析4×6h，冷冻干燥后即得含有酪氨酸的聚合物PEG_2k-b-PMAGG_20k。其¹H NMR谱图见图3。

实施例4、含有放射性核素¹²⁵I的聚合物¹²⁵I-PEG_2k-b-PMAGG_20k的制备

100μg含有酪氨酸聚合物PEG_2k-b-PMAGG_20k和含有37MBq Na¹²⁵I的0.2M的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)分别加入涂覆有20μg Iodogen的小瓶中。在室温下反应10分钟后，反应混合物以PBS为洗脱液在PD MiniTrap中分离纯化。收集含有放射性¹²⁵I-PEG_2k-PMAGG_20k组分并通过0.2微米的注射器过滤器进行进一步的体内实验。采用Gelman Sciences硅胶纸条并以丙酮作为洗脱液通过瞬时薄层色谱(ITLC)法进行质量控制。通过这种方法，自由的¹²⁵I迁移到溶剂前沿，而¹²⁵I标记的聚合物则留在原点。结果如图4所示。

实施例5、含有¹²⁵I的聚合物¹²⁵I-PEG_2k-b-PMAGG_20k的体外稳定性

¹²⁵I-PEG_2k-b-PMAGG_20k的体外稳定性实验在生理盐水中测定，将¹²⁵I-PEG_2k-b-PMAGG_20k配制成终浓度为2mCi/ml的生理盐水溶液。分别在2，8，12和24h取样，通过PD MiniTrap色谱柱对样品进行纯化，利用ITLC对纯化后的样品进行分析，检测放射强度的变化情况，从而确定聚合物核素示踪剂体外稳定性，结果如图5所示。

实施例6、含有¹²⁵I的聚合物¹²⁵I-PEG_2k-b-PMAGG_20k的体内血液清除实验

在此实施例中，七只BALB/c正常小鼠作为一组进行药物血液清除实验。放射性¹²⁵I标记聚合物¹²⁵I-PEG_2k-b-PMAGG_20k(含10μCi示踪剂的0.1mL生理盐溶液)通过尾静脉注射给每只小鼠。每只小鼠按45.0毫克/公斤的剂量腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，分别在1，3，5，7，10，15，20，30，60，90和120min的时间点颈椎错位处死。收集所有血液，称重之后利用γ-计数器(1470-002 Wallac，Perkin-Elmer，芬兰)进行放射性测量。血药残留量按占每克血液湿重注射剂量的百分比计算(％ID/g)。通过分子量和组成的调节，可以调节聚合物在体内的循环时间，如含有HPMA的聚合物的血液循环时间明显增加，¹²⁵I-PEG_5k-b-P(HPMA_30k-co-MAGG_5k)的血液循环半衰期明显延长为150分钟，结果如图6所示。

Claims (13)

1.一种聚合物，是由聚乙二醇与下述1)或2)中的单体共聚形成的：1)甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酸；2)N-(2’-羟基)丙基甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酸；所述聚乙二醇英文缩写为PEG，所述N-(2’-羟基)丙基甲基丙烯酰胺英文缩写为HPMA，所述甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酸英文缩写为MAGG。

2.根据权利要求1所述的聚合物，其特征在于：所述聚合物的结构式如式Ⅰ所示：

其中，式Ⅰ中的R代表不易水解的基团；Z代表一种一端以酯基或酰胺基与PEG部分相连，另一端与P(HPMA-co-MAGG)相连的链段；Y代表一种具有可逆加成断裂转移(RAFT)聚合活性的基团；R`代表羟基；

式Ⅰ中PEG部分的分子量为1000-10000；PHPMA-co-PMAGG中HPMA部分的摩尔含量为0-90％，具体为65-90％；MAGG部分的摩尔含量为10-100％，具体为10-35％。

3.根据权利要求2所述的聚合物，其特征在于：式Ⅰ中的R选自下述基团中的任意一种：甲基、乙基和叔丁基，优选甲基；所述Z选自下述任意一种链段：-C(CN)(CH₃)-CH₂CH₂-CO-，-CH₂CH₂-CO-，-C(CH₃)(CH₃)-CO-，具体为-C(CN)(CH₃)-CH₂CH₂-CO-；所述Y选自下述基团中的任意一种：含有至少一个二硫代酯基的基团、三硫代碳酸盐、磺酸盐和二硫代氨基甲酸盐，具体为二硫代酯。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的聚合物，其特征在于：所述聚合物的数均分子量为2000～100000；分子量分布指数d＜1.4。

5.根据权利要求2-4中任一项所述的聚合物，其特征在于：所述聚合物为式Ⅰ中R`由羟基替换为3-(4`-羟基苯基)丙酸-2-亚氨基的含酪氨酸的聚合物。

6.制备权利要求1-4中任一项所述聚合物的方法，包括下述步骤：

1)在N，N’-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的催化作用下，使末端基团为羟基或氨基的PEG与含羧基的可逆加成断裂链转移试剂进行反应，得到PEG大分子链转移剂；

2)在氩气或氮气气氛下的水相介质中，以4，4’-偶氮二(4-腈基戊酸)为引发剂，使PEG大分子链转移剂与下述1)或2)中的单体进行聚合物反应，得到所述聚合物；其中，1)为MAGG或2)MAGG和HPMA。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述末端基团为羟基或氨基的PEG为一末端基团为羟基或氨基、另一末端基团为不易水解的基团的PEG；所述不易水解的基团具体选自下述基团中的任意一种：甲基、乙基和叔丁基；

所述末端基团为羟基或氨基的PEG的数均分子量为1000～10000；所述含羧基的可逆加成断裂链转移试剂为至少含一个羧基和一个二硫代苯甲酸酯基的化合物，优选4-二硫代苯甲酸酯基-4-腈基戊酸及其衍生物；

步骤1)中所述反应的反应温度为室温，反应时间为48-96小时；所述反应在溶剂中进行，所述溶剂为甲苯、二氯甲烷或三氯甲烷；所述末端基团为羟基或氨基的PEG与含羧基的可逆加成断裂链转移试剂的摩尔比为1∶(3-5)；

步骤2)中所述水相介质为纯水或水相缓冲溶液；所述水相缓冲溶液包括醋酸-醋酸盐缓冲体系或磷酸-磷酸盐缓冲体系；步骤2)中所述PEG大分子链转移剂与所述1)或2)中的单体的摩尔比为1∶(10-400)；

步骤2)中所述聚合反应的反应温度为50-70℃，反应时间为24-72小时。

8.制备权利要求5所述含酪氨酸的聚合物的方法，包括下述步骤：将权利要求1-4中任一项所述聚合物与酪氨酸反应，得到所述含酪氨酸的聚合物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述反应在溶剂中进行，所述溶剂优选质量浓度为10％的碳酸钠水溶液；所述反应在催化剂作用下进行，所述催化剂为N-(3-二甲氨基丙基)-N`-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺；所述反应的反应温度为4-10℃，反应时间为48-72小时。

10.权利要求1-4中任一项所述聚合物作为抗肿瘤药物靶向药物载体的应用或作为放射性核素载体的应用。

11.一种抗肿瘤靶向药物，是由权利要求1-4中任一项所述聚合物与抗肿瘤功能分子反应得到的；所述抗肿瘤功能分子优选环状RGD、抗体、叶酸或阿霉素。

12.权利要求5所述含酪氨酸的聚合物作为放射性核素载体的应用；所述放射性核素优选放射性核素碘125。

13.一种含放射性核素碘125的聚合物，是按照下述方法制备得到的：以Iodogen为氧化剂，使权利要求5所述含酪氨酸的聚合物与放射性核素碘125的钠盐Na¹²⁵I在磷酸-磷酸盐缓冲溶液中反应，得到含放射性核素碘125的聚合物。

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